一种植物抗逆性相关膜蛋白BjCRP1及其基因和应用的利记博彩app

专利名称：一种植物抗逆性相关膜蛋白BjCRP1及其基因和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗逆性相关膜蛋白 BjCRPl及其基因和应用。
背景技术：
印度芥菜(Brassica juncea)是目前筛选出的一种生长快、生物量大的Cd、Zn、 Pb忍耐-富集型植物。虽然它体内累积Cd能力没有目前世界上公认的Zn、Cd超累积植物 Thlaspi caerulescens高，但其生长速率和地上部生物量远远高于Thlaspicaerulescens， 因而相同条件下印度芥菜对Cd的吸收总量高于Thlaspi caerulescens，在植物修复中具 有更大的潜力。植物超富集重金属机理主要涉及植物对金属离子高的吸收、运输能力，区域化作 用及螯合作用等方面，其中跨膜运载蛋白的表达、调控对重金属超富集这一特性起了关键 作用。目前许多在金属离子的区域化(如在液泡内)或胞外输出起作用的膜运载蛋白基因 和基因家族被鉴定出来，如 CPx 型 ATP 酶(Williams et al. ,Biochim BiophysActa，2000， 1465 104-126), NRAMP 家族成员(Vidal et al.，Cell, 1993,73 :469_485)、CE 家族成员 (Pence et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97 4956-4960 ；Persans et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98 :9995_10000)、ATP 结合和运载蛋白(ABC 运载蛋白)(Rea，Exp Bot，1999，50 :895-913)、双价阳离子P质子反向运载蛋白如拟南芥的CAX(Hirschi，Plant Cell,1999，11 2113-2122)和 AtMHXl(Shaul et al.，EMBO J,1999，18 :3973_3980)。

发明内容
本发明的目的是提供一种植物抗逆性相关膜蛋白及其编码基因。本发明另一目的是提供包括上述基因的重组载体。本发明的再一目的是提供上述蛋白和基因的应用。根据本发明的植物抗逆性相关膜蛋白BjCRPl的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。根据本发明的植物抗逆性相关基因，其编码上述膜蛋白BjCRPl，例如，其核苷酸序 列如SEQ ID No. 2所示。根据本发明的重组载体包含上述基因，例如，所述载体为pET32a_BjCRPl。根据本发明的蛋白可以用于提高植物的抗重金属、抗盐、抗旱性。根据本发明的基因可以用于提高植物的抗重金属、抗盐、抗旱性。因此，根据本发明的提高植物抗重金属、抗盐、抗旱的方法包括将上述基因转入植 物、并表达的步骤。实验结果表明，在含有不同浓度的CdCl2培养基中，含空载体pET32a的BL21生长 情况明显不如含重组载体pET32a-BjCRPl的BL21的生长情况。0. 5mmol/L和1. 0mmol/L的 CdCl2处理时，BL21 (pET32a-BjCRPl)达到生长高峰时0D600的值分别为0. 9143和0. 4514， 而BL21(pET32a)在同样的条件下达到生长高峰时0D600值仅为0. 3014和0. 1494。当CdCl2浓度为1.5mmol/L时，BL21 (pET32a_BjCRPl)和BL21 (pET32a)的均不能正常生长，这表明 了 BL21 (pET32a-BjCRPl)耐受 CdCl2 的最高值为 1. 5mmol/L。在含不同浓度NaCl的LB液体培养基中，在NaCl为0. 4mol/L时，胁迫时 间达到5个小时之前，BL21 (pET32a)的生长明显受到抑制，之后生长情况明显好转， BL21(pET32a-BjCRPl) 一直都处于对数生长期，基本不受NaCl的影响。BL21(pET32a)在 NaCl 浓度为 0. 6mol/L 和 0. 