专利名称：：一种具有增强免疫作用的桦褐孔菌胞内外混合粗多糖的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及一种具有增强免疫作用的桦褐孔菌胞内外混合粗多糖，该粗多糖在肿瘤的预防和治疗、体弱多病者的扶正，以及免疫功能低下等方面具有治疗作用，属于医药
技术领域：
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背景技术：
：桦褐孔菌Inonotusobliquus，国内还称为桦癌褐孔菌、斜生纤孔菌。也称Phaeoporusobliquus,Fuscoporiaobliqua,Chaga,Blackbirchtinder(tuchwood),birchmushroom,Kabanoanoanatake等。属担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、非裙菌目(Aphyllophorales)、刺革菌禾斗(Hymenoehaetaeeae)。桦褐孔菌的形态它的子实体呈现瘤状(不育性的块状物)，直径2540cm，深色，表面深裂，很硬，干时脆。孢子阔椭圆状至卵状，光滑，有刚毛(setae)。菌丝为二系菌丝系统，具有生殖菌丝和骨架菌丝。气生菌丝多为骨架菌丝，黄褐色，具有刚毛状菌丝和稀少刚毛；基内菌丝多为生殖菌丝，淡黄褐色，有隔，无锁状联合。分布桦褐孔菌的菌丝体极其耐寒是生长在寒带的木腐菌，生于白桦、银桦、榆树、赤杨等活立木的树皮下或砍伐后树木的枯干上，并能引起白桦、银杨、榆树、赤杨的白腐。其主要分布在北半球北纬45°50°的地区，如北美(北部)、芬兰、波兰、俄罗斯(西西伯利亚、远东部分地区、勘察加半岛)、中国(黑龙江、吉林省长白山地区)、日本(北海道)等国家生境。化学成分关于桦褐孔菌化学成分的研究已有许多报道，主要含有羊毛脂烷型三萜类、木质素类、黑色素类等。Lovyagina等最早从桦褐孔菌中得到一种含叶酸衍生物——蝶酰谷氮酸，以及芳香物质香草酸、丁香酸和一羟基苯甲酸；1961年和1962年Ludwiczalkt和Wrzclono分别报道从该菌中分离得到桦褐孔菌醇。IchimuraT还发现桦褐孔菌的水提取物中含有低分子量的多酚类。YamaguchiT从桦褐孔菌的水提取物中得到一种水溶性高分子量的有抑制HIV-I蛋白酶活性的木质素衍生物。何坚等还从桦褐孔菌中分离得到麦角留醇过氧化物、鞘氨脂类似物和甘露醇。Kukulyanslaya等发现天然的桦褐孔菌中的黑色素与人工培养的桦褐孔菌合成的黑色素的理化性质不同，并存在结构差异，规定天然合成的黑色素为异黑色素。IchimuraT等研究表明桦褐孔菌形成的黑色素属于1，1，3，4，4，6_六甲基-7-乙酰基-1，2，3，4-四氢萘吐纳麝香类，从它的碱性降解产物里鉴别得知含有P-羟苯酸。药理作用褐孔菌的主要药理作用为抗肿瘤作用，其中起主要作用的是三萜类化合物和多糖类化合物，同时还具有增强免疫作用。抗肿瘤作用据李英秀等报道，桦褐孔菌提取物在0.5-16.Ομg/ml范围内，对胃癌MGC-803细胞株的增殖均有抑制作用，并显示明显的量效关系。张慧丽等研究证明桦褐孔菌多糖在1.0-16.Oμg/ml范围内均能抑制肝癌SMMC7721细胞株的增殖，并表现出浓度依赖性关系。不同浓度间的抑制率均存在显著性差异。JaroszA等研究发现桦褐孔菌菌丝、菌核中的多糖有抑制细胞周期，调节酶cdc25和CdC2/CyClinB的作用。而Burczy报道桦褐孔菌菌丝体和培养基中的成分能对Hela细胞的M、G和Gz期有阻碍作用，同时有激活过氧化氢酶活性的作用，但这两种作用之间没有必然的联系。Galasinsk等认为从桦褐孔菌中分离的chaga组分，对癌细胞的蛋白质合成起抑制作用。