专利名称：生物催化合成d-芳基甘氨酸的酶制剂及其制备方法和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于微生物发酵领域，特别涉及一种生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制 剂及其制备方法和应用。
背景技术：
D-芳基氨基酸(如，D-芳基甘氨酸)是一类十分重要的非天然氨基酸，由于其构 型与天然氨基酸正好相反而可以用于药物(如，拮抗剂)、肽以及甜味剂等的合成和制备， 近年来随着对其应用价值的进一步开发，市场的需求量在迅猛增长。传统的D-芳基氨基酸(如，D-芳基甘氨酸)的制备方法，包括了化学合成及拆分 法，但是其需要浪费一半的对映异构体，造成生产效率低、产能低、能耗高等缺点。在生物催化D-芳基海因水解法中，传统的技术为“一菌两酶”法，如中国专利或专 利申请01105347、200710191968等所述的。但是，该技术中所使用的一种微生物本身要兼 顾两种酶，难以耐受高浓度的底物并在工业生产中保持连续的酶催化作用，因此难以加入 饱和浓度的底物而实现非均相酶催化。因此这些专利申请即使授权，也因不适合实际的工 业生产而放弃了专利权。中国专利申请200610048209. 0和200710062118. 7公开了一种非均相酶催化水解
5-芳基海因合成D-芳基甘氨酸或其衍生物的方法，以“两菌两酶”法来代替传统的“一菌两 酶”法，其中使用黄金节杆菌(Arthrobacter aurescens) LZ98或其突变菌UV-LZ98来产生 (Hydantoinase)方j(身寸M胃(Agrobacterium radiobacter) LZ99 ^^
突变菌UV-LZ99来产生氨甲酰胺水解酶，由此产生一定酶活性的酶制剂来使得相应合成方 法得以实现。然而，该方法中使用的制备酶制剂的两株菌株购买成本较高，尤其是LZ99以 及突变菌UV-LZ99不但昂贵，而且产生的氨甲酰胺水解酶在工业规模的长时间发酵时稳定 性不够，发酵耐久性不足，大大限制了该专利的非均相酶催化水解5-芳基海因来合成D-芳 基甘氨酸的工业化应用。
发明内容
本发明为克服现有技术中存在的问题，提供一种生物催化合成D-芳基甘氨酸的 酶制剂及其制备方法和应用，它能代替现有的用于非均相酶催化水解5-芳基海因制备 D-芳基甘氨酸的方法中的酶制剂，使生产成本大大降低，且方法简单、易于工业化应用。本发明采用以下技术方案予以实现本发明的第一个方面，生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，它由产海因酶的黄 金节杆菌的活化细胞和产氨甲酰水解酶的放射形土壤杆菌的活化细胞组成。所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，其特征是，所述黄金节杆菌产生的 海因酶的初始酶活性为大于0. 32U，所述放射形土壤杆菌产生的氨甲酰水解酶的初始的活 性大于IOU0
所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，所述黄金节杆菌的初始海因酶活 性为 0. 32U 0. 45U。所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，所述黄金节杆菌为黄金节杆菌 3256活化细胞，所述放射形土壤杆菌为放射形土壤杆菌3255活化细胞。本发明的第二个方面，所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂的制备方法， 它包括以下步骤a.将产海因酶的黄金节杆菌接种于含玉米浆、糖蜜、氢氧化钠水溶液、氯化钠、 2-硫尿嘧啶、硫酸镁、硫酸锰和磷酸氢二铵的液体培养基中，于30 34°C搅拌活化培养。其 中，搅拌速度为60rpm，活化时间为12 18h，优选14 16h ；空气压力为0. 18 0. 23Mpa， 优选为0. 2Mpa ；空气流量为20 26L/h ；反应釜压力为0. 04 0. 06Mpa，优选为0. 