专利名称：一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因及其抗低温应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属分子生物学与基因工程领域，具体涉及一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋 白的基因克隆及其应用。
背景技术：
干旱、盐渍和低温都能引起植物水分亏缺，在这期间植物细胞积累一系列的蛋 白质来保护细胞免受脱水伤害。环境胁迫除了引起代谢变化和低分子量保护性化合物 的积累外，植物的许多基因可被激活转录，并导致植物营养组织中新蛋白的积累，特别 是植物干旱、低温诱导蛋白的研究已受到普遍关注，其中胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundantprotein，LEA)是指胚胎发育后期种子中大量积累的一系列蛋白 质，其具有亲水性和热稳定性，广泛存在于高等植物中，且受发育阶段、脱落酸(ABA) 和脱水信号的调节，因此成为当前在逆境研究方面的一个重要课题。LEA蛋白是一类亲水性大家族，共同特点是由极性氨基酸组成，为亲水性的多 肽，甘氨酸含量>6%，亲水指数>1.0，大多数LEA蛋白缺乏半胱氨酸和酪氨酸残基。 根据LEA蛋白氨基酸序列同源性和特定的序列单元，LEA蛋白被分为6组。由于各组 LEA蛋白序列和可能的蛋白质结构不同，每一组LEA蛋白在水分胁迫下有不同的功能。LEA蛋白表达受发育阶段控制，但它们也能在施加外源ABA的离体胚中表达， 许多营养组织在外源ABA、渗透和低温胁迫的诱导下能产生特异的LEAmRNA和LEA蛋 白。LEA蛋白表达无组织特异性，可以在转录水平上被ABA、高渗透浓度和水分胁迫所 诱导。植物在受到干旱胁迫时，LEA基因的高水平表达和LEA蛋白的大量积累，表明 LEA具有干旱保护功能。种子在自然成熟过程中发生自燃的干化作用，LEA蛋白的作用 是保护种子细胞免受由干化引起的伤害，并且在部分种类耐受寒冷冻的生理作用中具有 重要意义。LEA蛋白最显著的物理化学特性是具有很高的亲水性和热稳定性，即使在煮沸 条件下也能保持水溶状态，同时可能形成一种离子载体为那些即将干化失水的组织细胞 中的离子凝结/结晶作好准备。在干旱脱水过程中细胞液的离子浓度会迅速升高，高强 度的离子浓度会造成细胞的不可逆伤害。第3组LEA蛋白中的11个氨基酸残基组成的 基元序列可形成兼性a2螺旋结构，提供一个具疏水条区的亲水表面，螺旋的疏水面可形 成同型二聚体，处在亲水表面的带电基团可鳌合细胞脱水过程中浓缩的离子，如Na+和 P03+。此外，组成该蛋白的大多数氨基酸残基为碱性、亲水性氨基酸，无半胱氨酸和色 氨酸，这些高电荷的氨基酸残基可以重新定向细胞内的水分子，束缚盐离子，从而避免 干旱胁迫时细胞内高浓度离子的累积所引起的损伤，同时也可防止组织过度脱水。目 前，在多种植物中都有关于第3组LEA蛋白或基因的研究报道，这些基因的表达或蛋白 累积与植物的渗透胁迫抗性呈正相关。萌芽3天的大麦幼苗经ABA或干旱处理后，幼苗 的所有器官中均有高水平的HVAl mRNA和蛋白质出现，它可被干旱等环境胁迫和ABA 诱导表达。Xu等将HVAl cDNA全序列导入水稻，获得了抗旱、抗盐的转基因水稻，从而直接证实了第3组LEA基因可能具有干旱保护功能。LEA广泛存在于高等植物种子中，首先是在棉花中被发现，后来相继在大麦、 胡萝卜、小麦、大豆、番茄和向日葵植物中检测到此类蛋白。在众多的研究中，并没有看到在多抗植物腊梅中有关LEA的相关报道，而腊梅Chimonanthus praecox作为一种具有多抗特性的物种，对外界环境的适应能力比较
强，并且腊梅耐旱、耐寒、病虫害较少，在腊梅中一定存在多抗基因。发明人利用本实 验室构建的腊梅花ESTs序列，从腊梅花cDNA文库中克隆了胚胎发育晚期丰富蛋白基因 (CpLEA3)。构建了腊梅LEA基因的表达载体，使表达菌株表达该基因的编码蛋白，通 过低温胁迫后测菌落生物活性以及细胞膜通透性损伤情况，发现CpLEA3基因能提高菌 株的抗低温能力，因而本发明具有创新性。