8mol/L 时，几乎不能生长，BL21 (pET32a_BjJ10_2)在 NaCl 为 0. 6mol/L,生长高峰时 0D600 值为 0. 4743，在 NaCl 为 0. 8mol/L 时和 BL21 (pET32a) 一样也 不能生长。因此，认为BL21 (pET32a-BjJ10-2)耐受NaCl的临界值是0. 8mol/L。不同浓度PEG6000溶液胁迫处理的结果表明，PEG6000的浓度在10 % -20 % 时，重组菌和对照菌均能正常生长，重组菌生长略优于对照菌，但不如对NaCl和CdCl2 的抗性明显，说明BL21菌株本身具有一定的抗PEG胁迫能力。当PEG浓度为30%时， BL21 (pET32a-BjJ10-2)和BL21 (pET32a)生长明显受到抑制，但浓度差异不大，表明重组菌 BL21 (pET32a-BjJ10-2)抗PEG胁迫的能力较弱。BjCRPl转基因烟草的重金属Cd和高盐NaCl胁迫实验表明，与空载体对照相比过 表达BjCRPl显著提高了转基因植株抗重金属Cd(200 u M/L)和NaCl (250mmol/L)的胁迫能 力。而在正常培养条件下二者无明显差异。说明BjCRPl基因的表达能使重组菌株和植物同时获得显著的抗重金属(CdCl2) 和抗高盐(NaCl)特性，目前功能显著的既抗重金属又抗高盐的植物基因还少有报道。该抗 性的证明为BjCRPl基因在植物抗逆基因工程中的应用提供了基础，将在培育综合抗逆性 (重金属和/或高盐/或/干旱)增强的植物(小麦、玉米、水稻和蔬菜)中发挥重要作用。


图1 :BjCRPl推测的跨膜结构域(TMHMM软件)。图2 :BjCRPl基因完整开放阅读框的RT-PCR扩增结果。图3 克隆产物PGM-BjCRPl酶切电泳检测结果。图4 重组子PET-BjCRPl酶切电泳检测结果。 图5 :BjCRPl原核表达蛋白的PAGE图谱，第1_5泳道分别为IPTG诱导0h、2h、4h、 6h和8h的蛋白上清表达量；第6-9泳道分别为IPTG诱导0h、2h、4h和6h的蛋白沉淀表达 量，为可以看出该蛋白为融合蛋白，上清表达量明显大于沉淀，该蛋白为27. 5道尔顿，箭头 所指为表达的该蛋白。图6 :BjCRPl原核表达上清蛋白的PAGE图谱，第1_5泳道分别为IPTG诱导0h、2h、 4h、6h和8h的蛋白上清表达量，第6泳道为BL21空菌株经IPTG诱导6h的表达量，第7泳 道为BL21 (pET32a)经IPTG诱导6h的表达量可以看出该蛋白在经IPTG诱导6小时后表达 量达到最大，箭头所指为表达的该蛋白。图7 半定量RT-PCR检测BjCRPl基因在不同胁迫条件下的转录丰度，5_6片叶龄 的印度芥菜分别用 200 u M CdCl2、250mMNaCl、1000 u M ZnCljP 20% PEG6000 处理 12h，与对 照无胁迫处理进行比较。发现BjCERPl基因在叶部显著响应重金属(Cd、Zn)和高盐(NaCl) 及干旱PEG的胁迫而增强表达，在根部，除Cd胁迫外，其它胁迫均使BjCRPl基因转录水平
显著增强表达。
图 8 非胁迫和不同浓度 CdCl2 胁迫下 BL21 (pET32a)与 BL21 (pET32a_BjJ10_2) 的生长曲线，(a)非胁迫条件下BL21 (pET32a)与BL21 (pET32a-BjCRPl)的生长曲 线；(b)0. 5mmol/L CdCl2 胁迫下 BL21 (pET32a)与 BL21 (pET32a_BjCRPl)的生长曲 线；(c) 1. Ommol/L CdCl2 胁迫下 BL21 (pET32a)与 BL21 (pET32a_BjCRPl)的生长曲线； (d) 1. 5mmol/L CdCl2 胁迫下 BL21 (pET32a)与 BL21 (pET32a_BjCRPl)的生长曲线。图9 不同浓度NaCl 胁迫下BL21(pET32a)与 BL21 (pET32a_BjJ10_2)的生长曲线， (a)0. 4mol/L NaCl胁迫下BL21 (pET32a)与BL21 (pET32a_BjCRPl)的生长曲线；(b)0. 