05Mpa ； 然后将该培养液用壳聚糖水溶液絮凝，过滤收获固形酶制剂1 ；所述液体培养基含玉米浆360 460重量份、糖蜜380 480重量份、浓度为25 35% (w/w)的氢氧化钠水溶液15 25重量份、氯化钠40 60重量份、2-硫尿嘧啶27 37重量份硫酸镁8 10重量份、硫酸锰1. 2 1. 8重量份和磷酸氢二铵3 4重量份，并 加水定容至8000重量份；b.将产氨甲酰水解酶的放射形土壤杆菌接种于含玉米浆、葡萄糖、蛋白胨、氯化 钠、硫酸锰、磷酸氢二铵和阿拉伯糖的液体培养基中，于32 38°C搅拌活化培养，其中搅 拌速度为60rpm ；活化时间为15 22h，优选16 18h，最优选为17h ；空气压力为0. 18 0. 23Mpa，优选为0. 2Mpa ；空气流量为18 22L/h ；反应釜压力为0. 04 0. 06Mpa，优选为 0. 05Mpa ；在所述培养基中添加氢氧化钠调节pH为6. 5 7. 8，优选为6. 8 7. 3，最优选为 7. 0，然后将该培养液用壳聚糖水溶液絮凝，过滤收获固形酶制剂2 ；所述液体培养基含玉米浆200 400重量份、葡萄糖180 260重量份、蛋白胨 80 100重量份、25g氯化钠20 30重量份、硫酸锰1. 6 2. 0重量份、磷酸氢二铵6. 8 7. 6重量份和阿拉伯糖12 16重量份；并将所述液体培养基加水定容至8000重量份；c.将步骤a制得的固形酶制剂1和步骤b制得的固形酶制剂2混合，制得生物催 化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂。其中所述固形酶制剂1和所述固形酶制剂2的重量配比随 底物的不同而有所不同，通常控制二者比例为1 5 1 50，优选的比例为1 5 1 20，更优选的比例为1 2 1 5。本发明的第三个方面，所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，它用于酶催 化非均相水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法中。所述的酶催化非均相水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法包括以下步骤①酶催化反应罐中，加入水和5-芳基海因，并调整pH值为6. 5 7. 8，芳基海因的 加入量占水和5-芳基海因总重量的5 21% (w/w)，得混合溶液；在步骤①中，由此配比的物料将形成悬浊液，即溶液呈过饱和状态，有5-芳基海 因的固体原料存在。②在搅拌的条件下向酶催化反应罐中加入权利要求1 5任一所述的生物催化合 成D-芳基甘氨酸的酶制剂，在25 40°C下搅拌反应，直至无法检测出5-芳基海因，得D-芳 基甘氨酸；其中所述生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂占步骤①中的混合溶液的总重量
5的1 10%，优选为为2-8% ；反应时间8 66小时；③通过200目筛分离出D-芳基甘氨酸固体，经过重结晶，获得D-芳基甘氨酸晶 体；在步骤③中，由于存在菌体和细小的固体产品结晶，因此优选通过200目筛分离， 所截留下来的固体是粒度较大的D-芳基甘氨酸晶体(粗产品)，菌体和碎小颗粒的固体产 物通过筛孔而进入到膜分离系统。④通过截留5000 5万分子量超滤膜过滤和蒸发浓缩来提取酶催化反应溶液中 溶解的D-芳基甘氨酸，再经过重结晶，得D-芳基甘氨酸晶体。由于分离出D-芳基甘氨酸晶体后所得的溶液是饱和的D-芳基甘氨酸，为了进一 步提高产率，因此采用了步骤④。即将步骤③能流过筛的液体通过膜过滤除去菌体，对滤液 浓缩得到D-芳基甘氨酸晶体，经过重结晶，获得D-芳基甘氨酸晶体。优选的，所述的非均相酶催化水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法步骤④还可以 采用以下步骤先通过超滤膜过滤筛分分离透过筛孔的部分，即得酶催化反应罐中溶解有D-芳 基甘氨酸的溶液，其膜透析液被蒸发浓缩得另一部分D-芳基甘氨酸粗产品，再经重结晶获 得D-芳基甘氨酸晶体。