Rzymowsk研究表明桦褐孔菌的水提取液能够抑制人类母体外子宫颈肿瘤细胞的生长，降低肿瘤细胞蛋白质数量和有丝分裂指数值，干扰肿瘤细胞新陈代谢，影响细胞周期中的8/G阶段。2007年陈才法等研究表明桦褐孔菌子实体水提取物能显著促进GO-Gl阶段肉瘤S180细胞的凋亡，能够刺激小鼠腹膜巨噬细胞分泌TNF-α，表明桦褐孔菌水提取物是通过保护脾淋巴细胞介导肿瘤凋亡和触发肿瘤细胞凋亡，实现抗肿瘤作用的。1999年韩国学者发现桦褐孔菌中含有的白桦脂酸具有很强的抗肿瘤活性，对293型癌细胞的抑制率达70%，且无毒副作用。此外，对恶性肿瘤患者进行放疗、化疗过程中服用含有桦褐孔菌的有效成分，可增强病人的耐受性，削弱因放疗、化疗而引起的毒副作用。增强免疫作用2002年RasinaLN发现桦褐孔菌子实体乙醇提物对wista鼠90Sr的定位及从体内导出有积极效果；能使连续2个月受0.025sGr/min射线体外照射的小鼠平均寿命延长，并且使血液中和关键性组织中的脂类过氧化物的氧化作用和血清的R-蛋白质保持在一定水平。陈才法等研究发现桦褐孔菌发酵液中的酚类化合物能够显著提高由环磷酰胺诱导的实验小鼠体重、脾脏指数的下降和外周淋巴细胞的生存能力。张慧丽等研究桦褐孔菌子实体不同提取成分对小鼠免疫功能的影响，表明桦褐孔菌子实体多糖能通过提高超氧化物歧化酶活性增强老龄大鼠机体的抗氧化能力，并且水提法得到的桦褐孔菌有效成分提高免疫力的作用最强。王伟等通过溶血空斑和单核巨噬细胞吞噬功能实验，发现桦褐孔菌子实体多糖对小鼠免疫功能有促进作用。张泽生等研究发现桦褐孔菌子实体多糖可显著提高健康小鼠免疫器官指数、吞噬指数和血清溶血素含量，表明桦褐孔菌子实体多糖有提高免疫器官功能的作用。Kim等研究发现，通过深层培养的桦褐孔菌产生的多糖可强烈激活与B淋巴细胞和巨噬细胞有关的体液免疫。他们认为高分子量葡聚糖较低分子量葡聚糖更具有活性，桦褐孔菌菌丝体多糖分子量为IlOOkDa时活性高，经蛋白水解酶处理后，其活性无变化，提示蛋白多糖中蛋白质不影响免疫活性。桦褐孔菌菌丝体粗多糖通过提高B淋巴细胞增殖率和免疫球蛋白M(IgM)水平激活B细胞，同时提高巨噬细胞中白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、iNOS的表达，但不影响T细胞的增殖及辅助性T细胞(Th)1中IL-2或Th2的表达。研究还发现桦褐孔菌的细胞组成和继发的新陈代谢都影响用药者的免疫系统，因此可被应用于多种疾病的治疗。日本有关报道，桦褐孔菌对呕吐、腹泻、胃肠功能紊乱、胃及十二指肠溃疡、肝炎、胃炎和肾炎有一定的治疗作用；对因不合理的饮食而导致的骨质方面的疾病有一定的预防和治疗作用。桦褐孔菌还是血液的清洁剂和疼痛的缓解剂，对皮肤过敏也有一定的疗效。目前，国内治疗肿瘤方面的药物很多，但在天然药物中，治疗效果很好的中药很少，未能达到扶正气，提高病人的免疫力，防复发、转移，杀灭癌细胞的作用，并且随着社会的发展和人们物质生活水平的提高，健康的概念已经不再单纯的指不患疾病，医学界人士越来越关注亚健康状态存在及危害，用化学药物来改变这种状态，并不能满足人们对生存质量的要求及对于长寿的渴望。而桦褐孔菌正是一种能有效治疗各种癌症并能增强机体免疫力的天然药物。目前已被列入俄罗斯药典。对桦褐孔菌子实体的化学成分和药理作用的研究国外已有很多，特别是对其抗肿瘤作用和增强免疫力方面的研究。但在我国对桦褐孔菌的研究还处于起步阶段，大规模人工驯化还没有实现，其来源主要是靠采集野生资源，更加珍贵的是野生的品种只有在活的桦树上生长1015年才具有很好的药用价值，并且每两万棵桦树上大约只有一棵生长着桦褐孔菌，因此野生的桦褐孔菌价格十分昂贵，这使桦褐孔菌的开发利用受到了限制。
