专利名称：与猪免疫性状相关的小rna分子标记与应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于家畜分子标记技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择的与免疫 性状相关的小RNA分子标记的克隆及应用。
背景技术：
miRNA(microRNA)是近年来发现的一类对生物生命活动起重要调控作用的小分子 非编码RNA，长度约为22nt，广泛存在于动、植物体中(Bartel，2004)。通过与靶mRNA特异 性的碱基配对结合引起靶mRNA的降解或者对其翻译过程进行抑制，从而实现对基因转录 后水平的调控。RNA科技的第二次革命，为人们提供了一种全新的角度来认识基因及其表达 调节的本质，促使生物学家重新思考和探索遗传信息的表达调控问题(姚成果和金由辛， 2004)。许多研究表明miRNA调控方式参与了生物体生长、发育，免疫调节及疾病发生等生 物学过程(龙茹等，2007)。对miRNA的深入研究，势必有利于我们对生物体生长、发育过程， 致病机制的理解，并为动植物的育种和疾病的诊断、治疗提供理论基础。miRNA与免疫系统的关系研究正在如火如荼地进行。目前对参与免疫调节的 miRNAs 只有 miR-146 和 miR-155 研究得较为清楚。Taganov 等(Taganov 等，2006)对 miR-146参与的免疫调节进行了深入研究，发现在人的单核细胞中miR-146a/b，miR-132, miR-155等是内毒素响应基因，能被一系列细菌组分及前炎症细胞因子诱导产生。启动子 分析表明miR-146a是NF_kB依赖型基因。证实了 TNF受体相关因子6和IL-1受体相关激 酶1基因是miR-146a/b的靶基因(Taganov et al.，2006)。对miR-155的研究显示其参 与免疫系统的调节作用，0’ Cornell等(2007)在用聚肌胞(Poly I :C)和IFN-0刺激鼠 源性巨噬细胞后，利用基因芯片检测miR-155差异表达，发现其是唯一受这两种因子刺激 后持续上调表达的miRNA。通过药理学方式抑制激酶JNK能阻止Poly I:C或IFN-0诱导 miR-155的生成，表明JNK通路调控诱导miR-155产生的信号(0，Connell et al.，2007)。由于对血细胞分化发育有影响的miRNA可能调节T细胞或B细胞发育，所以它们 可能直接或间接参与了机体的免疫调节。目前对造血系统miRNAs的研究较为广泛，发现 了一批与血细胞分化发育有关的miRNAs，但许多miRNAs停留在表达水平检测上。例如鼠 miR-181在B淋巴细胞中高表达，miR-142在B淋巴细胞和髓系细胞中高表达，miR-223在 髓系中高表达。miR-181在鼠骨髓造血干细胞中中等程度表达，随着向B系分化的过程明 显增加，而在向其他链系分化过程中没有变化。这些提示miR-181可能在血细胞分化过程 中起着重要作用(杨桂花等，2007)。目前对胸腺T淋巴细胞的分子发育机制的研究主要集 中于蛋白编码基因及相关的转录因子信号通路上，有关miRNA方面的研究较少，还尚未大 规模展开。Neilson等(2007)通过小RNA的cDNA文库克隆检测了小鼠不同发育阶段胸腺 T淋巴细胞(Dm、DN3、DN4、DP、CD4、CD8)中miRNAs的动态表达规律，结果显示T细胞的发 育受一系列miRNAs协调控制，miR-29c在胸腺T淋巴细胞Dm期呈显著下调表达(Neilson et al.，2007)。有研究显示，高含量miR-29c和miR-181可抑制TCL1原癌基因(引发最具侵略性的白血病)的表达，miR-29c、miR-181的表达与TCL1原癌基因的表达呈反比关系(Pekarsky et al. ,2006) ；Fabbri等(2007)。研究发现miR-29家族在肺癌中呈下调表达，并验证了 DNA甲基转移酶3a和3b是miR-29的靶基因(Fabbriet al.，2007) ；Mott等(2007)验证 抗凋亡Bcl-2家族一员的Mcl-1是miR-29b的靶基因(Mott et al.，2007)。因此我们推测 该miR-29家族可能抑制T细胞的发育分化。对miR-29c靶基因进行了预测和筛选，发现了几个参与T细胞发育活化的重要靶 基因，主要有IC0S和NFATC4基因等。IC0S基因主要作用是活化T细胞，能增强所有基本 的T细胞对外来抗原的反应。NFATc4基因，是T淋巴细胞受抗原刺激后产生细胞因子(如 IL-2)所需的转录因子，在免疫应答期对细胞因子基因转录调控起重要作用。NFAT不仅在 完全分化的T细胞中调节细胞基因的表达，而且在T细胞分化过程中也起着重要作用。因 此我们推测miR-29c可能抑制这些与T细胞活化直接相关基因的表达来调节T细胞发育活 化的。迄今为止，尚未见全面研究猪miR-29c基因功能的报道，而研究突变位点在群体 中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个非常有力的手段。所以申请人对 miR-29c的基因序列进行了多态研究和关联分析，以期能够发现它在免疫方面的功能。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，克隆猪免疫相关微小RNA miR-29c的前体 及侧翼序列，寻找该片段的突变位点，筛选一种与猪免疫性状相关的小RNA分子标记，利用 该分子标记作为猪的标记辅助选择的应用。