专利名称：鉴别内源性和外源性禽白血病病毒的三重pcr试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种鉴别禽白血病病毒的试剂盒，尤其涉及一种能同时鉴别内源性和 外源性禽白血病病毒的三重PCR试剂盒，属于禽白血病病毒的检测领域。
背景技术：
禽白血病(Avian leukosis，AL)是由反转录病毒科甲型反转录病毒属禽白血病病 毒(ALV)引起的禽类造血组织中某些细胞成分过度增生的肿瘤性疾病(赵振华，杨玉莹，成 子强.禽白血病[M].北京中国农业出版社，2006 :11_12.)。虽然该病的死亡率较低，但该 病的持续感染将导致鸡群的免疫抑制和生产力下降，从而严重损害鸡群的经济价值。根据致病性和感染宿主的不同，ALV可划分为A-J 10个亚群(靳艳玲，罗薇.禽 白血病研究进展[J].西南民族大学学报，2005，24(4) :44-46)，仅A-E和J亚群从鸡分离 到，其余亚群见于其他鸟类。其中A-D为外源性ALV，主要感染蛋鸡，A、B亚群主要诱发鸡 的淋巴细胞白血病，C、D亚群在田间极为少见；E-I亚群为内源性ALV，主要感染野生狩猎 禽类(杨玉莹.J亚群禽白血病病毒研究进展[J].中国病毒学，2003，18(1) :93-97)，其中 E亚群是整合在鸡基因组中的一种前病毒序列，在鸡中普遍存在J亚群具有独特的亚群特 异性，主要引起肉鸡的髓细胞瘤，近年来蛋鸡感染ALV的报道逐渐增多。外源性ALV能诱 发肿瘤，可垂直和水平传播，而内源性ALV的致瘤性虽然很低且不能产生传染性病毒粒子， 但与外源性ALV的重组可能导致高致病性毒株的产生(Bai L. N. Payne, and M. A. Skinner. HPRS-103(exogenous avian leukosis virus, subgroup J)has an env gene related to those of endogenous elements EAV—Oand E51 and an E element found previously only in sarcoma viruses [J]. Virol, 1995,69(5) :779_784)。因此内外源性 ALV 的鉴别诊断对 评估AL的致病性具有积极的意义。禽白血病是严重危害养禽业的重要疫病之一，不同品种品系的鸡群均可感染ALV， 造成性成熟推迟，产蛋率、蛋重、受精率和孵化率等生产性能下降，更为严重的是，禽白血病 会损害机体的免疫系统，并且长期带毒，造成本病的进一步传播(李新华.禽白血病流行病 学特点及防制措施[J].养禽与禽病防治，1997，20 (4) :11_12.)。近年来的报道已经证实马 立克氏病等禽类疫苗中混合感染ALV-A和ALV-E的情况时有发生(Marsh J, Bacon L,Fadly A, et al. Effect serotype 2 and 3 Marek' s disease vaccines onthe development of avian leukosis virus-induced pre-neoplastic bursal follicles[J]. Avian Diseases，2005，39⑷43_45.)，且在黄热病和麻疹等人用疫苗内也发现了 ALV的污 染(Althaf I, Jeffrey A, Marcos D, et al. Identificationand characterization of avian retroviruses in chicken embryo-derived yellowfever vaccines[J]. Virology, 2003,77(2) : 1105-1111.)，尽管内源性ALV污染的危害尚待进一步证实，但外源性ALV与 疫苗来源细胞内的内源性ALV的基因重组，很可能加速ALV囊膜蛋白的变异速度(Althaf I，JeffreyA，Marcos D，et al. Identification and characterization of avian retroviruses inchicken embryo-derived yellow fever vaccines[J]. Virology,2003,77(2) :1105-1111.)。由于ALV亚群和毒株的多样性、相关内源性病毒的广泛存在，使本病 的检测和净化很难取得理想的效果。ALV的检测方法已有多种，包括酶联免疫吸附实验ELISA(曹克昌，司树晖，祝俊 杰.应用ELISA检测种鸡白血病病毒群特异性抗原[J].中国兽医杂志，1999，25 (12) 19.)、PCR(何爱飞，徐春志，雷云.蛋鸡血管瘤型禽白血病的诊断[J].动物医学进展，2009， 30(1) 112-115.罗明星，周碧君，李永明.禽淋巴细胞白血病的诊断与病毒亚群鉴定[J]. 中国动物检疫，2009，26 (3) :55-57.)、琼脂扩散试验等(张晶.禽白血病抗原琼脂扩散试验 应用的研究[M].中国畜禽传染病，1987:17-19.)。但均不能排除内源性ALV的干扰，不能 鉴别检测内、外源性ALV感染。