发明内容本发明提供一种具有增强免疫作用的桦褐孔菌胞内外混合粗多糖及其药物用途，以解决野生的桦褐孔菌价格十分昂贵、使桦褐孔菌的开发利用受到限制的问题。本发明采取的技术方案是由下列方法得到的一、无菌条件下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿内，培养温度26-29°C，培养240-360小时；该综合固体培养基配方(g/100ml)马铃薯16-26，葡萄糖1.2-3.2，琼脂1.5-2.5，MgSO4O.12-0.2，KH2PO4O.28-0.SSjVB1O.8-1.2mg加水定溶至所需体积，PH值自然；二、一级发酵在无菌条件下，用6mm的打孔器菌落边缘处打孔，用接种铲取6-10块的菌饼接入含有100-150ml液体培养基的250ml摇瓶中，置于26-29°C，转速为120-185rpm/min的摇床中，恒温培养210-300小时后进行二级发酵培养；该液体培养基配方(g/100ml)马铃薯16-26，葡萄糖1.2-3.2，MgSO4O.12-0.2，KH2PO4O.28-0.35，VB1O.8-1.2mg加水定溶至所需体积，PH值自然；三、二级发酵取一级发酵液接种于含有250_350ml该液体培养基的IOOOml二级摇瓶中，接种量为10%-13%，置于26-29°C，转速为120-170rpm/min的摇床中，恒温培养160-240小时；四、将二级发酵产物进行抽滤，得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液；将菌丝体用蒸馏水冲洗三次，置55-60°C鼓风干燥箱中烘干，称重，60目粉碎，按蒸馏水与菌丝体粉末比45-501置于超声仪内，48-52°C，65-75Hz超声提取40min，重复提取2-3次，合并提取液，45-55°C减压浓缩至原体积的1/5-1/10，得胞内多糖浓缩液；将发酵液45_55°C减压浓缩至原体积的1/5-1/10，并与胞内多糖浓缩液合并，加入95%乙醇，搅拌，使乙醇终浓度达到75%-80%，40C静止沉淀8-12小时，收集沉淀，用无水乙醇洗涤3次，55-60°C恒温干燥，重复2-3次，得桦褐孔菌胞内外混合粗多糖。硫酸-苯酚法测得粗多糖中多糖含量为45%-75%。本发明桦褐孔菌胞内外混合粗多糖在荷瘤小鼠生命延长率和增强免疫功能方面的应用本发明药物的活性组分可以加入制备不同剂型时所需的各种常规辅料，如崩解剂、润滑剂、粘合剂等以常规的中药制剂方法制备成任何一种常用口服剂型，如颗粒剂、丸齐U、散剂、片剂、胶囊剂、口服液等。本发明利用液体深层发酵所得的发酵产物中，同样含有药用活性成分，其生长周期短，可以成为获取活性成分的一种有效手段。本发明经过实验，从桦褐孔菌菌丝体及其发酵液中提取得到胞内外混合粗多糖，并对其生命延长率和免疫增强作用进行了研究，通过对脾脏、胸腺指标综合考察和小鼠血清中IL-2，IL-18，TNF-α，INF-Y细胞因子的含量指标检测，得出桦褐孔菌胞内外混合粗多糖可用于制备新的免疫增强剂。本发明对开发利用药用菌物资源开辟了新途径。具体实施例方式试验材料桦褐孔菌菌种2006年购于黑龙江省伊春市食药用菌研究所；桦褐孔菌胞内外混合粗多糖。阳性对照药复方环磷酰胺片为通化茂祥制药有限公司产品，规格为每片含环磷酰胺50mg，人参茎叶总皂甙50mg，批号070601。TNF-α试剂盒，产地加拿大；IL_18试剂盒，产地加拿大；IL_2试剂盒，产地力口拿大；INF-γ试剂盒，产地加拿大动物及瘤株动物昆明种小鼠，雌性，体重20士2g，6周龄，购于长春生物制品研究所，合格证编号0006456。瘤株肉瘤S180和肝癌H22购于吉林省肿瘤研究所。试验方法试验例1，本发明桦褐孔菌胞内外混合粗多糖对荷瘤小鼠的生命延长率实验方法取昆明种小鼠50只，在无菌条件下将接种了7d的小鼠腹水用9g/L的生理盐水以13的比例稀释至含肿瘤细胞数为5XIO6Cfu/只，小鼠腹腔内接种(0.2mL/只)。接种24h后称重并随机分为5组，每组10只，分别为空白对照组(生理盐水)、阳性对照组——复方环磷酰胺组(30mg/kg)及桦褐孔菌胞内外混合粗多糖高剂量组(500mg/kg)、中剂量组(250mg/kg)、低剂量组(125mg/kg)。