发明内容
(1)提供一种DNA序列，其编码一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因，命 名为CpLEA3; (2)提供一种利用基因工程方法得到CpLEA3编码的蛋白；(3)提供 CpLEA3在菌株抗低温基因工程方面的应用。本发明提供了 CpLEA3基因，它具有如序列表中SEQ IDNO : 1所示的核苷酸序 列。从腊梅花冠cDNA文库中，利用PCR方法筛选克隆出CpLEA3基因利用 RNAiso Reagent (购自大连Takara公司)提取腊梅花冠总RNA，按照SMARTTM cDNA Library Construction Kit合成腊梅花冠cDNA文库，随机挑取1000个文库克隆测序和生物
信息学分析，获得腊梅花ESTs序列。从腊梅花ESTs序列中，发现编码CpLEA3的cDNA 序列，根据此序列设计上下游引物，并以腊梅花cDNA文库为模板进行PCR扩增，克隆 出CpLEA3的全长基因。CpLEA3的基因由288个碱基组成，含有一个完整的开放阅读框架，为序列表中 的SEQ IDNO 1序列。开放读码框的起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。本发明还提供了由CpLEA3基因序列编码的蛋白，其具有序列表中SEQ ID NO: 2中所示的氨基酸序列，是含有95个氨基酸残基，其理论分子量大小为 10.4129kDa,预测等电点为9.98。根据软件分析，CpLEA3蛋白前41个左右氨基酸为叶 绿体运输肽，从第4个到第25个氨基酸为跨膜结构域，该蛋白为稳定蛋白。重组原核表达载体含有CpLEA3基因，重组原核表达载体转化的宿主细胞为大 肠杆菌。如实施例二所述，还可利用基因工程的方法，在高效大肠杆菌表达系统中表达 出具有生物活性的CpLEA3蛋白。关于在菌株抗低温基因工程方面的应用CpLEA3基因在菌株抗低温基因工程方面的应用，包括低温胁迫阳性克隆菌株和 空载菌株后观察菌株生物活性以及阳性克隆菌株和空载菌株细胞膜通透性。通过低温胁 迫，阳性克隆菌株存活率比空载菌株高约20%。通过电导率测定，阳性克隆菌株细胞膜 损伤程度仅为空载菌株的55%，阳性克隆菌株细胞膜遭到破坏的程度比空载菌株小，说 明CpLEA3基因能提高菌株的抗低温能力。
本发明的有益效果在于提供了一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因(CpLEA3) 及蛋白，构建了原核表达载体，并将验证正确的原核表达载体转入BL21表达菌株中诱导 表达，通过低温胁迫后测菌落生物活性及菌株细胞膜通透性，分析CpLEA3基因可提高 菌株抗低温的能力。
图1为以腊梅花冠cDNA为模板，PCR扩增电泳图其中M:marker 自上到下大小为1500bp、lOOObp、750bp、500bp、250bp、 IOObpl、2 目的条带图2为CpLEA3原核表达载体的构建过程示意图
图3为SDS-PAGE原核表达全蛋白电泳图其中M:Marker 从上至下为 97、66、43、31(kDa)1、2 含有重组克隆质粒pET-32a::CpLEA3的BL21宿主菌全蛋白CK 含有空载体质粒pET_32a的BL21宿主菌全蛋白图4为低温胁迫后菌株细胞活力平板菌落示意图其中pET32a 空载菌株；pET32a_CpLEA3 转基因阳性克隆菌株CK pET32a 和 pET32a_CpLEA3 未做低温胁迫处理24h pET32a 和 pET32a_CpLEA3 在-20°C 胁迫处理 24h48h pET32a 和 pET32a_CpLEA3 在-20°C 胁迫处理 48h72h pET32a 和 pET32a_CpLEA3 在-20°C 胁迫处理 72h图5为低温胁迫后菌株细胞活力曲线6为-20°C低温胁迫60min后菌株细胞膜通透性的差异示意图其中pET32a 空载菌株；pET32a_CpLEA3 转基因阳性克隆菌株
