专利名称：鉴别PRV gE缺失疫苗株和野毒株的试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明属于鉴别PRV的试剂盒，尤其涉及一种快速检测和鉴别PRV gE缺失疫苗株 和野毒株的环介导等温扩增试剂盒，属于PRV的检测领域。
背景技术：
PRV能引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状 的疾病。猪是PRV的贮存宿主和传染源，主要引起妊娠期母猪流产，死产、木乃伊胎；初生 仔猪多为急性致死性经过，具有明显的神经症状，死亡率几乎为100% ；成年猪多呈潜伏感 染。免疫接种是防治伪狂犬病的主要策略，我国目前应用比较多的是用Bartha-K61株制备 的弱毒疫苗。PRV弱毒疫苗虽然能有效地阻止感染后临床症状的出现，但接种猪仍可能被强 毒感染，感染能形成潜伏和随后潜伏感染的病毒能被激活和引起散播。因此，建立PRV的早 期快速鉴别基因缺失弱毒疫苗毒和野毒感染的抗原检测方法十分重要。PRV的抗原检测方法很多，如病毒分离、荧光定量PC R、胶体金抗原检测试纸条。但 病毒分离耗时费力，荧光定量PCR检测成本高且需要借助一些特殊的试验仪器的辅助才能 完成，胶体金抗原检测试纸条虽然快速但敏感性不高。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够快速检测和鉴别PRV gE缺失疫苗株和野毒株的环 介导等温扩增试剂盒，以解决现有技术存在的需要借助一些特殊仪器的辅助才能完成检 测，稳定性较差、操作麻烦、效率低、需低温保存、储运不方便的问题。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种快速检测和鉴别PRV gE缺失疫苗株和野毒株的环介导等温扩增试剂盒，其组 成成分包括等温反应混合缓冲液，DNA聚合酶，蒸馏水，引物混合物1和引物混合物2 ；其 中，所述的引物混合物1由3对引物按照等摩尔比组成，第1对引物的序列分别为SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2所示，第2对引物的序列分别为SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示， 第3对引物的序列分别为SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示；所述的引物混合物2由3对 引物按照等摩尔比组成，第1对引物的序列分别为SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8所示，第2 对引物的序列分别为SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10所示，第3对引物的序列分别为SEQ I D NO 11 和 SEQ ID NO 12 所示。其中，所述的等温反应混合缓冲液是2XU的等温反应混合缓冲液，包括以下组 分40mM Tris-HCl、20mM KCl,20mM(NH4)2SO4^O. 2 % TritonX-100, 5mM dNTP，5M 甜菜碱； 为了达到更好的效果，所述的等温反应混合缓冲液中还可以含有稳定剂和增强剂等其它成 分。所述的DNA聚合酶优选为Bst DNA聚合酶。为了达到更好的检测效果，本发明的试剂盒还可以含有PRV野毒的阳性对照 PRV-PMD 18T-gE质粒和PRVgE缺失疫苗株阳性对照质粒PRV_PMD18T_gG质粒；这两个质粒的构建方法如下首先合成PRV-GE基因和PRV-GG基因的引物，引物序列如下GE-FP :5，-CGGCTTCGACGTCTGGTT-3，；GE-RP 5’ -GCGGTCACGCCATAGTTG-3 ；gG-FP :5，-CGATGAAGTGGGCAACGTGG ATCCTC-3，；gG-RP 5’ -CGTCAGGCGGAGGCCACGTGGCGGTA-3’ ；以PRV野毒PRV-JX株(可以从市场上购买，例如中国兽医微生物菌种保藏管理 中心)和PRV弱毒PRV-Bartha株(可以从市场上购买，例如中国兽医微生物菌种保藏管 理中心)DNA为模板，PCR扩增目的片段，然后分别胶回收目的片段，克隆到PMD18T载体上， 然后转化DH5ci感受态细胞，筛选阳性菌落，摇菌扩增，质粒提取试剂盒提取目的质粒。构 建的质粒易保存，不具有感染性，无散毒的危险性，可以替代全病毒的DNA作为阳性模板；优选的，本发明检测试剂盒的各组成成分的体积及保存条件如下