所述的非均相酶催化水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法中的D-芳基甘氨酸为 D-苯甘氨酸、D-对羟基苯甘氨酸、D-氟苯甘氨酸、D-氯苯甘氨酸、D-溴苯甘氨酸、D-碘苯 甘氨酸、D-甲氧苯甘氨酸、D-吡啶系列甘氨酸、D-萘系列甘氨酸、D-喹啉系列甘氨酸D-嘧 啶甘氨酸、D-吡嗪甘氨酸、D-哒嗪甘氨酸、D-吲哚甘氨酸、D-噻吩甘氨酸、D-呋喃甘氨酸、 D-吡咯甘氨酸、D-吡唑甘氨酸、D-咪唑甘氨酸、D-噻唑甘氨酸、D-噁唑甘氨酸和D-异噁唑 甘氨酸中的一种。进一步的，所述制备非均相酶催化水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法中的D-芳 基甘氨酸为D-苯甘氨酸；所述D-苯甘氨酸的制备方法为①在酶催化反应罐中，加入水30kg和5-苯基海因2. 8kg，并调整pH值为6. 8 ；②在搅拌的条件下向酶催化反应罐加入权利要求1-5之任一所述的生物催化合 成D-芳基甘氨酸的酶制剂2. 8kg，在38°C下搅拌反应，直至无法检测出5-苯基海因，并且 中间产物N-氨甲酰苯甘氨酸含量小于等于0. 25 % (w/w)，显示反应基本完成，制得D-苯基 甘氨酸；③分离析出D-苯基甘氨酸固体，经过重结晶，获得D-苯基甘氨酸晶体产品；④通过超滤膜过滤和蒸发浓缩来提取酶催化反应溶液中溶解的D-苯基甘氨酸， 得另一部分，即D-苯基甘氨酸产品。在所述生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂中，所述黄金节杆菌和放射形土壤 杆菌均为活菌，优选为活化培养的菌。因此，优选本发明第一方面提供的生物催化合成 D-芳基甘氨酸的酶制剂是由产海因酶的黄金节杆菌的活化细胞和产氨甲酰水解酶的放射 形土壤杆菌的活化细胞组成。在本发明中，“活化细胞”表示菌体细胞经过活化培养，使得细 胞具有相应的纯化形式的酶的酶活性，即海因酶活性和氨甲酰水解酶活性。因此，所述生物 催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂可以在工业化生产过程中保持长时间的酶活性。尽管所 述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂是不可溶的(包括菌体)，但是根据本发明人长
6期观察，配合使用本发明所述的非均相法制备的D-芳基甘氨酸的粗晶体颗粒比菌体及其 碎片大得多，因此可以容易地通过过筛分离的方法提取粗晶体颗粒，而不会引入过多菌体 杂质以影响纯度，也不会分离丧失掉粗晶体颗粒而导致产率下降。在本发明的第一方面中，黄金节杆菌的初始海因酶活性为大于0. 30U，放射形土壤 杆菌的初始氨甲酰水解酶为大于9U，优选初始海因酶活性为大于0. 32U，也优选初始氨甲 酰水解酶为大于10U，最佳选初始氨甲酰水解酶为9. 5U 15U，最佳选初始氨甲酰水解酶为 IOU 12U。由于在工业化生产过程中，酶的活性会逐渐降低。因此，本发明的第一方面中 的菌体本身需要有一定催化能力，而且该催化能力需要在工业化生产中定量可控的。这样， 本发明使用活化后投料前针对菌体测定的初始活性作为催化能力指标，其具体测量方法可 以根据本发明具体实施例中所列的方式进行。本发明人发现，由于改用了产氨甲酰水解酶 的放射形土壤杆菌，催化效率和稳定性得以提高，中间产物积累少，因此产海因酶的黄金节 杆菌无需太好，其初始海因酶活性可以优选为0. 32 0. 45U。这样，可以使用市售的较便宜 的黄金节杆菌，如黄金节杆菌3256。另外，由于产氨甲酰水解酶的放射形土壤杆菌筛选较容 易，因此可以不使用昂贵的LZ系列菌种，而使用较便宜的市售放射形土壤杆菌，如放射形 土壤杆菌3255。在本发明的具体实施方式