本发明通过以下技术方案实现申请人:克隆得到与猪免疫性状相关的微小RNA miR-29c前体及侧翼序列，如序列 表 SEQ ID NO 1 所述。PCR扩增的miR-29c前体及侧翼序列全长为477bp，即如序列表SEQ ID NO :1所述 和附图2所示的核苷酸序列。在序列表SEQ ID NO 1的第289bp处有一个碱基突变(C289-T289)，该突变导致 NcoI-RFLP 多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism)。扩增miR-29c前体及侧翼序列，测序并检测C289-T289处碱基突变所用的引物序 列如下所示正向5'GGGTGGGAATCGTTCAAAGG 3'，反向5'CATCCATCTTCCAGGAGCCA 3'。本发明所述的小RNA分子标记的制备方法是在 miRBase (http //microrna. Sanger, ac. uk/sequences/)中下载人 / 鼠 miR_29c 前体序列，进NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)猪基因组数据库进行BLASTn比对，钓 取同源猪miR-29c基因的部分DNA序列(包括前体序列及侧翼序列，设计PCR引物，提取猪 基因组DNA，进行PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO :1所示的核苷酸 序列。应用常规的PCR-RFLP的方法对序列表SEQ ID N0 1所示的第289位碱基突变进 行了检测，并初步进行其基因型与猪的部分免疫性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。更详细的技术方案参见《具体实施方式
》。
序列表SEQ ID NO :1是本发明克隆的与猪免疫性状相关微小RNA miR-29c基因部分DNA序列。图1 本发明的技术流程图。图2 本发明中猪微小RNA miR-29c基因部分DNA序列，其中第289位碱基处的括 号内为等位基因的突变位点。图3 本发明中猪微小RNA miR-29c基因部分DNA序列测序发现的C289-T289的
等位基因突变。图4 本发明中猪微小RNA miR_29C基因的NcoI-RFLP的三种基因型(AAAB BB)电 泳图谱。M泳道为DNA分子量标准(DL2000)
具体实施例方式实施例1 (1)猪微小RNA miR-29c前体及部分侧翼DNA序列的扩增在miRBase (http://microrna. Sanger, ac. uk/sequences/)中下载人/ 鼠miR_29c 前体序列，进NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)猪基因组数据库进行BLASTn比对，钓 取同源猪miR-29c基因序列(包括成熟序列，前体序列和部分侧翼序列)，设计PCR引物，提 取猪基因组DNA，进行PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO :1所示的核 苷酸序列。其中，通过对miR-29c前体和侧翼部分序列(477bp)的扩增测序比对，于289bp 处发现了 1个碱基突变(C289-T289)，对此突变进行酶切分析，发现该突变恰好影响着内切 酶NcoI的识别。扩增miR-29c前体及侧翼序列，测序并检测C289-T289处碱基突变所用的引物序 列如下所示正向5'GGGTGGGAATCGTTCAAAGG 3'，反向5'CATCCATCTTCCAGGAGCCA 3'。(2) PCR产物的纯化、克隆和测序PCR扩增条件10uL的反应体系中加入DNA模板0. 5 μ L，双蒸水7. 5 μ L，10XPCR buffer 1 μ L, dNTPO. 3 μ L, IOmM 引物前后各 0. 3 μ L, Taq 酶 IU。PCR 反应条件为94°C预 变性5min后，94°C变性30s、54°C退火30s、72°C延伸30s，33个循环，最后72°C延伸5min。 PCR产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物的纯化在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放 入1. 5mL Ependorff管中，于65°C温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(购 自Promega公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在每300 μ L融化 的凝胶中加入ImL Resin试剂，混勻20s，将Resin/DNA混合物转移至带有吸附柱的离心 管，离心除去液体。再向吸附柱中加入80%的异丙醇2mL，离心除去液体，取下吸附柱装入 1. 5mL Ependorff管中，10，OOOg离心2min以干燥Resin，将吸附柱装入另一个干净的1. 5mLEpendorff管中，加入30 50 μ L灭菌水，静置lmin，10，OOOg离心20s，以洗脱DNA存于 Ependorff 管中。