6mol/ L NaCl 胁迫下 BL21(pET32a)与 BL21 (pET32a_BjCRPl)的生长曲线；(c) 0. 8mol/L NaCl 胁 迫下 BL21(pET32a)与 BL21 (pET32a_BjCRPl)的生长曲线。图 10 不同浓度PEG6000胁迫下BL21 (pET32a)与BL21 (pET32a_BjCRPl)的生长曲 线，(a) 10% PEG6000 月办迫下 BL21 (pET32a)与 BL21 (pET32a_BjCRPl)的生长曲线；(b)20% PEG6000 胁迫下 BL21 (pET32a)与 BL21 (pET32a_BjCRPl)的生长曲线；(c)30% PEG6000 胁 迫下 BL21(pET32a)与 BL21 (pET32a_BjCRPl)的生长曲线。图11 :pBI121-BjCRPl-GFP表达质粒的结构示意图，nos-pro，胭脂碱合成酶启动 子；Nptll，新酶素磷酸转移酶基因；nos-ter，胭脂碱合成酶终止子；CaMV 35S Pro，花椰菜 花叶病毒35S启动子；GFP，绿色荧光蛋白基因；RB，右臂；LB，左臂。图12 植物表达载体重组子pBI121-BjCRPl_GFP酶切电泳检测结果，M，lOObpDNA 分子量Marker ；1-4,分别为4个重组克隆质粒的酶切鉴定结果，其中克隆3含正确BjCRPl 插入片段。图13 半定量RT-PCR检测转化烟草植株整合的BjCRPl基因转录水平上获得表 达，1，2，两个独立的pBI121-BjCRPl-GFP转基因株系；3，野生型烟草；4，pBI121_GFP转基因 烟草。用特异引物扩增报告基因GFP约800bp片断，循环数为25，Actin为看家基因，用来 控制上样模板量。图14 在200 u M CdCl2胁迫条件下，BjCRPl与空载体转基因烟草外植体分化再生 苗能力比较。图14(a)无CdCl2* 200iiMCdCl#§养条件下不同基因型分化再生苗示例，图 14 (b)无CdCl2和200 u MCdCl2培养条件下不同基因型分化再生苗数据分析。图15 在200 u M CdCl2和250mM NaCl胁迫条件下不同基因型转基因烟草生长15 天的茎叶与生根情况的比较。
具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1 植物抗逆性相关蛋白BjCRPl及其编码基因的获得根据印度芥菜及近缘物种RAMP4家族保守区核苷酸序列设计引物如下5’ -CGCGG ATCCGTTATCTGCAATTATGACAAC-3’ (F)(下划线是 BamH I 的酶切位点)，5，CCGCTCGAGTTATGA CATGCCTCCGCTAG-3，(R)(下划线是Xho I的酶切位点)。经含200 u mol CdCl2的l/2H0agland’ s营养液胁迫的印度芥菜幼苗，提取总RNA。用PrimeScript TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 并按试剂盒说明书进行操 作取1-5 u g印度芥菜总RNA，得到第一条链cDNA。取1 ill步骤3)获得的反转录产物为模板，在5’端引物和3’端引物的引导下，用
5PCR的方法合成BjCRPl的cDNA。反应结束后，对PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，得 到分子量约为250bp的条带，与预期结果相符，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海生工)回收 该片段。将该回收片段与载体PGM-T连接，将连接产物转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，根 据PGM-T载体上的羧苄青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒，命 名PGM-BJJ10-2。