专利名称：棉花一片多靶标的fish方法
技术领域：
本发明属于分子细胞遗传学领域，具体地，本发明涉及棉花一片多靶标的FISH方法。
背景技术：
染色体原位杂交技术是根据核酸分子碱基互补配对的原理，将有放射性或非放 射性标记的外源核酸探针，与染色体上变性处理后的单链DNA互补配对，再经过一系列的 检测手段将待测的核酸序列在染色体上的位置显示出来的技术。在染色体原位杂交技 术创建初期，均采用放射性同位素标记探针，但随着荧光素物质出现后，开始使用荧光素 检出杂交信号，杂交结果在荧光显微镜下观察，即荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，简称为 FISH)。基因组原位杂交(genomicin situ hybridization, GISH)技术是 80 年代末 90 年代初发展起来的一种原位杂交技术。它用来自一个物种的总基因组DNA作为标记探针， 以适当浓度的另一物种总基因组DNA进行封阻，在靶染色体上进行原位杂交。相对于标记 DNA探针，高浓度封阻DNA优先与靶染色体上共有保守序列杂交，剩下的外源种特异性序列 主要被标记探针所杂交。GISH技术是跟踪检测杂种的真实性及其后代外源染色体或染色体 片段存在与否的一个快速、灵敏、准确的手段。cGISH是一种新的基因组原位杂交分子显带方法，它是利用一个物种的基因组 DNA作探针对其它物种染色体进行原位杂交，其杂交信号检出程序是专门用于检出重复 DNA序列的，因此可以直观地显示不同物种间共享的重复序列在染色体上的分布(Jutta. et al.，2001)。cGISH最初用于植物中检测杂交后代是否存在或是否渗入了原物种的基因组 DNA，后来逐渐成为一种基因组进化分析的新手段。不同种间的比较基因组杂交在物种进化 和亲缘关系的研究上有重要作用，是研究不同物种基因组间重复序列的变异性和保守性的 一种简便方法。然而，以荧光原位杂交技术为基础的cGISH，对某一物种及近缘种基因组进行比较 基因组荧光原位杂交分析时，一般都是采用一固定探针分别对不同的靶DNA进行杂交，将 得到的实验结果进行对比分析。这样，当这一固定探针在某一物种及近缘种染色体上杂交 时，一旦FISH检测后无信号产生时就很难定义，到底是人为操作的原因还是探针与靶DNA 之间确实无同源序列难以说清。而在不同的靶DNA上都可以产生杂交信号后，则需要对比 这些实验的荧光信号强弱，其受到的影响因素会更多，如分别制片间的质量，处理时间及程 度差异、分别配置杂交液组分差异、分别变性靶染色体时间及变性程度差异、分别杂交时间 及温度差异、分别洗脱强度差异、图像分别采集时曝光程度的差异等等，因此需要创造外界 环境相对一致的条件，才能确保得到的实验结果具有真实性，并且有助于阴性实验结论的 得出。
发明内容
因此，本发明的发明人为了解决上述问题提出并完成了本发明。本发明主要针对上述FISH试验中出现的问题，设计了一种同一制片下多靶标的FISH技术方法，旨在能够更 准确反映目的FISH探针(一个或多个代表着某一 DNA序列)与两种或多种靶染色体(即 两种或多种材料)进行比较荧光原位杂交时的杂交结果。本发明的目的是提出一种棉花一片多靶标的FISH方法。根据本发明的棉花一片多靶标的FISH方法包括以下步骤1)将不同棉种染色体样品放在同一载玻片上进行混合制片，2)用同一次探针同时进行荧光原位杂交，在荧光原位杂交结果图像采集的过程中 选择同一视野下的不同棉种染色体分裂相进行拍照。根据本发明的方法，可以通过染色体数目差异、或特征染色体或其片段(如随体 大小、有无等)或通过引入识别探针区分FISH结果中供比较的靶染色体。当满足了对供比 较的靶染色体的识别后，在制片过程中，将分别酶解好的不同棉种(两种及两种以上)染色 体样品(来源于根尖或花粉母细胞)等比例或不等比例放在同一载玻片上进行混合制片， 完成同一制片多靶标的制备，储存备用。在完成荧光原位杂交的杂交、洗脱步骤后，图像采 集时，选择同一视野下两个或多个棉种染色体分裂相，进行荧光拍照，确保曝光度一致。