连接反应将纯化PCR产物与pGEM-T easy载体(购自promega公司)连接，连接 反应总体积是5 μ L，其中包括2. 5 μ L 2 XBuffer, 0. 5 μ L的T载体，1. 5 μ L的纯化PCR产 物，0.5yL的Τ4连接酶，置16°C水浴过夜。感受态细胞的制备从37°C培养了 16_20h的新鲜平板上挑取一个DH5 α单菌落 接种于2mL LB中，于37°C振荡培养3h，转接ImL菌液于含有30mLLB的盐水瓶中，继续在 37°C振荡培养约4h，待0D600达到0. 3-0. 4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15min， 然后将菌液转入离心管中于4°C 4，OOOg离心IOmin以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养 液，用IOmL冰预冷的0. lmol/L的CaC12重悬沉淀，冰浴30min，重复4°C 4，OOOg离心IOmin 一次，用4ml冰预冷的0. lmol/L的CaC12重悬沉淀，置4°C保存备用。
转化无菌状态下取100-120 μ L感受态细胞于1. 5mL Ependorff管中，将5 μ L的 连接产物加入混勻，在冰上放置30min，42°C热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后 冰浴3-4min，加入400 μ L无抗生素的LB液体培养基，37°C振荡培养45min。取100 μ L涂 布于已提前4h涂布了 IPTG(英文名称Isopropylthio-0-D-galactoside，中文名称异 丙基硫代- β -D-半乳糖苷，购自上海美季生物技术有限公司和X-gal的琼脂平板上，37°C 平放Ih后倒置培养。质粒的小量制备挑取平板上的单菌落，接种于2-3mL LB中，37°C 300r/min培 养6-8h。用1. 5mL EP管12000r/min离心数秒收集菌体。每管加入100 μ L用冰预冷的溶 液I [50mM葡萄糖，25mM Tris. Cl (pH8. 0)，IOmM EDTA (pH8. 0)]，涡旋振荡至菌体充分悬浮。 加入新配制的溶液II
200 μ L，快速颠倒混勻，冰浴 5min，然后加入预冷的溶液III [5M乙酸钾，冰乙酸11. 5mL，双蒸水28. 5ml] 150 μ L，混勻后 冰浴5min，12000r/min离心5min，将上清转至另一 EP管中，加入苯酚氯仿异戊醇(按 体积比为苯酚氯仿异戊醇=25 24 1)500 μ L，涡旋振荡，离心后小心吸取上层水 相，加入2倍体积的无水乙醇，_20°C沉淀30min，12000r/min离心5min，沉淀用70%乙醇洗 涤2次，抽干，加入含有RNA酶的TE (Tris乙酸盐-EDTA缓冲液，ρΗ7· 4) 20 μ L。重组质粒的酶切鉴定取3 μ L质粒DNA与适量的双蒸水混勻，使其总体积为 10 μ L，加入5U限制性内切酶EcoR I及IyL相应的IOX限制性内切酶反应缓冲液(购自 MBI公司)，轻弹管壁混勻并离心，置37°C水浴1-2小时，取2-3 μ L反应液于琼脂糖凝胶电 泳检测，酶切结果与预计完全相同者，即为目的重组质粒。重组质粒采用双脱氧末端终止法 在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由上海博道生物技术有限公司完成。在本实施例中，PCR扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的 PCR产物。将PCR产物回收纯化后克隆测序，测序结果显示PCR得到的DNA序列全长为 477bp，包括miR-29c成熟序列，前体序列及部分侧翼序列(如序列表SEQ ID N0:1所示)， 测序结果表明在该DNA序列的289bp处存在C289-T289突变，测序结果见图3所示。(3) DNA序列同源性检索鉴定通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，http://www. ncbi. nlm. nih. gov)网站的 BLAST (Basic LocalAlignment Search Tool)软件，将测序后获得的 DNA序列与 GenBank数 据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信肩、o( 二 ) PCR-RFLP诊断方法建立RFLP检测将PCR产物3 ii L，10 X Buffer 1 u L,限制性内切酶Ncol为 0.2iiL(2U)，加双蒸水补至10iiL，将样品混勻后离心，37°C培养箱放置12h，用1.5%琼脂 糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。用引物扩增猪基因组DNA得到了 477bp特异性扩增片段，序列分析结果表明在 289bp处存在C289-T289突变，并导致Ncol多态性。该基因突变位点由两个等位基因控制， 其中C是没有形成酶切位点的等位基因，T是形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可 组成三种基因型其中AA型为未发生酶切的纯合型(电泳检测时只有477bp —条DNA带)， BB型为发生酶切的纯合型(电泳检测时出现286bp和191bp两条DNA带)，AB为杂合型 (电泳检测时出现477bp、286bp和191bp三条DNA带)。