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列 测定测序结果表明扩增到得BjCRPl开放读码框(0RF)共207个碱基，编码具有68个氨基 酸的蛋白质，TMHMM软件推测BjCRPl的跨膜结构域如图1所示，第38位至第60位氨基酸 为跨膜区，N端1-37位氨基酸在膜内，C端61-68位氨基酸在膜外。实施例2原核表达载体的构建和表达蛋白检测1、原核表达载体PET-BjCRPl的构建将测序正确的含BjCRPl基因片段的PGM-T直接用BamH I、Xho I两种酶进行双酶 切，回收酶切片段与用BamH I、Xho I两种酶进行双酶切过的克隆载体pET32_a (+)连接，转 化大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS,并通过质粒酶切鉴定，筛选出阳性克隆并进行测序，从中筛选 出序列没有突变的pET-BjCRPl重组子。2、BjCRPl表达蛋白检测将重组质粒，空质粒均转入到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，分别挑取含有 pET-BjCRPl质粒、含空质粒以及不含质粒的空菌株，加入10mL LB液体培养基(含相应抗生 素)在灭菌的三角瓶中37°C 200rpm过夜培养；将菌液按1 50稀释，加入终浓度为0. 2% 的葡萄糖，继续37°C 200rpm培养2h，使之0D600达到0. 5-0. 6，收集lmL菌液备用。加入终 浓度为1. OmM的IPTG，在37°C诱导表达0h、2h、4h、6h和8h，各收集菌液lmL，离心后弃上清 留菌体置于-20°C备用。取出-20°C保存的菌体，加入100 ill 10mM Tris-HC1(PH8. 0)，冰上放置；再加
巯基乙醇，混勻；超声波处理50次；12000rpm，4°C离心15min，去上清和沉淀； 沉淀加入100 u 1 10mMTris-HCl (PH8. 0)和2 yl 2% 0 -巯基乙醇混勻充分，再加入20 u 1 4X上样缓冲液，上清直接加入20 yl 4X上样缓冲液。将蛋白样品(菌液)溶入上样缓冲液中，置于沸水中lOmin，离心lOsec ；分别配置 12%的分离胶，5%的浓缩胶，待其室温聚合完毕后拔出梳子并上样；浓缩胶部分以80V恒 压，分离胶部分以120V恒压电泳。待溴酚蓝电泳至凝胶底部后，停止电泳，然后剥胶、固定 和染色、脱色。BjCRPl原核表达蛋白的PAGE图谱如图5所示，BjCRPl原核表达上清蛋白的 PAGE图谱人图6所示，经IPTG诱导6h的表达量可以看出该蛋白在经IPTG诱导6小时后表 达量达到最大，箭头所指为表达的该蛋白。实施例3半定量RT-PCR检测BjCRPl在重金属、高盐和干旱胁迫条件下的转录丰 度变化选取5-6片叶龄的印度芥菜幼苗分别用200 iiM CdCl2、250mMNaCl、1000 ii MZnCl2 和20% PEG6000处理12h后，与对照无胁迫处理的苗子用无菌水进行漂洗2_3次后，迅速根 叶分离，液氮速冻进行总RNA提取。分别用BjCRPl特异引物上游引物5，-TTTTGTTCCTGA GACCACCAC-3，；下游引物 5，-TATGACATGCCTCCGCTAG-3，和肌动蛋白 0-Actin 引物上游引物5，-CTTAACCCTAAGGC
6TAACAG-3’ ；下游引物5，-TCCTCCGATCC AGACACT-3，进行扩增。3 -Actin 作为内参，以控 制模版量的一致。首先用1 P 1对照逆转后的cDNA模板，分别用Actin引物和BjCRPl弓丨物 进行分管PCR扩增。反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图7)。发现 BjCERPl基因在叶部显著响应重金属(Cd、Zn)和高盐(NaCl)及干旱PEG的胁迫而增强表 达，在根部，除Cd胁迫外，其它胁迫均使BjCRPl基因转录水平显著增强表达。说明BjCERPl 基因不仅显著响应重金属(Cd，Zn)的胁迫上调表达，而且显著响应高盐(NaCl)和干旱因子 PEG的胁迫上调表达，在植物抗重金属和盐及干旱胁迫方面可能均扮演重要角色。