同时在接种24h后灌胃给药，给药体积为20mL/kg，每日1次，连续给药10d，停药，记录死亡天数并计算生命延长率。生命延长率率=(给药组小鼠平均存活天数/空白对照组小鼠平均存活天数-1)X100%统计学处理，SPSS12.0软件进行统计学处理，分析组间差异，试验结果用)表不。结果1、桦褐孔菌胞内外混合粗多糖对肝癌H22小鼠生命延长率的影响桦褐孔菌胞内外混合粗多糖高、中、低剂量组均能延长肝癌H22腹水瘤小鼠的生存时间，平均延长6.8458天。高、中、低剂量组与空白对照组比较均有极显著性差异(P<0.01)且成剂量依赖关系，其生命延长率分别为64.13%，63.04%，51.41%。结果见表1。表1桦褐孔菌胞内外混合粗多糖对肝癌H22小鼠生命延长率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注与空白对照组比较*P<0.05**P<0.012、桦褐孔菌胞内外混合粗多糖对肉瘤S18tl腹水瘤小鼠的生命延长率的影响桦褐孔菌胞内外混合粗多糖高、中、低剂量组均能延长S18tl腹水瘤小鼠的生存时间，平均延长3.3889天。且低剂量组与空白对照组比较有极显著性差异(P<0.01)，生命延长率为28.57%；而高、中剂量组与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05)，生命延长率分别为17.86%、26.19%。结果见表2。表2桦褐孔菌胞内外混合多糖对肉瘤S18tl小鼠生命延长率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注与空白对照组比较*P<0.05**P<0.01试验例2桦褐孔菌胞内外混合粗多糖对荷瘤小鼠免疫器官作用实验方法取昆明种小鼠50只，在无菌条件下将接种了7d的小鼠腹水用9g/L的生理盐水以13的比例稀释至含肿瘤细胞数为5XIO6Cfu/只，小鼠右腋窝皮下接种(0.2mL/只)。接种24h后称重并随机分为5组，每组10只，分别为空白对照组(生理盐水)、阳性对照组——复方环磷酰胺组(30mg/kg)及桦褐孔菌胞内外混合粗多糖高剂量组(500mg/kg)、中剂量组(250mg/kg)、低剂量组(125mg/kg)。同时在接种24h后灌胃给药，给药体积为20mL/kg，每日1次，连续给药10d，停药后次日称重脱白致死，分别取胸腺及脾脏，称重并计算胸腺指数和脾脏指数。胸腺指数=胸腺重/体重(mg/g)脾系指数=脾重/体重(mg/g)结果1、桦褐孔菌胞内外混合粗多糖对肉瘤S18tl小鼠免疫器官的影响阳性对照——复方环磷酰胺组的抑瘤率虽高，但对肉瘤S18tl小鼠的脾脏和胸腺有抑制作用，其胸腺指数和脾脏指数和空白对照组比较均降低，其中脾脏指数与空白对照组比较有极显著性指数差异(P<0.01)。而桦褐孔菌胞内外混合粗多糖的高、中、低剂量组小鼠的胸腺指数和脾脏指数均高于空白对照组，其中高剂量组和中剂量组的脾脏指数与空白对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。见表3。表3桦褐孔菌胞内外混合粗多糖对S18tl肉瘤小鼠免疫器官的影响(mg/g，i±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注与空白对照组比较*P<0.05**P<0.012、桦褐孔菌胞内外混合粗多糖对肝癌H22小鼠免疫器官的影响与肉瘤S18tl的实验结果相比，阳性对照复方环磷酰胺组的抑瘤率虽高，但对肝癌H22小鼠的脾脏和胸腺有抑制作用，其胸腺指数和脾脏指数与空白对照组比较亦均降低，其中胸腺指数与空白对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。