中，优选的酶制剂由放射形土壤杆菌3255和黄金 节杆菌3256组成，更优选的酶制剂由放射形土壤杆菌3255活化细胞和黄金节杆菌3256活 化细胞组成。为了进一步改进现有技术中的缺陷，我们经过艰苦实验，发现当使用适当活化培 养的菌株细胞直接配制本发明的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂的时候(即采用本 发明的“两菌”法)，其中即使采用了更为常规的氨甲酰水解酶(Carbamylase)代替现有“两 菌两酶”法中的氨甲酰胺水解酶，也能够满足非均相酶催化水解5-芳基海因合成D-芳基甘 氨酸的需求，因此可以不使用诸如突变菌UV-LZ99等昂贵的菌株来提取相应的氨甲酰胺水 解酶，从而最终配制成生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂。更令人意想不到的是，当采 用本发明的方法活化菌株细胞并配制生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，甚至海因酶 的产生菌株也可以使用较为常规而且价格更为低廉的菌株。以上菌株的使用在降低成本的 同时，并不影响工业规模的酶催化非均相水解5-芳基海因合成D-芳基甘氨酸的稳定性以 及耐久性，也可以直接使用原有非均相酶催化的设备以及发酵流程，无需新的设备成本投 入，也无需重新培训生产线上的技术人员以掌握其他发酵流程。本发明与现有技术相比具有的有益效果为①与原有“两菌两酶”法在非均相酶催化水解5-芳基海因合成D-芳基甘氨酸中 应用相比，本发明换用了酶并换用了活化和配制方法，本发明反应速度快、节能、产率高、产
品质量稳定等。②“两菌”法无需提取酶的步骤，酶(菌)的活化过程与菌种细胞的培养放大过程 合二为一，简化了实际生产的步骤，降低了生产成本。③菌种成本低，无需多种昂贵的菌种相配合(即使海因酶的活性较低，也不影响 最终发酵效率)，而且新的活化和配制方法使得配制后得到的酶制剂在生产中持久、稳定， 无需像“两酶两菌”法那样需要在长时间的反应过程中监控酶活性并适时补加，可以方便地 放大到工业规模级的生产中，特别适于工业化生产。④底物适应性强，无须像现有的“两菌两酶”法那样，D-对羟基苯甘氨酸可以使用
7放射形土壤杆菌LZ99发酵产生的酶，而对其他D-芳基甘氨酸则需要另外筛选出的放射形 土壤杆菌UV-LZ99的酶。⑤直接使用了细胞而不使用可溶性酶，可以避免混合发酵以及酶提取的步骤，只 需要活化菌种即可，对于长期困扰晶体纯度的蛋白杂质问题，我们经研究发现细胞体和用 非均相法结晶出来的粗产物大小不同，用市售的200目筛就可以简单地分离，十分方便工 业化生产。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。实施例一1、海因酶制剂的制备在IOL发酵罐中，分别加入416g玉米浆、428g糖蜜、20mL 30% (w/w)氢氧化钠水 溶液、50g氯化钠、32g 2-硫尿嘧啶、IOg硫酸镁、15g硫酸锰、3. 6g磷酸氢二铵以及水至体积 达到8L，于0. 1 0. 12Mpa压力、120 125°C条件下消毒灭菌0. 5h，降温至30. 5°C时，将预 先在250mL摇瓶中培养好的黄金节杆菌3256(购自石家庄中天生物技术有限责任公司)接 种于发酵罐中。随后在空气压力为0. 2Mpa、空气流量为20 26L/h的前提下，控制反应釜 压力为0.05Mpa、温度为33°C，搅拌发酵15h。然后，将发酵液用(w/w)壳聚糖400g絮 凝，沉淀出含海因酶细胞，减压过滤得湿的海因酶制剂，即为活化的黄金节杆菌3256细胞。同时，另外取ImL发酵液测定海因酶的酶活性将ImL发酵液以4800r/min离心 30min,弃上清液并将所得细胞重悬于生理盐水中，使总体积达到lmL，不提取酶而直接向该 细胞悬液中加入9mL含2. 2% (w/w)对羟基苯海因的磷酸缓冲溶液(pH8. 0)，于38°C下缓 慢震荡反应30min，然后加入0. ImL 6N盐酸混勻终止反应，然后离心30min。取上清液，用 HPLC测定其中D-N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸的浓度。1个海因酶的酶活单位(U)被定义为 每Imin内每ImL发酵液所含细胞能产生的D-N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸的量。根据三次发 酵结果，海因酶活性分别为0. 