实施例2 实验猪群来自广东华农温氏畜牧股份有限公司水台原种猪场的长白猪(为国外 猪种血缘)，父母代为17头长白猪公猪和36头长白猪母猪，子一代长白猪共302头仔猪，父 母代及子代全部进行了基因型检测，子代在0、17、32日龄采集抗凝血和非抗凝血，采用常 规方法对血常规和抗体水平进行检测。所分析的性状主要是免疫性状，包括猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)病毒抗体水 平、猪瘟病毒抗体水平、伪狂犬抗体水平及血常规18项。根据采集样品的群体结构，申请人 运用混合模型来统计分析猪微小RNA miR-29c基因SNPs位点的基因型效应及其与免疫指 标的关系Y = X ^ +Z Y +e其中Y为免疫性状测定值向量；X为固定效应关联矩阵；0为固定效应参数向量， 包括性别效应、胎次效应、线别效应、候选基因的基因型效应；Z为混合模型中的随机效应 的关联矩阵；Y为所有随机效应参数向量，包括公畜效应、公畜内母畜效应；e为随机残差 效应；采用SAS (Version 8. 1)软件中MIXEDM0DELS程序进行数据处理与统计分析。对猪miR-29c基因多态性位点基因型检测结果表明在355个个体中AA(TT)基因 型有112个，AB(TC)基因型有151个，BB(CC)基因型有92个。所分析的免疫性状有猪繁殖 与呼吸综合征(蓝耳病)病毒抗体水平、猪瘟病毒抗体水平、伪狂犬病毒抗体水平及血常规 18项，分别对302头仔猪在0、17、32三个日龄进行检测。所得到的相关性状是0日龄(出 生)的平均红细胞体积(MCV)，平均血红蛋白量(MCH)，平均血红蛋白浓度(MCHC) ；17日龄 的血小板分布宽度和32日龄猪瘟抗体阻断率和平均血红蛋白浓度(MCHC)。结果见表1-6。表1 :miR-29c基因多态性位点基因型与0日龄部分免疫性状的关联分析检测 *表示差异显著，P < 0. 05广表示差异极显著P < 0. 01 (以下表格中同)由表1可知miR-29c基因的SNP位点对0日龄的平均红细胞体积(MCV)，有显著 影响(p <0.05)，对0日龄的平均血红蛋白量(MCH)，平均血红蛋白浓度(MCHC)有极显著 影响(p < 0. 01)。此位点对其它免疫性状没有显著影响。对0日龄(出生)的平均红细胞体积(MCV)，平均血红蛋白量(MCH)，平均血红蛋 白浓度(MCHC)有显著影响的miR-29c基因的SNP位点基因型的最小二乘均数见表2 表2 SNPs位点(miR-29c)基因型平均RBC体积，平均HGB量，平均HGB浓度的最 小二乘均数 由表2可知，AB基因型的平均RBC体积显著高于BB基因型(p < 0. 05)，AB基因 型的平均HGB量极显著高于BB基因型(p < 0. 01)和显著高于AA基因型(p < 0. 05)，AB 基因型的平均HGB浓度极显著高于BB基因型(p<0.01)。AB基因型的0日龄(出生)的 平均RBC体积，平均HGB量，平均HGB浓度均为最高。表3 :miR-29c基因多态性位点基因型与17日龄部分免疫性状的关联分析检测 由表3可知miR-29c基因的SNP位点对17日龄血小板分布宽度相关联(p< 0. 05)，此位点对其他免疫性状没有显著影响。
对17日龄血小板分布宽度有显著影响的miR_29c基因SNP位点基因型的最小二乘均数见表4:
表4 :SNP位点(miR-29c) 17日龄PLT分布宽度的最小二乘均数
由表4可知，BB基因型的血小板(PLT)分布宽度极显著高于AB基因型(p< 0.01)，同时略高于AA基因型。因此B等位基因被认为是猪17日龄血小板(PLT)分布宽度的有利标记。
表5 :miR-29c基因多态性位点基因型与32日龄部分免疫性状的关联分析检测
由表5可知miR-29c基因的SNP位点对32日龄猪瘟抗体阻断率显著影响(p < 0. 05)，对32日龄平均血红蛋白浓度(MCHC)极显著影响(p < 0. 01)。此位点对其他免 疫性状没有显著影响。对32日龄猪瘟抗体阻断率和平均血红蛋白浓度(MCHC)显著影响的miR-29c基因 SNP位点基因型的最小二乘均数见表6 表6 SNPs位点(miR-29c)基因型32日龄猪瘟抗体阻断率和平均HGB浓度的最 小二乘均数 由表6可知，AB基因型的猪瘟抗体阻断率显著高于BB基因型(p < 0. 05)，而AA 基因型的平均血红蛋白(HGB)浓度极显著低于AB基因型(p < 0. 01)和显著低于BB基因 型(p < 0. 05)。因此B等位基因是猪32日龄猪瘟抗体阻断率和平均血红蛋白(HGB)浓度 的有利标记。