而桦褐孔菌胞内外混合粗多糖的高、中、低剂量组小鼠的胸腺指数和脾脏指数却均高于空白对照组，其中高剂量组和中剂量组的胸腺指数与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05)。见表4。表4桦褐孔菌胞内外混合粗多糖对肝癌H22小鼠免疫器官的影响(mg/g，I±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注与空白对照组比较*P<0.05**P<0.01试验例3桦褐孔菌胞内外混合粗多糖对荷瘤小鼠血清中细胞因子的酶联免疫实验方法选用小鼠肝癌H22瘤株接种于昆明种小鼠50只。次日将小鼠随机分为5组，分别为空白对照组，阳性对照组和桦褐孔菌胞内外混合粗多糖高、中、低剂量组。每天灌胃给药一次，给药10天。在第11天将小鼠眼球取血，离心，分离血清。用IL-2，IL-18,TNF-α,INF-γELISA试剂盒，采用双夹心酶联免疫检测法，λ=450nm，根据标准OD值绘制曲线，从标准曲线上查出待检标本IL-2，IL-18，TNF-α，INF-γ的含量。结果1、桦褐孔菌胞内外混合粗多糖对肝癌H22小鼠血清中IL-2含量的影响IL-2是参与免疫应答的重要细胞因子，并参与抗肿瘤效应和移植排斥反应。同时与相应细胞的IL-2受体结合后，具有广泛的免疫增强和调节功能。IL-2能诱导Th细胞和Tc细胞增殖、激活B细胞产生抗体、激活巨噬细胞、增强NK细胞和淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)活性及诱导干扰素产生。本实验得出桦褐孔菌胞内外混合粗多糖高、中、低剂量组小鼠血清中IL-2的含量均高于空白对照组，但无显著性差异，并且中剂量组高于复方环磷酰胺组，亦无显著性差异。结果表明，桦褐孔菌胞内外混合粗多糖能够提高荷瘤小鼠血清中IL-2的含量，从而提高荷瘤小鼠免疫功能，达到抗肿瘤作用。见表5。表5桦褐孔菌胞内外混合粗多糖对肝癌H22小鼠血清中IL_2的含量的影响(pg/mL,λ:±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注与空白对照组比较"P<0.012、桦褐孔菌胞内外混合粗多糖对肝癌H22小鼠血清中IL-18含量的影响白细胞介素18(IL_18)主要是单核-巨噬细胞和上皮细胞产生的一种多功能细胞因子，在免疫调节、抗肿瘤、抗病原微生物感染等过程中具有十分重要的作用，并与多种疾病相关联。能促进T细胞增殖、增强NK细胞的细胞毒作用，在诱导Thl细胞的分化成熟过程和Thl细胞为主的细胞免疫反应中具有促进和调节作用。同时IL-18还可与IL-2协同抗肿瘤。本实验得出高、中、低剂量组肝癌H22荷瘤小鼠血清中IL-18含量均低于空白对照组和复方环磷酰胺组，且与空白组比较有极显著性差异(P<0.01)，复方环磷酰胺组明显低于空白对照组，且具有极显著性差异(P<0.01)。其原因可能是由于肝癌H22荷瘤小鼠血清中部分IL-18与血清白介素-18结合蛋白结合的结果，表明桦褐孔菌胞内外混合粗多糖不是通过直接增加IL-18含量来提高免疫功能，而是通过IL-18与血清白介素-18结合蛋白结合后形成负反馈环路，调节机体的免疫功能，调节Thl反应，达到抗肿瘤作用的。见表6。表6桦褐孔菌胞内外混合粗多糖对肝癌H22小鼠血清中IL-18的含量的影响(pg/mL,χ±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注与空白对照组比较"P<0013、桦褐孔菌胞内外混合粗多糖对肝癌H22小鼠血清中TNF-α含量的影响TNF-α是由细菌脂多糖活化的单核巨噬细胞释放的细胞因子，与肿瘤细胞膜上的TNF-α受体结合，特异性的杀伤肿瘤细胞，对机体的正常细胞无害，可致肿瘤细胞坏死。