37U、0. 42U和0. 39U，表明用该方法可以直接稳定活化出高酶 活性的细胞。2、氨甲酰水解酶制剂的制备在IOL发酵罐中，分别加入360g玉米浆、220g葡萄糖、90g蛋白胨、25g氯化钠、 1. Sg硫酸锰、7. 2g磷酸氢二铵、14g阿拉伯糖以及水至体积8L，并用氢氧化钠调节pH为 6.8。于0. 1 0. 12Mpa压力、12. 125°C条件下消毒灭菌0. 5h，降温至30. 5°C，将预先在 250mL摇瓶中培养好的放射形土壤杆菌3255 (购自石家庄中天生物技术有限责任公司)接 种于发酵罐中。随后在压力为0. 2Mpa、空气流量为18 22L/h的前提下，控制反应釜压力 0.05Mpa、温度为35°C，搅拌发酵17h。然后，将发酵液用(w/w)壳聚糖400g絮凝，从而 沉淀出细胞，减压过滤得湿的氨甲酰水解酶制剂，即为活化的放射形土壤杆菌3255细胞同时，另外取ImL发酵液测定氨甲酰水解酶的酶活性将ImL发酵液以4800r/min 离心30min，弃上清液并将所得细胞重悬于生理盐水中，使总体积达到lmL，不提取酶而直 接向该细胞悬液中加入9mL含2. 2% (WZV)D-N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸的磷酸缓冲溶液 (pH8. 0)，于38°C下缓慢震荡反应30min，然后加入0. ImL 6N盐酸混勻终止反应，然后离心 30min。取上清液，用HPLC测定其中D-对羟基苯甘氨酸的浓度。1个氨甲酰水解酶的酶活
8单位(U)被定义为每Imin内每ImL发酵液所含细胞能产生的D-对羟基苯甘氨酸的量。根 据三次发酵结果，氨甲酰水解酶的酶活性分别为10. 1UU1.7U和10. 6U，表明用该方法可以 直接稳定活化出高酶活性的细胞。3，生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂取以上制备的湿的海因酶制剂和湿的氨甲酰水解酶制剂混合均勻，即得双酶制 剂一生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂。实施例二，生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂的应用一催化反应实例1、D-对苯甘氨酸的制备在50L的酶催化反应罐中，先加入30kg水，然后投入5_苯基海因2. 8kg，加盐酸 或硫酸调整PH为6. 8，在搅拌的条件下再加入由实施例一步骤1中制备的湿的海因酶制剂 1.5kg和实施例一步骤2中制备的湿的氨甲酰水解酶酶制剂1.5kg，混合均勻，控制温度为 38°C，搅拌反应。当反应进行到4h左右时，则有D-苯甘氨酸晶体析出，其间抽样并用高效液相色谱 检测反应，反应液中D-苯甘氨酸的浓度基本恒定在1.6%左右。待液相色谱几乎检不出底 物5-苯基海因，且中间体N-氨甲酰苯甘氨酸含量低于0. 25%时，停止反应。苯海因的转化 率在99. 6%以上。对该50L酶催化反应罐中的物质过200目筛，以实现固体产物与微小的菌体细胞 和溶液之间的分离，得到D-苯甘氨酸的粗晶体。以水为溶剂，通过酸碱转化重结晶便可获 得D-苯甘氨酸1.48kg，此为第一部分产品；筛分分离得到的液体部分进一步提取首先将 液体通过截留5000分子量超滤膜进行过滤，滤液经减压蒸发浓缩，期间有D-苯甘氨酸结晶 析出。过滤收集D-苯甘氨酸结晶，再采用第一部分产品相同的重结晶方法，便可获得第二 部分产品0. 51kg。合并两部分D-苯甘氨酸，共得纯度为99. 8%以上、质量为1. 99kg的产 品，总收率83%。2，D-苯甘氨酸衍生物的制备采用与上述ID-对苯甘氨酸的制备相同的制备方法和参数，其中以5-对羟基苯 海因4. 5kg代替5-苯海因2. 8kg，最终得到纯度为99. 7%以上的D-对羟基苯甘氨酸晶体 3. Ikg0采用与上述ID-对苯甘氨酸的制备相同的制备方法和参数，其中以5-对甲氧基苯 海因3. 2kg代替5-苯海因2. 8kg，最终得到纯度为99. 8%以上的D-对甲氧基苯甘氨酸晶 体 2. 3kg。