编号I试剂盒组成体积(20T/40T)保存条件^
~ 2 XU-LAMP Mix750μ L/1500u L -20°C
~~2 Bst DNA 聚合酶60μ L/120u L-20°C
引物混合物 1(10X，检测 360uL/720 uL -20°C PRV野毒专用型引物)
~ 引物混合物 2 (检测 PRVgE 360uL/720 uL -2OV 缺失疫苗株和野毒株通用 引物)
~ 模板 1 (PRV-gE 质粒)60 μ L-2OV
~~6 模板 2 (PRV-gG 质粒)60 μ L-2OV
~~7 无核酸 ddH201000 μ L-20°C
~~8 反应管(100个)配管架200 μ L-20V进一步优选的，本发明试剂盒中各组分的体积为等温反应混合缓冲液的体积大 于或等于25 μ L，BstDNA聚合酶的体积大于或等于2 μ L，蒸馏水的体积大于或等于9. 0 μ L， 引物混合物1的体积大于或等于6 μ L，引物混合物2的体积大于或等于6 μ L0本发明试剂盒的检测方法，包括(1)提取待检测组织样品的DNA ；(2)首先进行野毒的检测检测体系各组分配比如下2XU-LAMP Mix12. 5μ L
引物混合物1 (10 X，检测PRV野毒专用型引物)6 μ LPRV-PMD 18T-gE 质粒或待检病毒 DNA1 μ LBst DNA 聚合酶1 μ L无核酸ddH204. 5 μ L每次待检样品都需设野毒的阳性对照(PRV-PMD18T-gE质粒为阳性对照)和不加模板的阴性水对照；多次使用，可以首次设阳性对照和阴性对照，以后可以不设阳性对照， 但阴性对照不能省略。将上述组分混勻，置于65°C恒温水浴箱中放置60分钟，80°C 10分钟灭活Bst DNA聚 合酶；扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳在紫外检测仪上检测或直接将扩增产物离心(5000转 离心10分钟)，观察管底沉淀；呈阳性反应的为野毒株，呈阴性反应的为弱毒疫苗株；(3)将经过检测不是野毒株的样品进行PRVgE缺失疫苗株弱毒的检测检测体系各组分配比如下25 μ L通用性引物检测体系各组分配比如下2XU-LAMP Mix12. 5μ L引物混合物2 (10 X，检测PRVgE_缺失疫苗株和野毒株通用引物)6 μ L模板2 (PRV-gG质粒)或待检病毒DNAIyLBst DNA 聚合酶1 μ L无核酸ddH204. 5 μ L将上述组分混勻，置于65°C恒温水浴箱中放置60分钟，80°C 10分钟灭活Bst DNA 聚合酶；扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳在紫外检测仪上检测或直接将扩增产物离心 (5000转离心10分钟)，观察管底沉淀；呈阳性反应的为PRVgE_缺失疫苗株；(4)结果判定4. 1琼脂糖凝胶电泳扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳在紫外检测仪上检测，阳 性反应能够观察到LAMP特征性阶梯状条带，而阴性反应则没有。4. 2离心法沉淀观察扩增产物5000转离心10分钟后，阳性反应在管底部有肉眼 可见的白色沉淀，而阴性反应则没有。本发明首先根据PRV参考毒株NC_006151株gE基因和gG基因的保守区序列设 计了引物，gE基因保守基因序列为PRV野毒所共有，而gE缺失疫苗株则没有。本发明采用 LAMP技术，特异性强，且比PCR检测方法有更高的灵敏度，但不需昂贵的PCR仪，只需普通的 金属浴或水浴箱即可，且结果可用凝胶电泳方法来观察，也可通过离心的方法来观察沉淀， 简单而快速，既可用于PRV野毒的检测，也可用于(PRV) gE_缺失疫苗株和野毒株的鉴别检 测，特别适合于基层兽医检测机构和规模化养猪场对于PRV的检测。本发明运用LAMP技术，根据中国境内使用的各种猪用PRV基因工程弱毒疫苗株均 缺失gE基因这一特征，成功建立了一种实用快速价格低廉的的PRV强弱毒鉴别检测方法， 为PRV感染的早期快速诊断提供了有力的诊断工具。