本实验得出高、中、低剂量组肝癌H22小鼠血清中TNF-α含量均高于空白对照组和复方环磷酰胺组，且高、中剂量组与空白组比较有显著性差异(P<0.05)，复方环磷酰胺组含量明显低于空白对照组，且与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05)。表明桦褐孔菌胞内外混合粗多糖能够促进荷瘤小鼠单核巨噬细胞分泌TNF-α，从而提高荷瘤小鼠特异性免疫功能，达到抗肿瘤作用。见表7。表7桦褐孔菌胞内外混合机多糖对肝癌H22小鼠血清中TNF-α的含量的影响(pg/mL,χ±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注与空白对照组比较"P<0014、桦褐孔菌胞内外混合粗多糖对肝癌H22小鼠血清中INF-γ含量的影响结果表明高、中、低剂量组肝癌H22小鼠血清中INF-Y含量均低于空白对照组，但中、低剂量组却高于复方环磷酰胺组，且与空白组比较无显著性差异；复方环磷酰胺组明显低于空白对照组，亦不具显著性差异。这可能是因为IFN-Y—般在感染的早期分泌较多，随后逐渐减少，同时IFN-γ是由IL-18诱导产生的，而IL-18在疾病过程中发挥两方面的作用一方面通过诱导IFN-Y的产生发挥组织损伤作用，另一方面通过产生抗炎症因子(如IL-4和IL-13)发挥代偿作用。现在认为，在IL-12存在时，IL-18诱导Thl型细胞因子如IFN-Y。在没有IL-12存在时，IL-18诱导Th2型细胞因子如IL-4、IL-13等。另外，如果IL-18与血清白介素-18结合蛋白结合也会拮抗IL-18相关生物学功能，抑制IFN-γ产生，因此本实验得出INF-Y含量低于空白对照组的结果与IL-18的测定结果一致，表明桦褐孔菌胞内外混合粗多糖也不是通过直接增加INF-Y含量来提高免疫功能，达到抗肿瘤作用的。见表8。表8桦褐孔菌胞内外混合粗多糖对肝癌H22小鼠血清中INF-γ的含量的影响(pg/mL,χ±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注与空白对照组比较"P<001实施例1本发明片剂的制备一、无菌条件下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿内，培养温度26°C，培养240小时；该综合固体培养基配方(g/100ml):马铃薯16，葡萄糖1.2，琼脂1.5，MgSO4O.12，KH2PO4O.28，VB1O.8mg加水定溶至所需体积，PH值自然；二、一级发酵在无菌条件下，用6mm的打孔器菌落边缘处打孔，用接种铲取6块的菌饼接入含有IOOml液体培养基的250ml摇瓶中，置于26°C，转速为120rpm/min的摇床中，恒温培养210小时后进行二级发酵培养；该液体培养基配方(g/100ml)马铃薯16，葡萄糖1.2，MgSO4O.12，KH2PO4O.28，VB1O.8mg加水定溶至所需体积，PH值自然;三、二级发酵取一级发酵液接种于含有250_350ml该液体培养基的IOOOml二级摇瓶中，接种量为10%，置于26°C，转速为120rpm/min的摇床中，恒温培养160小时；四、将二级发酵产物进行抽滤，得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液；将菌丝体用蒸馏水冲洗三次，置55°C鼓风干燥箱中烘干，称重，60目粉碎，按蒸馏水与菌丝体粉末比451置于超声仪内，48°C，65Hz超声提取40min，重复提取3次，合并提取液，45°C减压浓缩至原体积的1/5，得胞内多糖浓缩液；将发酵液45°C减压浓缩至原体积的1/5，并与胞内多糖浓缩液合并，加入95%乙醇，搅拌，使乙醇终浓度达到75%，4°C沉淀8小时，收集沉淀，用无水乙醇洗涤3次，55°C恒温干燥，重复2次，得桦褐孔菌胞内外混合粗多糖。