采用与上述ID-对苯甘氨酸的制备相同的制备方法和参数，其中以5-对氟苯海因 3. 8kg代替5-苯海因2. 8kg，最终得到纯度为99. 8%以上的D-对氟苯甘氨酸晶体2. 6kg。采用与上述ID-对苯甘氨酸的制备相同的制备方法和参数，其中以5-对氯苯海因 3. 5kg代替5-苯海因2. 8kg，最终得到纯度为99. 8%以上的D-对氯苯甘氨酸晶体2. 4kg。采用与上述ID-对苯甘氨酸的制备相同的制备方法和参数，其中以5-对溴苯海 因4. Ikg代替5-苯海因2. 8kg，最终得到纯度为99. 8 %以上的晶体D-对溴苯甘氨酸晶体 2. 9kg。采用与实例二中1相同的制备方法和参数，其中以5-对碘苯海因2. 8kg代替5-苯
9海因2. 8kg，最终得到纯度为99. 7%以上的D-对碘苯甘氨酸晶体2. 1kg。3、D-3-吡啶甘氨酸的制备在50L的酶催化反应罐中，先加入32kg水，在搅拌的条件下投入5_(3_吡啶基) 海因3. 8kg，加盐酸或硫酸调整pH为6. 3，再加入由实施例一中1制备的湿的海因酶制剂 1. 8kg和实施例一中2制备的湿的氨甲酰水解酶酶制剂3. 0kg，混合均勻，于33°C下搅拌反 应。当反应进行到6h左右时，则有D-3-吡啶甘氨酸晶体开始析出，然后定期取样并用 高效液相色谱检测反应，待液相色谱几乎检不出底物5-(3_吡啶基)海因，且中间体N-氨 甲酰-3-吡啶甘氨酸含量低于0.20% (w/w)时，停止反应。5-(3_吡啶基)海因的转化率 在99. 6%以上。反应混合物经200目筛以实现固体产物与菌体和溶液之间的分离，得到D-3-吡 啶甘氨酸的粗晶体，以水为溶剂，通过酸碱转化重结晶便可获得D-3-吡啶甘氨酸1. 87kg， 此为第一部分产品；将透过筛的得到的液体进一步提取首先将液体通过截留1万分子 量的超滤膜进行过滤，滤液经减压蒸发浓缩，期间有D-3-吡啶甘氨酸结晶析出。过滤收 集D-3-吡啶甘氨酸结晶，再采用第一部分产品相同的重结晶方法，便可获得第二部分产品 0. 81kg。合并两部分D-3-吡啶甘氨酸，共得纯度为99. 2%以上、质量为2. 68kg的产品，总 收率82%。4、D-2_萘甘氨酸的制备在50L的酶催化反应罐中，先加入37kg水，在搅拌的条件下投入5_(2_萘基)海 因3. 8kg，加盐酸或硫酸调整pH为7. 1，再加入由实施例一/1制备的湿的海因酶制剂1. 5kg 和实施例一中2制备的湿的氨甲酰水解酶酶制剂2. 3kg，混合均勻，于38°C下搅拌反应。当反应进行到7h左右时，则有D-2-萘甘氨酸晶体开始析出，然后定期取样并用高 效液相色谱检测反应，待液相色谱几乎检不出底物5- (2-萘基)海因及对应中间体时，停止 反应。5-(2-萘基)海因的转化率在99.0%左右。反应混合物过200目筛以实现固体产物与菌体细胞和溶液之间的分离，得到 D-2-萘甘氨酸的粗晶体，以水为溶剂，通过酸碱转化重结晶得D-2-萘甘氨酸1. 90kg，此为 第一部分产品；将透过筛得到的部分液体进一步提取首先将液体通过截留1万分子量的 超滤膜进行过滤，滤液经减压蒸发浓缩，期间有D-2-萘甘氨酸结晶析出。过滤收集D-2-萘 甘氨酸结晶，再采用第一部分产品相同的重结晶方法，便可获得第二部分产品0. 63kg。合并 两部分D-2-萘甘氨酸，共得纯度为98. 8%以上、质量为2. 53kg的产品，总收率75%。5、D-2-喹啉甘氨酸的制备在50L的酶催化反应罐中，先加入36kg水，在搅拌的条件下投入5_(2_喹啉基) 海因4. 2kg，调整pH为6. 5，然后加入由实施例一中1制备的湿的海因酶制剂1. 5kg和实施 例一中2制备的湿的氨甲酰水解酶酶制剂3. 2kg，混合均勻，于37°C下搅拌反应。当反应进行到6h左右时，则有D-2-喹啉甘氨酸晶体开始析出，然后定期取样并 用高效液相色谱检测反应，待液相色谱几乎检不出底物5-(2_喹啉基)海因，且其中间体 N-氨甲酰-D-喹啉甘氨酸在反应液中的含量低于0.3% (w/w)时，停止反应。5-(2-喹啉 基)海因的转化率在99. 5%左右。反应混合物过200目筛以实现固体产物与菌体细胞和溶液之间的分离，得到D-2-喹啉甘氨酸的粗晶体。以水为溶剂，通过酸碱转化重结晶得D-2-喹啉甘氨酸2. 55kg， 此为第一部分产品；将透过筛得到的液体进一步提取首先将液体通过截留2万分子量的 超滤膜过滤，滤液经减压蒸发浓缩，期间有D-2-喹啉甘氨酸结晶析出，过滤、收集D-2-喹啉 甘氨酸结晶。再采用第一部分产品相同的重结晶方法，便可获得第二部分产品0. 63kg，经检 测合格后，合并两部分D-2-喹啉甘氨酸，共得纯度为98. 5 %以上、质量为3. 18kg的产品，总 收率85%。