图1应用本发明试剂盒(PRV-GE-LAMP检测方法)对两株弱毒疫苗株和两株野毒株的检测结果；1. PRV-GE-LAMP检测PRV-JX野毒株；2. PRV-GE-LAMP检测PRV-HLJ野毒株；3. PRV-GE-LAMP 检测 PRV-Bartha 弱毒疫苗株；3. PRV-GE-LAMP 检测 PRV-Plus 株弱毒疫苗 株；5. . PRV-GE-LAMP 阴性对照。图2应用本发明试剂盒(PRV-GG-LAMP检测方法)对两株弱毒疫苗株和两株野毒 株的检测结果；1. PRV-GG-LAMP检测PRV-JX野毒株；2. PRV-GG-LAMP检测PRV-HLJ野毒株； 3. PRV-GG-LAMP 检测 PRV-Bartha 弱毒疫苗株；3. PRV-GG-LAMP 检测 PRV-Plus 株弱毒疫苗 株；5. . PRV-GG-LAMP 阴性对照。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。试验材料Bs tDNA聚合酶购自纽英伦生物技术(北京)有限公司；试验例1本发明试剂盒检测猪伪狂犬病病毒2株gE_缺失疫苗株和2株野毒株的 应用试验应用本发明试剂盒对中国境内使用最多的PRVgE_缺失疫苗株Bartha株和Plus株 和两株现地分离的野毒株JX株和HLJ株进行了检测。检测方法如下1、PRV-LAMP扩增反应液的制备在冰上溶解除酶以外的各种组分，混勻。每次先 进行野毒的检测，如果不是野毒可进行PRVgE-缺失疫苗株弱毒的检测。25 μ L野毒专用型引物检测体系各组分配比如下2XU-LAMP Mix12. 5μ L引物混合物1 (10 X，检测PRV野毒专用型引物)6 μ L模板1 (PRV-gE质粒)或待检病毒DNAIyLBst DNA 聚合酶1 μ L无核酸ddH204. 5 μ L每次待检样品都需设野毒的阳性对照和不加模板的阴性水对照，检测是否野毒感 染，引物用引物混合物1，如果模板浓度较低，可以加大模板的使用量，同时减少水的使用
Mo25 μ L通用性引物检测体系各组分配比如下2XU-LAMP Mix12. 5μ L引物混合物2(10Χ，检测PRVgE—缺失疫苗株和野毒株通用引物))6 μ L模板2 (PRV-gG质粒)或待检病毒DNAIyLBst DNA 聚合酶1 μ L无核酸ddH20 4. 5 μ L每次待检样品都需设阳性对照和不加模板的阴性水对照，检测是否是PRVgE-缺失弱毒疫苗株，用引物混合物2，如果模板浓度较低，可以加大模板的使用量，同时减少水的使
用里。2、等温扩增条件混勻，置于65°C恒温水浴箱中放置60分钟，80°C 10分钟灭活 Bst DNA聚合酶。扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳在紫外检测仪上检测或直接将扩增产 物离心(5000转离心10分钟)，观察管底沉淀。3、结果判定3. 1琼脂糖凝胶电泳扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳在紫外检测仪上检测，阳 性反应能够观察到LAMP特征性阶梯状条带。而阴性反应则没有。3. 2离心法沉淀观察扩增产物5000转离心10分钟后，阳性反应在管底部有肉眼 可见的白色沉淀，而阴性反应则没有。初步应用结果应用本发明试剂盒对中国境内使用最多的PRVgE-缺失疫苗株 Bartha株和Plus株和两株现地分离的野毒株(PRV-JX，PRV-HLJ)进行了检测(上述待检 测的毒株购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)检测结果表明，应用本发明试剂盒(PRV-GE-LAMP检测方法)对野毒PRV-JX株和 野毒PRV-HLJ株能够检出，出现LAMP特有的阶梯状条带，呈阳性反应结果；而PRVgE_疫苗 株PRV-Bartha株和PRV-Plus株不能检出，无阶梯状目的条带，呈阴性反应结果。检测结果 证明PRV-JX株和PRV-HLJ株为PRV野毒。应用本发明试剂盒(PRV-GG-LAMP检测方法)对野毒PRV-JX株和野毒PRV-HLJ株 能够检出，对PRVgE_疫苗株PRV-Bartha株和PRV-Plus株同样能够检出，出现LAMP特有的 阶梯状条带，呈阳性反应结果。结合PRV-GE-LAMP的检测结果可以判定PRV-Bartha株和 PRV-Plus株为PRV GE基因缺失疫苗毒。试验结果证明PRV-JX，PRV-HLJ为野毒株，而PRV-Bartha株和PRV-Plus株 为PRVgE_弱毒疫苗株；验证PRV-GE-LAMP检测方法为PRV野毒的特异性检测方法，而 PRV-GG-LAMP检测方法为PRV野毒和GE缺失弱毒疫苗株的通用检测方法，但通过二者联合 使用可以准确判定是PRV野毒还是GE缺失疫苗毒。