硫酸-苯酚法测得粗多糖中多糖含量为65%。五、桦褐孔菌胞内外混合多糖与制备片剂的常规辅料混合，压片。实施例2本发明颗粒剂的制备一、无菌条件下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿内，培养温度28°C，培养300小时；该综合固体培养基配方(g/100ml):马铃薯21，葡萄糖2.4，琼脂2.0，MgSO4O.16，KH2PO4O.31，VB1LOmg加水定溶至所需体积，PH值自然。二、一级发酵在无菌条件下，用6mm的打孔器菌落边缘处打孔，用接种铲取8块的菌饼接入含有120ml液体培养基的250ml摇瓶中，置于28°C，转速为150rpm/min的摇床中，恒温培养260小时后进行二级发酵培养；该液体培养基配方(g/100ml)马铃薯21，葡萄糖2.4，MgSO4O.16，KH2PO4O.31，VB1LOmg加水定溶至所需体积，PH值自然。三、二级发酵取一级发酵液接种于含有250-350ml该液体培养基的1000ml二级摇瓶中，接种量为11%，置于28°C，转速为150rpm/min的摇床中，恒温培养200小时。四、将二级发酵产物进行抽滤，得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液；将菌丝体用蒸馏水冲洗三次，置57°C鼓风干燥箱中烘干，称重，60目粉碎，按蒸馏水与菌丝体粉末比471置于超声仪内，50°C，70Hz超声提取40min，重复提取3次，合并提取液，50°C减压浓缩至原体积的1/7，得胞内多糖浓缩液；将发酵液50°C减压浓缩至原体积的1/7，并与胞内多糖浓缩液合并，加入95%乙醇，搅拌，使乙醇终浓度达到78%，4°C沉淀10小时，收集沉淀，用无水乙醇洗涤3次，57°C恒温干燥，重复3次，得桦褐孔菌胞内外混合粗多糖。硫酸-苯酚法测得粗多糖中多糖含量为45%。五、桦褐孔菌胞内外混合粗多糖与制备颗粒剂的常规辅料混合，制颗。实施例3本发明胶囊剂的制备一、无菌条件下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿内，培养温度29°C，培养360小时；该综合固体培养基配方(g/100ml):马铃薯26，葡萄糖3.2，琼脂2.5，MgSO4O.2，KH2PO4O.35，VB1L2mg加水定溶至所需体积，PH值自然；二、一级发酵在无菌条件下，用6mm的打孔器菌落边缘处打孔，用接种铲取10块的菌饼接入含有150ml液体培养基的250ml摇瓶中，置于29°C，转速为185rpm/min的摇床中，恒温培养300小时后进行二级发酵培养；该液体培养基配方(g/100ml)马铃薯26，葡萄糖3.2，MgSO4O.2，KH2PO4O.35，VB1L2mg加水定溶至所需体积，PH值自然;三、二级发酵取一级发酵液接种于含有350ml该液体培养基的IOOOml二级摇瓶中，接种量为13%，置于29°C，转速为170rpm/min的摇床中，恒温培养240小时；四、将二级发酵产物进行抽滤，得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液；将菌丝体用蒸馏水冲洗三次，置60°C鼓风干燥箱中烘干，称重，60目粉碎，按蒸馏水与菌丝体粉末比501置于超声仪内，52°C，75Hz超声提取40min，重复提取2次，合并提取液，55°C减压浓缩至原体积的1/10，得胞内多糖浓缩液；将发酵液55°C减压浓缩至原体积的1/10，并与胞内多糖浓缩液合并，加入95%乙醇，搅拌，使乙醇终浓度达到80%，4°C沉淀12小时，收集沉淀，用无水乙醇洗涤2次，60°C恒温干燥，重复3次，得桦褐孔菌胞内外混合粗多糖。硫酸-苯酚法测得粗多糖中多糖含量为75%。五、桦褐孔菌胞内外混合粗多糖与制备胶囊剂的常规辅料混合，制颗粒，装入胶囊。