权利要求
生物催化合成D 芳基甘氨酸的酶制剂，其特征是，它由产海因酶的黄金节杆菌的活化细胞和产氨甲酰水解酶的放射形土壤杆菌的活化细胞组成。
2.如权利要求1所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，其特征是，所述黄金节 杆菌产生的海因酶的初始酶活性为大于0. 32U，所述放射形土壤杆菌产生的氨甲酰水解酶 的初始的活性大于10U。
3.如权利要求1所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，其特征是，所述黄金节 杆菌的初始海因酶活性为0. 32U 0. 45U。
4.如权利要求1所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，其特征是，所述黄金节 杆菌为黄金节杆菌3256活化细胞，所述放射形土壤杆菌为放射形土壤杆菌3255活化细胞。
5.如权利要求1 4所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂的制备方法，其特征 是它包括以下步骤a.将产海因酶的黄金节杆菌接种于含玉米浆、糖蜜、氢氧化钠水溶液、氯化钠、2-硫尿 嘧啶、硫酸镁、硫酸锰和磷酸氢二铵的液体培养基中，于30 34°C搅拌活化培养，其中，搅 拌速度为60rpm ；活化时间为12 18h，优选14 16h ；空气压力为0. 18 0. 23Mpa，优选 为0. 2Mpa ；空气流量为20 26L/h ；反应釜压力为0. 04 0. 06Mpa，优选为0. 05Mpa ；然后 将该培养液用水溶性壳聚糖絮凝，过滤收获固形酶制剂1 ；所述液体培养基含玉米浆360 460重量份、糖蜜380 480重量份、浓度为25 35% (w/w)的氢氧化钠水溶液15 25重量份、氯化钠40 60重量份、2-硫尿嘧啶27 37重 量份硫酸镁8 10重量份、硫酸锰1. 2 1. 8重量份、和磷酸氢二铵3 4重量份，并加水 定容至8000重量份；b.将产氨甲酰水解酶的放射形土壤杆菌接种于含玉米浆、葡萄糖、蛋白胨、氯化钠、硫 酸锰、磷酸氢二铵和阿拉伯糖的液体培养基中，于32 38°C搅拌活化培养，其中搅拌速度 为60rpm ；活化时间为15 22h，优选16 18h，最优选为17h ；空气压力为0. 18 0. 23Mpa， 优选为0. 2Mpa ；空气流量为18 22L/h ；反应釜压力为0. 04 0. 06Mpa，优选为0. 05Mpa ； 在所述培养基中添加氢氧化钠调节PH为6. 5 7. 8，优选为6. 8 7. 3，最优选为7. 0，然后 将该培养液用水溶性壳聚糖絮凝，过滤收获固形酶制剂2 ；所述液体培养基含玉米浆200 400重量份、葡萄糖180 260重量份、蛋白胨80 100重量份、25g氯化钠20 30重量份、硫酸锰1. 6 2. 0重量份、磷酸氢二铵6. 8 7. 6 重量份、和阿拉伯糖12 16重量份；并将所述液体培养基加水定容至8000重量份；c.将步骤a制得的固形酶制剂1和步骤b制得的固形酶制剂2混合，制得生物催化合 成D-芳基甘氨酸的酶制剂，其中所述固形酶制剂1和所述固形酶制剂2的重量配比为1 5 1 50，优选比例为1 5 1 20，更优选比例为1 2 1 5。
6.如权利要求1所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，其特征是，它用于酶催 化非均相水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法中。