具体实施例方式实施例一克隆CpLEA3基因1.提取 RNA:取500mg腊梅花冠用RNAiso Reagent提取腊梅花总RNA。2.构建 cDNA 文库取总RNA，按照 SMARTTM cDNA Library Construction Kit 合成腊梅花 cDNA 文 库，随机挑取1000个文库克隆测序和生物信息学分析，获得腊梅花ESTs序列。3.CpLEA3基因片段的克隆根据腊梅花ESTs序列中找出的编码CpLEA3的cDNA序列，设计上下游引物， 并以腊梅花cDNA文库为模板进行PCR扩增。特异性引物如下CpLEA3-Pl 5' -CGGGATCCATGGCTCGCTCTCTGTTG-3，，斜体碱基为 BamH I酶切位点；CpLEA3-P2 5，-CGAGCTCGTGGTTACGGAATTTCTGGG-3，，斜体碱基为 SacI酶切位点。
克隆PCR反应条件为94°C预变性3min ； 94°C变性50sec ； 54°C退火30sec ； 72°C延伸lmin，30个循环；72°C延伸lOmin。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在 288bp位置上有一特异性的条带(图1)。按常规方法将片段克隆到pMD18-T Vector (购 自大连Takara公司)中，并经上海生物工程公司进行测序。CpLEA3基因的序列分析经测序该基因cDNA序列开放阅读框包含288bp，含有一个完整的开放阅读框 架，为序列表中的SEQ IDNO 1序列。编码95个氨基酸，具有序列表中SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列，分子量大小为10.41299kDa，预测等电点为9.98，结果表明获得 了全长基因的cDNA序列。利用 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Stracture/cdd/wrpsb.cgi)对该基因编码
的氨基酸进行保守区域分析，结果表明该蛋白属胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)。对 CpLEA3基因编码的氨基酸序列进行BLAST，显示的几乎都为LEA3家族，与已确定功能 的其他物种氨基酸序列进行进化分析和同源性分析CpLEA3与柑橘LEA基因编码的氨
基酸进化距离最近。利用SOPMA对CpLEA3进行二级结构预测，发现含有61.11 %的α螺旋(h)， 6.32%的延伸链(e)，31.58%的随机卷曲(c)。用TMpred软件对蛋白质结构进行分析， 预测该基因从第4个到第25个氨基酸为跨膜结构域。根据CHLOROP软件分析CpLEA3 前41个左右氨基酸为叶绿体运输肽，是稳定蛋白。实施例二 CpLEA3在菌株中的高效表达1.原核表达载体的构建为了表明CpLEA3基因的编码功能，将CpLEA3基因连接到pET_32a(+)的Sac I和BamH I位点之间，并转化大肠杆菌BL21，获得高效表达。设计并合成一对特异性引物5，-CGGGATCCATGGCTCGCTCTCTGTTG-3，，斜体碱基为 BamH I 酶切位 占.5，-CGAGCTCGTGGTTACGGAATTTCTGGG-3‘，斜体碱基为 Sac I 酶切位
点ο按分子克隆常规实验程序，用PCR的方法扩增出两端带有特定酶切位点的基 因编码序列，将基因和载体pMDIS-T(购于上海鼎国生物公司)连接，验证正确。取 pMD18::CpLEA3质粒和pET_32a(+)质粒(购于上海鼎国生物公司)分别用BamHI、Sac I双酶切、再连接(构建过程见图2)，将连接产物转化大肠杆菌BL21菌株(购于凯基生 物公司)中，并用含lOOug/ml Amp的LB培养基筛选重组子。经质粒酶切鉴定和PCR鉴 定后，将连接正确的重组子进行测序，证明插入载体的DNA序列的阅读框架是正确的。 将构建成带有CpLEA3基因的表达载体，命名pET-32a::CpLEA3，用于诱导表达分析。2.原核表达将含有pET-32a::CpLEA3重组子的菌株，接种于LB培养基(1L 蛋白胨10g， 酵母提取物5g，NaCLlO克)，37°C培养至菌液OD6tltl = 0.4-0.6。