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种能同时鉴别内源性和外源性禽白血病病毒的三重 PCR试剂盒；本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种能同时鉴别内源性和外源性禽白血病病毒的三重PCR试剂盒，包括DNA聚合 酶，dNTP，引物，PCR缓冲液，双蒸水；所述的引物由3对引物组成，其中，第1对引物的序列 为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示，第2对引物的序列为SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4 所示，第3对引物的序列为SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示。为了达到更好的检测效果，优选的，本发明试剂盒还包括有阳性对照质粒1、阳性 对照质粒2、阳性对照质粒3和1个阴性对照；其中，所述的3个阳性对照质粒的制备方法包括(1)以禽白血病病毒RAV-1株的 cDNA为模板，以SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2为引物进行PCR扩增，得到793bp的扩增产 物，回收并纯化后克隆至PMD18-T载体，得到阳性对照质粒1 ;(2)以禽白血病病毒RAV-1株 的cDNA为模板，以SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4为引物进行PCR扩增，得到387bp的扩增 产物，回收并纯化后克隆至PMD18-T载体，得到阳性对照质粒2 ； (3)以感染内源性ALV的鸡 胚基因组DNA为模板，以SEQ IDN0 5和SEQ ID NO 6为引物进行PCR扩增，得到234bp的 扩增产物，回收并纯化后克隆至PMD18-T载体，得到阳性对照质粒3。所述的阴性对照可以是水；所述的DNA聚合酶优选为rTaq DNA聚合酶；本发明试剂盒在检测或鉴别内源性和外源性禽白血病病毒的应用25 u L PCR反应体系含有rTaq DNA聚合酶2. 0u ；PCR缓冲液2. 5 ii L ； dNTP(2. 5mmol/L)2ii L ；引物 SEQ ID NO :1 禾口 SEQ ID NO :2 各 12pmol、引物 SEQ ID N0:3 禾口 SEQ ID NO :4 各 5pmol、引物 SEQ ID NO :5 和 SEQ IDN0 :6 各 2. 5pmol ；待检测的样品模板 2 li L0PCR 反应程序为95 °C lOmin ；94 °C lmin，50 °C lmin，72 °C 40s, 30 个循环； 72°C lOmin。如果从待检测的样品中扩增到了 793bp的扩增产物，则该检测样品为禽白血病病 毒；如果从待检测的样品中同时扩增到了 793bp和387bp的扩增产物，则该检测样品为外源 性禽白血病病毒；如果从待检测的样品中同时扩增到了 793bp和234bp的扩增产物，则该检测样品为内源性禽白血病病毒。本发明根据ALV各亚群共有的p27基因和决定ALV亚群特异性的env基因序列设 计引物，得到了 ALV的通用并鉴别内、外源性ALV的三重PCR试剂盒；采用本发明多重PCR试 剂盒可在同一反应体系中同时检测出是否有ALV感染，并对内、外源性ALV进行鉴别，具有 较高的特异性和敏感性，可以为鸡群或鸡胚的ALV感染快速和早期诊断提供有效的工具。
图1本发明三重PCR试剂盒的特异性检测；1、RAV-1-CDNA和ALVE-DNA ； 2 RAV-1-cDNA ；3 :ALVE_DNA ；4 :REV_cDNA ；5 :IBDV-cDNA ；6 阴性对照；7 阳性对照；M :DL 2000Markero图2本发明三重PCR试剂盒的敏感性检测；1-9 浓度分别是lOOng/iiLUOng/ li L、lng/ u L、lOOpg/ u L、10pg/ u L、lpg/ u L、0. lpg/ u L、0. Olpg/ u L and 0. OOlpg/ u L ； 10 阳性对照；11 阴性对照；M :DL 2000Marker。图3现地样品的三重PCR检测；1 肝；2 脾；3 肾； 阴性对照；M :DL 2000Markero图4鸡胚样品的三重PCR检测；1-10 鸡胚样品；11 DL 2000Markero
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。1材料和方法1. 1病毒株和主要试剂A亚群ALV标准株RAV-1购自中国兽医药品监察所，网 状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis Virus, REV)、鸡传染性法氏囊病病毒 (Infectious bursal disease virus, IBDV)购自中国兽医药品监察所；无特定病原体 (SPF)鸡胚由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供；鸡胚成纤维细胞系DF-1细胞(购 自中国兽医药品监察所)；M-MLV反转录酶、rTaq DNA聚合酶、dNTPs、DNAMarker DL2000、 PMD18-T载体等均购自宝生物工程(大连)有限公司，胶回收试剂盒和病毒RNA提取试剂盒 均购自上海华舜生物技术有限公司，胎牛血清购自PAA公司。