实施例4重组大肠杆菌BL21 (pET32a-BjCRPl)的抗逆性分析将重组质粒pET32a-BjCRPl和对照空质粒pET32a分别转化到表达菌株BL21 (DE3) plysS中，在含有氯霉素和氨苄霉素的琼脂平板上筛选阳性菌落。分别挑取新活化的 BL21 (pET32a-BjCRPl)和对照BL21 (pET32a)单菌落，接种于LB培养基中，37°C下振荡培养 过夜。分别取过夜培养物按1 50比例接种到含有氯霉素和氨苄霉素的LB液体培养基中 培养至0D600值均为0. 6用于胁迫实验。1.重组大肠杆菌BL21(pET32a_BjCRPl)的抗重金属胁迫。分别取BL21(pET32a-BjCRPl)和对照 BL21 (pET32a) 600 ii 1，加到含有 CdCl2 和抗 生素的30ml LB液体培养基中，CdCl2终浓度分别为0. 5mmol/L、l. Ommol/LU. 5mmol/L,同时 设置不含胁迫因素的对照，每个处理设置3个重复，37°C振荡培养，每隔lh测定0D600值， 共测9个小时。结果表明BL21 (pET32a-BjCRPl)和BL21 (pET32a)在不含胁迫因素的LB培养基中 培养立即进入对数生长期，生长势头相当，达到生长高峰时的0D600值均在1. 7左右(图 8a)，而当转接到含有不同浓度的CdCl2培养基中时，BL21(pET32a)的生长情况明显不如 BL21 (pET32a-BjCRPl) ,0. 5mmol/L 和 1. Ommol/L 的 CdCl2 处理时，BL21 (pET32a_BjCRPl) 达到生长高峰时0D600的值分别为0. 9143和0. 4514，而BL21 (pET32a)在同样的环境下 达到生长高峰时0D600值仅为0. 3014和0. 1494(图8b，c)，同时也可以看出CdCl2处理 的浓度增大，BL21(pET32a-BjCRPl)达到生长最高值的时间明显缩短。当CdCl2浓度为 1. 5mmol/L 时，BL21 (pET32a_BjCRPl)和 BL21 (pET32a)的均不能正常生长(图 8d)，这说明 BL21(pET32a-BjCRPl)耐受 CdCl2 的最高值在 1-1. 5mmol/L 之间。2.重组大肠杆菌 BL21 (pET32a-BjJ10_2)的 NaCl 胁迫。分别取BL21(pET32a-BjCRPl)和对照 BL21 (pET32a) 600 ii 1，加到含 NaCl 和抗生素 的30mlLB液体培养基中，NaCl终浓度分别为0. 4mol/L、0. 6mol/L、0. 8mol/L,每个处理设置 3个重复，37°C振荡培养，每隔lh测定0D600值，共9个小时。结果表明，在NaCl为0. 4mol/L时，胁迫时间达到5个小时之前，BL21 (pET32a)的 生长明显受到抑制，之后生长情况明显好转，BL21(pET32a-BjCRPl) 一直都处于对数生长 期，基本不受 NaCl 的影响(图 9a)。BL21 (pET32a)在 NaCl 为 0. 6mol/L 和 0. 8mol/L 时，几 乎不能生长，BL21 (pET32a-BjCRPl)在 NaCl 为 0. 6mol/L,生长高峰时 0D600 值为 0. 4743， 基本为 BL21 (pET32a)的 3 倍(图 9b)，在 NaCl 为 0. 8mol/L 时和 BL21 (pET32a) 一样也不能 生长(图9c)。因此，认为BL21 (pET32a-BjCRPl)耐受NaCl的临界值是0. 8mol/L。3.重组大肠杆菌BL21(pET32a_BjCRPl)的干旱胁迫。分别取BL21 (pET32a-BjCRPl)和对照 BL21 (pET32a) 600ml，加到含 PEG6000 和抗生素的30mlLB液体培养基中，PEG6000终浓度分别为10%、20%、30%。37°C振荡培养24h 后，再分别取胁迫后的菌液600 u 1转接到30mlLB培养基中37°C下振荡培养，每个处理设置 3个重复，每隔lh测定其0D600值。结果表明，PEG6000的浓度在10% -20%时，重组菌和对照菌均能正常生长，生长 高峰时0D值均达到1. 0 (图10a，b)，说明BL21菌株本身具有一定的抗PEG胁迫能力，但重 组菌生长略优于对照菌。