具体地，根据本发明的方法，识别供比较的材料的FISH图像时，可以借助于被比 较品种的已知特性区分供试材料的染色体，例如，通过单个细胞里的染色体数目比较，如二 倍体棉种分裂相中染色体数为26条，而四倍体棉种分裂相为52条；或者通过比较特征染色 体或其片段，如黄褐棉有两个特别大的随体、亚洲棉与克劳茨基棉的随体数量不同、草棉与 亚洲棉的随体所在染色体臂位不同等等；或者通过识别引入的识别探针，如利用RNA位点、 大小不同，通过加入RNA探针(45S或5SRNA探针)来区分不同棉种，二倍体D组棉种雷蒙 德氏棉和瑟伯氏棉的45S位点分别为3对、4对、E组的灰白棉5S位点为2对而其他二倍体 均为1对；四倍体棉种黄褐棉与其他四倍体棉种染色体数目相同但有一个非常明显的大随 体，可以用45SRNA探针来区分开黄褐棉与其他四倍体棉种。在区分开不同棉种后，就能顺 利的比较其他颜色标记的目的探针信号了。根据本发明的方法，在制备同一制片的多靶标时，其具体操作可以为将不同棉 种分别发根后，待主根长至3cm左右去掉根尖1cm，重新栽入培养盘，让材料生长侧根， 待侧根长至3-5cm(2-3天)，分别集中收集3-5cm的侧根，取根尖(0. 5mm)，于放线菌酮 (25ppm) 20°C预处理(破环纺锤丝，使前期染色体提前浓缩，形成分散的中期染色体)，春、 秋天预处理2h，夏天1.5h，冬天2h。预处理结束后，用蒸馏水洗lOmin，固定液(95%乙醇 冰乙酸3 1)固定2-24h。然后，水洗10min，2%纤维素酶(Cellulase R-10)和果胶 酶(Pectinase Y-23)混合液37°C分别处理45min (分解细胞壁，释放细胞核)，选择酶解好 的不同棉种(两种及两种以上)染色体样品(来源于根尖或花粉母细胞)放于同一张载玻 片上混合制片，45%或60%乙酸(软化细胞)压片，然后镜检，选择分裂相较好且多的制片 保留。-20°C预冷，-70°C揭盖片，80°C迅速烤干(防止染色体变形)，-20°C保存备用。根据本发明的方法保证了不同棉种靶染色体的杂交流程中外环境(杂交或洗脱 的温度、湿度、时间、溶液中各离子含量等)及人为操作步骤等等的一致性，避免了分别进 行荧光原位杂交时，由于人为操作或外界条件所造成的实验误差，因此，该方法获得的FISH实验结果相对更具有真实性。
图1供比较靶材料二倍体雷蒙德氏棉(26条染色体)和四倍体海岛棉(52条染色 体)的有丝分裂中期染色体，428K20序列探针为目的探针(绿色信号)。图2供比较靶材料二倍体雷蒙德氏棉(26条染色体)和四倍体海岛棉(52条染色 体)的有丝分裂中期染色体，428K20序列探针为目的探针(绿色信号)、150D24序列探针为 另一目的探针(红色信号)。图3供比较靶材料四倍体黄褐棉(52条染色体)和四倍体达尔文棉(52条染色 体)的有丝分裂中期染色体，45S序列探针为识别探针(绿色信号)、二倍体D组瑟伯氏棉 基因组为目的探针。图4供比较靶材料四倍体黄褐棉(52条染色体)和四倍体达尔文棉(52条染色 体)的有丝分裂中期染色体，45S序列探针为识别探针(绿色信号)、二倍体D组戴维逊氏 棉基因组为目的探针(红色信号)。
具体实施例方式实施例1棉花一片多靶标的FISH实验实验材料二倍体棉种雷蒙德氏棉、瑟伯氏棉、戴维逊氏棉和四倍体棉种海岛棉、 黄褐棉、达尔文棉均来自于中国农业科学院棉花研究所。实验试剂纤维素酶Onazuka R-IO和果胶酶Pectolyase Y-23均购自Solarbio ； 探针标记试剂盒Bio-Nick Translation Mix和DIG-Nick Translation Mix均购自于Roche 公司。1、棉花基因组DNA提取60°C预热核裂解缓冲液(实验前现加2% β -巯基乙醇ν/ν)取约2g左右幼叶， 立即放入冰冻过的研钵，在研钵中加液氮迅速研磨成粉末。快速装入7mL离心管中，加入在 60°C水浴中预热过的提取缓冲液约3mL，摇勻。60°C水浴40min，每IOmin摇一次。