将BL21重组表达菌 株研磨及超声破碎，我们得到了含有重组克隆质粒pET-32a::CpLEA3的BL21宿主菌粗酶 液。进行12% SDS-PAGE电泳检测，从图3中可以看出，CpLEA3基因在BL21菌株中高效表达。实施例三低温胁迫后菌株细胞活力测定分别取阳性克隆和转空载体菌株的单菌落于5mL含100 μ g/mLAmp的LB液体 培养基中，37°C、200r/min振荡培养至OD6tltl为0.5，加入IPTG至终浓度lmmol/L，继 续培养3h。分别分成2份，第1份稀释10000倍后涂于含100 μ g/mL Amp的LB培养 基上，在37°C培养过夜；第2份分别吸取ImL在-20°C进行24h、48h和72h低温胁迫处 理，处理后分别稀释10000倍后涂于含100 μ g/mL Amp的LB培养基上，37°C培养过夜。 分别在次日统计菌落数(如图4)，以胁迫后生长的菌落数与未胁迫对照组比值来计算存 活率(如图5)。存活率=(胁迫后生长的菌落数/未胁迫对照组生长的菌落数)X 100%结果表明低温胁迫下阳性克隆菌株存活率明显高于空载菌株，24h后阳性克 隆菌株存活率比空载菌株高21.19%，48h后阳性克隆菌株存活率比空载菌株高19.61%， 72h后阳性克隆菌株存活率比空载菌株高20.02%，说明CpLEA3基因能提高菌株的抗低 温能力。实施例四低温胁迫后菌株细胞膜通透性测定采用电导率法测定，分别挑取阳性克隆和转空载体菌株的单菌落于5mL含 100 μ g/mL Amp的LB液体培养基中，37 °C、200r/min振荡培养至OD6tltl为0.5，加入 IPTG至终浓度lmmol/L，继续培养3h。将诱导表达的阳性克隆和转空载体的菌体用去 离子水悬浮至l*109du/mL，分别将其在_20°C下处理60min后，取IOml菌体悬浮液离心 (4000g, IOmin),上清液用于测定电导率Α。菌体再用IOml去离子水悬浮，置于100°C 下煮15min后，离心(4000g，IOmin)，上清液用于测定电导率B。相对电导率=(电导率A/电导率A+电导率B) X 100%结果表明(如图6)低温胁迫下阳性克隆菌株电导率仅为空载菌株的55%，说 明转CpLEA3基因阳性克隆菌株细胞膜遭到破坏的程度明显小于空载菌株，该基因可以 提高菌株的抗低温能力。
权利要求
1.一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因，其特征在于它具有序列表中SEQID NO 1所示的核苷酸序列。
2.—种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白，其特征在于它是由权利要求1所述的一种腊梅胚 胎发育晚期丰富蛋白的基因序列编码、具有序列表中SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。
3.—种重组原核表达载体，其特征在于含有如权利要求1所述的一种腊梅胚胎发育晚 期丰富蛋白的基因。
4.一种用权利要求3的重组原核表达载体转化的宿主细胞为大肠杆菌。
5.权利要求1所述的一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因，在菌株抗低温基因工程 方面的应用。
全文摘要
一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因及其抗低温应用属分子生物学与基因工程领域，本发明提供了一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因和蛋白，同时提供了基因相应的表达载体和宿主细胞，本发明的有益效果在于一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因的应用，能提高菌株的抗低温能力。
文档编号C12N15/70GK102010869SQ201010155358
公开日2011年4月13日 申请日期2010年4月26日 优先权日2010年4月26日
发明者刘金亮, 张世宏, 张莉弘, 谢丽霞, 阳晓红, 陈宣明, 高文 申请人:吉林大学