当PEG浓度为30%时，BL21(pET32a-BjCRPl)和BL21 (pET32a)生 长明显受到抑制，但浓度差异不大(图10c)，表明重组菌BL21 (pET32a-BjCRPl)表明重组菌 BL21 (pET32a-BjJ10-2)抗PEG胁迫的能力较弱。实施例5BjCRPl转基因烟草的抗逆性分析步骤1 植物表达载体的构建与农杆菌转化依据双价载体pBI121-GFP (见图11)上的多克隆限制性酶切位点Xbal/BamHI序 列，设计了 BjCRPl 的 0RF 区 PCR 引物上游引物 5，-gggTCTAGAATGGTTATCTGCAATTATGACAAC-3’ ；下游引物 5’-ggcGGATCCTTATGACATGCCTCCGCTAG-3’ ， 以原核表达载体PET-BjCRPl载体上 的BjCRPl全长cDNA序列为模板分别扩增其0RF区域，扩增的DNA片段经Xbal/BamHI酶切 后，与Xbal/BamHI双酶切的pBI121_GFP载体进行环化连接，转化感受态大肠杆菌DH5 a，在 含有50 u g/mL卡那霉素的LB培养基上进行筛选。37°C过夜培养。分别挑取5_10个单克隆， 培养扩增，提取质粒进行Xbal/BamHI双酶切(图12)，分别取含有插入片段的克隆进行测序 (上海生工)验证，所测序列与已知序列一致，得到pBI121-BjCRPl-GFP植物表达载体，其 中含有CaMV 35S组成性表达强启动子和GFP绿色荧光蛋白报告基因，所表达的BjCRPl与 GFP构成融合蛋白。应用热激法(TzVi Tzfira et al,Plant Molecular BiologyReporter, 1997，15 219-235)将 pBI121-BjCRPl_GFP 导入农杆菌(Agrobacteriatumefaciencs) EHA105中，在含有30 u g/mL利福平(Rif)和50 u g/mL卡那霉素(Kan)的LB培养基上进行 筛选，并通过菌斑PCR技术对单克隆转化农杆菌进行确证。步骤2 烟草转化选用烟草品种W38 (Nicotiana tabacum c. v. W38)作为转基因受体，采用 叶盘法(Horsch RB et al, Science, 1985，227 :1229_1231)转化烟草品种 W38。以 MS(Murashige&Shoog)为基本培养基，其中分化再生培养基为TQ :MS+lmg/L6-BA+0. lmg/ L NAA+100mg/L卡那霉素+250mg/L Cef (头孢霉素)+8g/L琼脂，PH5. 8 ；生根培养基为 1/2MS+0. lmg/L NAA+100mg/L 卡那霉素 +250mg/L Cef+8g/L 琼脂，PH5. 8。挑取携带pB121-BjCRPl_GFP改良载体的农杆菌EHA105的单菌落，接种于5ml含 Rif20mg/1和Kan 50mg/L的YEB液体培养基中，28°C振荡培养过夜。取活化过夜的农杆菌， 按1 50的比例稀释到含Rif30mg/L和Kan 50mg/L的LB液体培养基中，继续培养至0D600 值大约为0. 6-0. 8。5000rpm离心5min，收集菌体，用1/2MS液体培养基洗涤菌体一次，并将 其稀释至0D600值0. 3-0. 35。选取约30天苗龄的烟草无菌苗，切下成熟叶片，用直径6mm的打孔器制取叶盘外 植体。将新制备的外植体投入已准备好的农杆菌菌液中，振荡侵染15-20分钟后，取出用滤 纸吸干附着于叶盘表面的残液，然后放在表面铺有一层滤纸的不含抗生素的I培养基上暗 处共培养两天，然后再转到L培养基上进行筛选培养，每隔2-3周用I；培养基继代一次。 待抗性芽长到1-1. 5cm时，将其切下换到培养基上诱导生根并获得抗性植株。