取出离 心管，加入等体积氯仿异戊醇(24 1，V/V)抽提液，盖上盖子后，缓慢颠倒离心管30-50 次。平衡离心管后，13000rpm，4°C离心lOmin。吸取上清，转入新的7mL离心管，重复抽提一 次。重取上清，转入新的7mL离心管，加入0. 6倍体积的冰冷异丙醇，缓慢颠倒离心管直至有 絮状沉淀析出。钩出沉淀，转入灭菌的1. 5ml离心管，用70%的乙醇洗2-3次，无水乙醇洗 2次，尽可能倒干净乙醇，风干。加400111^^651的水浴中溶解201^11或过夜。加入20 50yg/mL(终浓度)的RNaSeA，65°C水浴lh。加等体积氯仿异戊醇(体积比为24 1， V/V)抽提液，缓慢颠倒离心管30 50次，平衡离心管后，12000rpm, 4°C离心lOmin。吸取上 清，加入2倍体积的冰冷无水乙醇和1/10体积的乙酸钠(0. 3mol/L、pH5. 2)，静置5min后， 缓慢水平转动离心管5min，慢慢形成一团粘稠的透明的含有许多气泡的絮状沉淀。钩出沉 淀，转到新的1. 5mL的印pendoff管中(或12000rpm，4°C离心lOmin，弃上清)，用70%的酒 精洗2-3次。无水乙醇洗2次，尽可能倒干净乙醇，风干，用300 μ LTE或ddH20溶解，-20°C 保存。2、体细胞染色体制片
分别取供不同棉种的种子在约60°C的温水中浸种过夜，播种于经煮沸消毒的潮湿 细沙中，置30°C萌发。待主根长至3cm左右去掉根尖1cm，重新栽入培养盘，让材料生长侧 根，待侧根长至3-5cm(2-3天)，分别集中收集3-5cm的侧根，取根尖(0. 5mm)，于放线菌酮 (25ppm) 20°C预处理(破环纺锤丝，使前期染色体提前浓缩，形成分散的中期染色体)，春、 秋天预处理2h，夏天1.5h，冬天2h。预处理结束后，用蒸馏水洗lOmin，固定液(95%乙醇 冰乙酸3 1)固定2-24h。然后，水洗10min，2%纤维素酶(Cellulase R-10)和果胶 酶(Pectinase Y-23)混合液37°C分别处理45min (分解细胞壁，释放细胞核)，选择酶解好 的不同棉种(两种及两种以上)染色体样品(来源于根尖或花粉母细胞)放于同一张载玻 片上混合制片，45%或60%乙酸(软化细胞)压片。镜检，选择分裂相较好且多的制片保 留。-20°C预冷，-70°C揭盖片，80°C迅速烤干(防止染色体变形)。4°C保存备用。3、探针的标记探针的标记采用Bio-Nick Translation Mix 或 DIG-Nick Translation Mix 标记 系统，其流程按照Roche公司的试剂说明书进行(1)取 1 μ g 探针加 CldH2O 中至 16 μ L ；(2)力口入4yL· Bio-Nick Translation Mix/DIG-Nick Translation Mix，混合，短 暂离心；(3)在 15°C温浴 9Omin ；(4)在体系中加入IyL 0. 5M的EDTA，于65°C温浴lOmin，以灭活体系中的酶活性。4、杂交制片在60°C烘箱中干燥过夜，用100μ g/mL的RNase A(2XSSC配制)加塑膜盖 片，包装于37°C，1小时，2XSSC漂去塑膜盖片，2XSSC，3-5min洗涤。用0. 1% Pepsin(10M HCI 配制)37°C，20-40min。1 XPBS，2_5min。4% 的多聚甲醛 37°C，lOmin。2X SSC，3_5min。 2父55(配制70%去离子甲酰胺溶液，801，21^11。-20°C条件下，75% -95% -100%乙醇脱 水，每级5min。自然风干，备用。制备杂交混合液，取20 μ L杂交液滴于制片上，加塑膜盖片，包装于80°C水浴锅中 共变性lOmin。立即转入37°C水浴中杂交过夜，然后洗脱。用安装有CXD摄像头的Zeiss荧光显微镜观察荧光信号，用Zeiss-QFISH成像系 统软件进行原位杂交图象的摄取、采集和加工，以及核型分析。