权利要求
一种快速检测和鉴别PRV gE缺失疫苗株和野毒株的环介导等温扩增试剂盒，其组成成分包括等温反应混合缓冲液，DNA聚合酶，蒸馏水，引物混合物1和引物混合物2；其特征在于所述的引物混合物1由3对引物组成，其中，第1对引物的序列分别为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示，第2对引物的序列分别为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示，第3对引物的序列分别为SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示；所述的引物混合物2由3对引物组成，其中，第1对引物的序列分别为SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示，第2对引物的序列分别为SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示，第3对引物的序列分别为SEQ ID NO11和SEQ ID NO12所示。
2.按照权利要求1所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于所述的引物混合物1 由3对引物按照等摩尔比组成，所述的引物混合物2由3对引物按照等摩尔比组成。
3.按照权利要求1所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于所述的等温反应混 合缓冲液是2XU的等温反应混合缓冲液，其包括以下组分40mMTris-HCl、20mM KC1、 20mM(NH4)2S04、0. 2% TritonX-100, 5mM dNTP 禾P 5M 甜菜碱。
4.按照权利要求3所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于所述的等温反应混合 缓冲液还含有稳定剂或增强剂。
5.按照权利要求1所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于所述的DNA聚合酶为 Bst DNA聚合酶。
6.按照权利要求1所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于还含有伪狂犬病病毒 野毒的阳性对照质粒或PRV gE缺失疫苗株阳性对照质粒。
7.按照权利要求1所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，各组分的体积为等温 反应混合缓冲液的体积大于或等于25 u L，DNA聚合酶的体积大于或等于2 u L，蒸馏水的体 积大于或等于9. 0 y L，引物混合物1的体积大于或等于6 u L，引物混合物2的体积大于或 等于6ii L。
全文摘要
本发明公开一种快速检测和鉴别伪狂犬病病毒(PRV)gE缺失疫苗株和野毒株的环介导等温扩增试剂盒，其组成成分包括等温反应混合缓冲液，DNA聚合酶，蒸馏水，引物混合物1和引物混合物2，所述的引物混合物1由3对引物组成，引物混合物2由3对引物组成。本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，特异性强，且比PCR检测方法有更高的灵敏度，不需昂贵的PCR仪，只需普通的金属浴或水浴箱，可用凝胶电泳方法来观察检测结果，也可通过离心的方法来观察沉淀，简单而快速，既可用于PRV野毒的检测，也可用于PRV gE缺失疫苗株和野毒株的鉴别检测，特别适合于基层兽医检测机构和规模化养猪场对于PRV的检测。
文档编号C12Q1/70GK101831506SQ20101014635
公开日2010年9月15日 申请日期2010年4月14日 优先权日2010年4月14日
发明者崔尚金, 张超范 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所