选取3-4片叶龄的转基因烟幼苗与野生型幼苗进行总RNA提取，和cDNA合成。用 GFP 上游引物 pi :5，-cccGGATCCAAGGAGATATAAC-3，和下游引物 p2 :5，-CCCGAGCTCTTATTTG TATAGTTCATCC-3，做PCR，反应体系25 y L反应体系，取cDNA模板1 y L，PCR反应的条件为 94°C预变性 lOmin ；94°C lmin，55°C 2min，72°C 2min，25 个循环；72°C延伸 lOmin。如图 13， BjCRPl转基因品系(泳道1，2)和空载体转基因苗(泳道4)有GFP扩增片段约800bp，对 照WT无扩增带，说明融合基因BjCRPl-GFP已分别整合到烟草基因组中，并在转录水平上获 得表达。步骤3 :T0代烟草重金属及盐抗性分析重金属Cd对转基因植株组织培养分化再生的影响分别剪取约1cm2的空载体 (PBI121-GFP)及BjCRPl (pBI121-BjCRPl-GFP)转基因植株叶片，接种于TQ分化培养基(附 加有200iiM/L CdCl2)上，每瓶接种10片，各接种3瓶，25°C，16h/d光照培养。约35d (天) 后，计算分化苗个数(图14)。图14(a)示例在无Cd胁迫条件下，空载体与BjCRPl转基因烟草外植体再生苗无 明显差异，而在200PM/L CdCl2胁迫条件下，BjCRPl过表达烟草再生苗明显多于对照。图 14(b)示空载体与BjCRPl转基因烟草再生苗在正常和Cd胁迫条件下的统计分析。在正常 培养条件下，对照与BjCRPl转基因烟草再生苗数无差异(t检测，p > 0. 05)，而在Cd胁迫 条件下，BjCRPl转基因烟草再生苗数显著高于空载体对照生苗(t检测，p < 0. 01)。重金属和盐胁迫条件下转基因植株的抗性分析分别剪取约1cm2的空载体 (PBI121-GFP)及BjCRPl (pBI121-BjCRPl-GFP)转基因植株叶片，接种于I；分化培养基上， 25V，16h/d光照培养。待再生植株长至2-3cm时挑选整齐一致的再生苗，分别接种于1\， Tl+200 u M CdCl2和Tl+250mM NaCl生根培养基，每瓶接种4-5棵，各接种3瓶。15天后观 察长势和生根情况(图15)。图15示例在重金属CdCl2和NaCl胁迫条件下，BjCRPl转基因烟草长势生根情况 明显优与空载体对照。过表达BjCRPl烟草在胁迫条件下，根部已有许多根再生，空载体对 照几乎无根再生出。在正常培养条件下，二者无明显差异，根部均有大量根生出。说明过表 达BjCRPl明显提高了转基因烟草的抗重金属Cd和高盐NaCl的胁迫能力。
权利要求
一种植物抗逆性相关膜蛋白BjCRP1，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种植物抗逆性相关基因，其特征在于，编码权利要求1所述的膜蛋白BjCRPl。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示 o
4.包含权利要求2所述基因的重组载体。
5.根据权利要求4所述重组载体，其特征在于，所述载体为pET32a-BjCRPl。
6.权利要求1所述蛋白在提高植物抗重金属、抗盐、抗旱方面的应用。
7.权利要求2所述基因在提高植物抗重金属、抗盐、抗旱方面的应用。
8.一种提高植物抗重金属、抗盐、抗旱的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求 2所述基因转入植物、并表达的步骤。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗逆性相关膜蛋白BjCRP1及其基因和应用。根据本发明的植物抗逆性相关膜蛋白BjCRP1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。BjCRP1基因的表达能使重组菌株和植物同时获得显著的抗重金属(CdCl2)和抗高盐(NaCl)特性，目前功能显著的既抗重金属又抗高盐的植物基因还少有报道。该抗性的证明为BjCRP1基因在植物抗逆基因工程中的应用提供了基础，将在培育综合抗逆性(重金属和/或高盐/或/干旱)增强的植物(小麦、玉米、水稻和蔬菜)中发挥重要作用。
文档编号C12N15/63GK101851284SQ20101017191
公开日2010年10月6日 申请日期2010年5月7日 优先权日2010年5月7日
发明者杨学举, 郎明林, 郝梦雨 申请人:河北农业大学