1. 2阳性对照重组质粒的构建参考文献(祝晓春，陈福勇，常建宇.禽成髓性白血病病毒P27和gag基因的克 隆[J] 2001，37 (8) 54-56.)合成群通用型引物 P-F 5 ‘ -CCATGCCTGTAGTGATTA-3 ‘ (SEQ ID NO 1), P-R 5' -CCCGACCCAGTTTGTCCAT-3‘ (SEQ ID NO :2)，扩增片段命名为 p27，长 793bp。根据RAV-1株的env基因的保守区设计外源性ALV特异性 弓I 物 A-R:5 ‘ -GACTTTACTGGCGGTCCTGA-3 ‘ (SEQ ID NO 3) , A-F 5' -CCCCACCTGTGAGCAGTTAT-3‘ (SEQ ID NO :4)，扩增片段命名为 ALVA，长 387bp。利用
4 肺；5 心；6 阳性对照；7 阳性对照；12:阴性对照；M:
5DF-1细胞增殖RAV-1种毒，培养7天后参照病毒RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，以反 转录产物RAV-1-cDNA为模板分别扩增p27和ALVA片段。p27PCR反应条件为95°C lOmin ； 94°C lmin，57°C lmin，72°C lmin，30 个循环；72°C lOmin。ALVAPCR 反应条件为 95°C lOmin ； 94 °C lmin,50°C lmin，72 °C 30s，30 个循环；72 °C lOmin。胶回收 p27 和 ALVA 片段，利用 PMD18-T载体构建重组质粒，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所基础与技术服务部测序， 重组质粒分别命名为pMD-p27和pMD-ALVA。根据ALV-E evl株(GenBank登录号AYO 13303)的env基因保守区，设计 内源性 ALV 特异性引物 E-F 5 ‘ -ACACCTGTGGAGATGTGCAG-3 ‘ (SEQ ID NO 5), E-R 5' -GATCCACGCCCCTGATG-3‘ (SEQ IDNO :6)，扩增片段命名为 ALVE，长 234bp。以 1 枚疑似 感染内源性ALV的鸡胚基因组DNA (命名为ALVE-DNA)为模板，PCR扩增ALVE。PCR反应条 件为 95°C lOmin ；94°C lmin, 60°C lmin, 72°C 20s，30 个循环；72°C lOmin。胶回收 ALVE 片 段，利用PMD18-T载体构建重组质粒，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所基础与技术服 务部测序，重组质粒命名为pMD-ALVE。1. 3三重PCR反应条件的优化1. 3. 1退火温度和引物浓度的优化25 u L反应体系中，以RAV-1-cDNA和ALVE-DNA ( 二者浓度均为lOOng/ u L)混合 物为模板，采用先固定引物对A-R/A-F的浓度，在lpmol/ii L-lOpmol/ii L之间调整引物对 E-R/E-F的摩尔量，同时将退火温度在48°C -62°C进行优化，每2°C递增。在此基础上进一 步优化引物对P-R/P-F的摩尔量及退火温度，最终确定三重PCR的最佳引物浓度比和退火温度。1.3. 2延伸时间的优化在1.3. 1的基础上，将三重PCR反应的延伸时间在20s (秒)、40s、60s、80s、100s、 120s进行优化，确定最佳延伸时间。1. 3. 3dNTP浓度的优化在1. 3. 1和1. 3. 2的基础上，将三重PCR反应体系中dNTP的终浓度在2. 5mmol/L、 5mmol/L、10mmol/L和20mmol/L进行优化，确定三重PCR的最佳dNTP浓度。1. 4三重PCR的特异性试验利用鸡胚成纤维细胞(CEF)增殖REV和IBDV，提取病毒感染细胞总RNA，反转录获 得 REV-cDNA 和 IBDV-cDNA。分别以 RAV-l-cDNA/ALVE-DNA 混合物、RAV-l-cDNA、ALVE_DNA、 REV-cDNA和IBDV-cDNA为模板，进行三重PCR。同时以3个重组质粒混合物和灭菌去离子 水为阳性和空白对照。1. 5三重PCR的敏感性试验将各含有lOOng/ ii L的RAV_l_cDNA和ALVE-DNA混合物用灭菌去离子水作10倍 倍比稀释，以不同浓度的DNA混合物(lOOng/ u L_0. OOlpg/ u L)为模板，进行三重PCR。1. 6三重PCR的初步应用采集现地一只疑似因感染ALV病死鸡的肝脏、脾脏、肾脏、肺脏和心脏，以及10枚 鸡胚，用三重PCR方法进行内、外源性ALV的鉴别检测。2实验结果2. 1重组质粒的建立
pMD-p27中的p27片段与外源性A亚群RAV-1、B亚群RAV-2株(K02374)、内源性 E亚群evl株的相同片段的核苷酸序列同源性分别为100%、99. 76%和98. 24% ；pMD-ALVA 中的ALVA片段与RAV-I株、RAV-2株和evl株的同源性分别为97. 6%、98. 6%和74% ； pMD-ALVE中的ALVE片段与ALV-E ev3株(AY013304)和evl株的同源性分别为99. 76%禾口 99. 28%，与RAV-I和RAV-2株的同源性均为54%。结果表明获得的p27、ALVA和ALVE基 因片段分别为ALV、外源性ALV及内源性ALV的保守片段。2. 2三重PCR最佳反应条件的确定