7.如权利要求6所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，其特征是，所述的酶催 化非均相水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法包括以下步骤①在酶催化反应罐中，加入水和5-芳基海因，并调整pH值为6.5 7. 8，5-芳基海因 的加入量占水和5-芳基海因总重量的5 21% (w/w)，得混合溶液；②在搅拌的条件下向酶催化反应罐中加入权利要求1 5任一所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，在25 40°C下搅拌反应，直至无法检测出5-芳基海因，制得D-芳 基甘氨酸；其中所述生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂占步骤①中的混合溶液的总重量的 1 10%，优选为为2-8% ；反应时间8 66小时；③通过200目筛分离沉淀出D-芳基甘氨酸固体，经过重结晶，获得D-芳基甘氨酸晶体；④通过超滤膜过滤和蒸发浓缩来提取酶催化反应罐中的液体中溶解的D-芳基甘氨 酸，再经过重结晶，得D-芳基甘氨酸晶体。
8.如权利要求7所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，其特征是，所述的酶催 化非均相水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法步骤④还可以为以下步骤先通过超滤膜过滤酶催化反应罐中的溶液，然后蒸发浓缩透析液部分来提取酶催化反 应罐中的液体中溶解的D-芳基甘氨酸，再经过重结晶，得D-芳基甘氨酸晶体。
9.如权利要求7所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，其特征是，所述酶催化 非均相水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法中的D-芳基甘氨酸为D-苯甘氨酸、D-对羟基苯 甘氨酸、D-氟苯甘氨酸、D-氯苯甘氨酸、D-溴苯甘氨酸、D-碘苯甘氨酸、D-甲氧苯甘氨酸、 D-吡啶系列甘氨酸、D-萘系列甘氨酸、D-喹啉系列甘氨酸D-嘧啶甘氨酸、D-吡嗪甘氨酸、 D-哒嗪甘氨酸、D-吲哚甘氨酸、D-噻吩甘氨酸、D-呋喃甘氨酸、D-吡咯甘氨酸、D-吡唑甘 氨酸、D-咪唑甘氨酸、D-噻唑甘氨酸、D-噁唑甘氨酸和D-异噁唑甘氨酸中的一种。
10.如权利要求8所述的生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，其特征是，所述制备 非均相酶催化水解海因合成D-芳基甘氨酸的方法中的D-芳基甘氨酸为D-苯甘氨酸；所述 D-苯甘氨酸的制备方法为①在酶催化反应罐中，加入水30kg和5-苯基海因2.8kg，并调整pH值为6. 8 ；②在搅拌的条件下向酶催化反应罐加入权利要求1-5之任一所述的生物催化合成 D-芳基甘氨酸的酶制剂2. 8kg，在38°C下搅拌反应，直至无法检测出5-苯基海因，并且中间 产物N-氨甲酰苯甘氨酸含量小于等于0. 25% (w/w)，制得D-苯基甘氨酸；③分离沉淀出D-苯基甘氨酸固体，经过重结晶，获得D-苯基甘氨酸晶体；④通过超滤膜过滤和蒸发浓缩来提取酶催化反应罐中溶液部分溶解的D-苯基甘氨 酸，得D-苯基甘氨酸。
全文摘要
本发明涉及一种生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂，由产海因酶的黄金节杆菌的活化细胞和产氨甲酰水解酶的放射形土壤杆菌的活化细胞组成，本发明还涉及该生物催化合成D-芳基甘氨酸的酶制剂的制备方法和用途，它可用于催化非均相水解海因合成D-芳基甘氨酸或其衍生物，使用本发明可大大降低生产成本、提高产品收率。
文档编号C12N9/78GK101906408SQ20101018138
公开日2010年12月8日 申请日期2010年5月25日 优先权日2010年5月25日
发明者刘守信, 明常鑫, 李军章, 甄小丽, 田霞 申请人:河北科技大学