雷蒙德氏棉和海岛棉是分别具有26和52条染色体的棉种，目前，一般认为二倍 体雷蒙德氏棉为海岛棉D亚组供体种，428k20序列是从海岛棉Pima-90BAC文库中筛选到 的一重复序列，将其作为目的探针以同一制片的雷蒙德氏棉和海岛棉为靶DNA，杂交信号如 图I-A所示染色体数目较少的分裂相没有杂交信号，可以判断其是雷蒙德氏棉，而数目较 多的分裂相图I-B即是海岛棉，在较大的一半染色体(A亚组染色体)上几乎都有杂交信号 (绿色)，而在较小的一半染色体(D亚组染色体)靠近着丝粒区域有信号(绿色)。由此可 以证实428k20序列虽然在四倍体海岛棉较小的染色体上(D亚组)有杂交信号，但并非是 来自于其供体种雷蒙德氏棉，很有可能是其较大染色体(A亚组)供体种入侵或通过转座的形式导入较小染色体(D亚组)中的。实施例2
将实施例1中使用的制片以428k20序列和150D24序列为双目的探针杂交，得到的杂交结果如图2所示150D24序列的红色信号出现在雷蒙德氏棉所有染色体(图2-B)及 海岛棉较小染色体(D亚组)的着丝粒区域，由于与428k20序列在海岛棉较小染色体(D亚 组)的着丝粒区域产生的绿色信号重叠，所以海岛棉较小染色体(D亚组)的着丝粒区域看 到的是黄色的合成信号(图2-A)，由此也可以证实150D24序列是来自于其供体种雷蒙德氏 棉，但与428k20序列不一致。实施例3黄褐棉和达尔文棉同为四倍体棉种，其染色体均为52条，加入了识别探针45S，黄 褐棉的45S rDNA位点有3对，其中一对非常大几乎包含了整条染色体的短臂，而另两对非 常小；达尔文棉的3对45S rDNA位点基本一致。而目的探针分别为二倍体D组瑟伯氏棉基 因组和戴维逊氏棉基因组，用鲑鱼精DNA做封阻，通过杂交信号的强弱来比较黄褐棉和达 尔文棉分别含有瑟伯氏棉gDNA和戴维逊氏棉gDNA的比例多少。同一制片的黄褐棉和达尔文棉有丝分裂中期染色体以瑟伯氏棉gDNA为探针，其 杂交结果如图3所示从识别探针45S信号(绿色)来看，图3-A分裂相为黄褐棉，其红色 的瑟伯氏棉gDNA信号要比图3-B分裂相的红色信号强，由此可以证实瑟伯氏棉基因组在四 倍体黄褐棉基因组中分布更多。同一制片的黄褐棉和达尔文棉有丝分裂中期染色体以戴维逊氏棉gDNA为探针， 其杂交结果如图4所示从识别探针45S信号(绿)来看，图4-A分裂相为黄褐棉，其红色 的瑟伯氏棉gDNA信号要比图4-B分裂相的红色信号弱，由此可以证实戴维逊氏棉基因组在 四倍体达尔文棉基因组中分布更多。
权利要求
棉花一片多靶标的FISH方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1)将不同棉种染色体样品放在同一载玻片上进行混合制片；2)用同一次探针同时进行荧光原位杂交，在荧光原位杂交结果图像采集的过程中选择同一视野下的不同棉种染色体分裂相进行拍照。
2.根据权利要求1所述的棉花一片多靶标的FISH方法，其特征在于，所取染色体样品 来源于根尖或花粉母细胞。
3.根据权利要求1所述的棉花一片多靶标的FISH方法，其特征在于，用于混合制片的 各染色体样品等比例或不等比例混合。
全文摘要
本发明属于分子细胞遗传学领域，具体地，本发明涉及棉花一片多靶标的FISH方法。根据本发明的棉花一片多靶标的FISH方法包括1)将不同棉种染色体样品放在同一载玻片上进行混合制片；2)用同一次探针同时进行荧光原位杂交，在荧光原位杂交结果图像采集的过程中选择同一视野下的不同棉种染色体分裂相进行拍照。根据本发明的方法保证了不同棉种靶染色体的杂交流程中外环境(杂交或洗脱的温度、湿度、时间、溶液中各离子含量等)及人为操作步骤等等的一致性，避免了分别进行荧光原位杂交时，由于人为操作或外界条件所造成的实验误差，因此，该方法获得的FISH实验结果相对更具有真实性。
文档编号C12Q1/68GK101818206SQ20101017538
公开日2010年9月1日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者刘方, 张香娣, 杨晓芳, 王坤波, 王春英, 王玉红, 黎绍惠 申请人:中国农业科学院棉花研究所