经过对各引物浓度、退火温度、延伸时间及dNTP浓度等的优化，确定在25 μ L PCR 反应体系中，含有 rTaq DNA 聚合酶 2. Ou ；dNTP (2. 5mmol/L) 2 μ L ；PCR 缓冲液 2. 5 μ L ；P-F 和 P-R 各 12pmol、A-R 和 A-F 各 5pmol、E-R 和 E-F 各 2. 5pmol ；模板 IOOngo 反应程序为 950C IOmin ；94°C lmin，50°C lmin，72°C 40s，30 个循环；72°C IOmin02. 3三重PCR的特异性试验RAv-1-cDNA和ALVE-DNA的混合物扩增出群特异性、内源性特异性和外源性特 异性条带793bp、234bp和387bp，RAV-1-cDNA仅扩增出793bp和387bp的特异性条带， ALVE-DNA仅扩增出793bp和234bp的特异性条带，而从REV-cDNA，IBDV-cDNA和空白对照 中均未扩增出任何条带。见图1。2. 4三重PCR的敏感性试验试验结果见图2，当RAV-1-cDNA和ALVE-DNA混合物的浓度均为0. Ipg/ μ L时仍可 得到清晰特异的条带。2. 5现地样品的检测用建立的三重PCR方法检测疑似感染ALV的病鸡组织样品和10枚鸡胚，结果表明 从肝、脾、肾和肺基因组扩增出了 p27、ALVA和ALVE的特异性条带(图3)，从心脏中未检测 到条带；而有9份鸡胚基因组扩增出了 p27和ALVE的特异性条带(图4)。
权利要求
一种能同时鉴别内源性和外源性禽白血病病毒的三重PCR试剂盒，包括DNA聚合酶，dNTP，引物，PCR缓冲液，双蒸水；其特征在于所述的引物由3对引物组成，其中，第1对引物的序列为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示，第2对引物的序列为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示，第3对引物的序列为SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示。
2.按照权利要求1所述的三重PCR试剂盒，其特征在于还包括有阳性对照质粒1、阳 性对照质粒2、阳性对照质粒3和1个阴性对照；其中，所述的阳性对照质粒1的制备方法 包括⑴以禽白血病病毒RAV-I株的cDNA为模板，以SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2为弓丨 物进行PCR扩增，得到793bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pMDIS-T载体， 即得；所述的阳性对照质粒2的制备方法包括以禽白血病病毒RAV-I株的cDNA为模板，以 SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4为引物进行PCR扩增，得到387bp的扩增产物，将扩增产物回 收并纯化后克隆至PMD18-T载体，得到阳性对照质粒2 ；所述的阳性对照质粒3的制备方法包括以感染内源性ALV的鸡胚基因组DNA为模板， 以SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6为引物进行PCR扩增，得到234bp的扩增产物，将扩增产物 回收并纯化后克隆至PMD18-T载体，得到阳性对照质粒3。
3.按照权利要求1所述的三重PCR试剂盒，其特征在于所述的空白对照是蒸馏水。
4.按照权利要求1所述的三重PCR试剂盒，其特征在于所述的DNA聚合酶为rTaqDNA 聚合酶。
全文摘要
本发明公开了一种能同时鉴别内源性和外源性禽白血病病毒的三重PCR试剂盒，其组成包括DNA聚合酶，dNTP，引物，PCR缓冲液，双蒸水；其特征在于所述的引物由3对引物组成，其中，第1对引物的序列为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示，第2对引物的序列为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示，第3对引物的序列为SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示。采用本发明多重PCR试剂盒可在同一反应体系中同时检测出是否有禽白血病病毒感染，并对内、外源性ALV进行鉴别，具有较高的特异性和敏感性，从而节省时间和试剂，可以为鸡群或鸡胚的快速和早期诊断提供有效的工具。
文档编号C12Q1/68GK101824489SQ20101015392
公开日2010年9月8日 申请日期2010年4月22日 优先权日2010年4月22日
发明者司昌德, 周刚, 韩凌霞 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所