参考文献1. Konstantin D. Taganov, Mark P. Boldin, Kuang-Jung Chang, and David Baltimore NF-k B-dependent inductionof microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses. PNAS 2006,103 (33) 12481-12486.2. D. Bartel. MicroRNAs Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell, 116(2) :281-297.3. Ryan M. 0' Connell,Konstantin D. Taganov,Mark P. Boldin,Genhong Cheng, and David Baltimore. MicroRNA-155 is induced during the macrophage inflammatory response. PNAS 2007,104(5) 1604-1609.4. Margaret S Ebert, Joel R Neilson & Phillip A Sharp. MicroRNA sponges competitive inhibitors of small RNAsin mammalian cells. Nature Methods 2007,4: 721-726.5. J L Mott, S Kobayashi, S F Bronk & G J Gores, mir-29 regulates Mcl_l protein expression and apoptosis. Oncogene 2007,26:6133-6140.6. Yuri Pekarsky, Urmila Santanam, Amelia Cimmino, Alexey Palamarchuk, Alexey Efanov, Vadim Maximov, Stefano Volinia, Hansjuerg Alder, Chang-Gong Liu, Laura Rassenti, George A. Calin, John P. Hagan,ThomasKipps and Carlo M. Croce. TellExpression in Chronic Lymphocytic Leukemia Is Regulated by miR—29 andmiR-181. Cancer Res 2006 ；66 (24). December 15，20067. Muller Fabbri，Ramiro Garzon，Amelia Cimmino，Zhongfa Liu, Nicola Zanesi, Elisa Callegari, Shujun Liu, Hansjuerg Aider， Stefan Costinean, Cecilia Fernandez-Cymering, Stefano Volinia，Gulnur Guler, Carl D. Morrison, Kenneth K. Chan, Guido Marcucci, George A. Calin, Kay Huebner, and Carlo M. Croce. MicroRNA-29 family reverts aberrant methylation in lung cancer by targeting DNA methyltransferases 3A and3B. Genetics 2007，104(40) 15805-15810.
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权利要求
一种作为猪标记辅助选择应用的与猪免疫性状相关的小RNA分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，在序列表SEQ ID NO1所示序列的第289位碱基处有一个C289-T289的碱基突变，导致RFLP-NcoI多态性。
2.扩增miR-29c基因的引物，它的DNA序列如下所示正向引物5 ‘ GGGTGGGAATCGTTCAAAGG 3 ‘，反向引物5 ‘ CATCCATCTTCCAGGAGCCA 3 ‘。
3.一种制备如权利要求1所述的分子标记的方法，按照以下步骤在miRBase中下载人/鼠miR-29c前体序列，在NCBI猪基因组数据库中进行BLASTn 比对，钓取同源猪miR-29c的前体序列及侧翼序列，设计PCR引物，所述的引物对的DNA序 列如下正向引物5‘ GGGTGGGAATCGTTCAAAGG 3'，反向引物5‘ CATCCATCTTCCAGGAGCCA 3 ‘；提取猪基因组DNA，进行PCR扩增，PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO 1所 示的核苷酸序列。
4.权利要求1所述的分子标记在猪标记辅助选择中的应用。
5.权利要求2所述的引物在猪标记辅助选择中的应用。
全文摘要
本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与免疫性状相关的小RNA分子标记及应用。所述的分子标记由猪微小RNA miR-29c前体及侧翼序列克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。在序列表SEQ ID NO1所示序列的第289位碱基处有一个C289-T289的碱基突变，导致RFLP-NcoI多态性。本发明还公开了获得上述分子标记的制备方法和多态性检测方法的应用，为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
文档编号C12N15/11GK101875973SQ20101013979
公开日2010年11月3日 申请日期2010年4月1日 优先权日2010年4月1日
发明者余梅, 曹建华, 朱猛进, 李新云, 李长春, 苏立杰, 赵书红, 黄菁 申请人:华中农业大学