权利要求一种具有增强免疫作用的桦褐孔菌胞内外混合粗多糖，其特征在于它是由下列方法得到的一、无菌条件下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿内，培养温度26-29℃，培养240-360小时；该综合固体培养基配方(g/100ml)马铃薯16-26，葡萄糖1.2-3.2，琼脂1.5-2.5，MgSO40.12-0.2，KH2PO40.28-0.35，VB10.8-1.2mg加水定溶至所需体积，PH值自然；二、一级发酵在无菌条件下，用6mm的打孔器菌落边缘处打孔，用接种铲取6-10块的菌饼接入含有100-150ml液体培养基的250ml摇瓶中，置于26-29℃，转速为120-185rpm/min的摇床中，恒温培养210-300小时后进行二级发酵培养；该液体培养基配方(g/100ml)马铃薯16-26，葡萄糖1.2-3.2，MgSO40.12-0.2，KH2PO40.28-0.35，VB10.8-1.2mg加水定溶至所需体积，PH值自然；三、二级发酵取一级发酵液接种于含有250-350ml该液体培养基的1000ml二级摇瓶中，接种量为10％-13％，置于26-29℃，转速为120-170rpm/min的摇床中，恒温培养160-240小时；四、将二级发酵产物进行抽滤，得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液；将菌丝体用蒸馏水冲洗三次，置55-60℃鼓风干燥箱中烘干，称重，60目粉碎，按蒸馏水与菌丝体粉末比45-50∶1置于超声仪内，48-52℃，65-75Hz超声提取40min，重复提取2-3次，合并提取液，45-55℃减压浓缩至原体积的1/5-1/10，得胞内多糖浓缩液；将发酵液于45-55℃减压浓缩至原体积的1/5-1/10，并与胞内多糖浓缩液合并，加入95％乙醇，搅拌，使乙醇终浓度达到75％-80％，4℃沉淀8-12小时，收集沉淀，用无水乙醇洗涤3次，55-60℃恒温干燥，重复2～3次，得桦褐孔菌胞内外混合粗多糖。硫酸-苯酚法测得多糖含量为45％-75％。2.如权利要求1所述的桦褐孔菌胞内外混合粗多糖的制备方法，包括下列步骤一、无菌条件下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿内，培养温度26-29°C，培养240-360小时；该综合固体培养基配方(g/100ml)马铃薯16-26，葡萄糖1.2-3.2，琼脂1.5-2.5，MgSO4O.12-0.2，KH2PO4O.28-0.35，VB1O.8-1.2mg加水定溶至所需体积，PH值自然；二、一级发酵在无菌条件下，用6mm的打孔器菌落边缘处打孔，用接种铲取6-10块的菌饼接入含有100-150ml液体培养基的250ml摇瓶中，置于26-29°C，转速为120_185rpm/min的摇床中，恒温培养210-300小时后进行二级发酵培养；该液体培养基配方(g/100ml)马铃薯16-26，葡萄糖1.2-3.2，MgSO4O.12-0.2，KH2PO4O.28-0.35，VB1O.8-1.2mg加水定溶至所需体积，PH值自然；三、二级发酵取一级发酵液接种于含有250-350ml该液体培养基的1000ml二级摇瓶中，接种量为10%-13%，置于26-29°C，转速为120-170rpm/min的摇床中，恒温培养160-240小时；四、将二级发酵产物进行抽滤，得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液；将菌丝体用蒸馏水冲洗三次，置55-60°C鼓风干燥箱中烘干，称重，60目粉碎，按蒸馏水与菌丝体粉末比45-501置于超声仪内，48-52°C，65-75Hz超声提取40min，重复提取2-3次，合并提取液，45-55°C减压浓缩至原体积的1/5-1/10，得胞内多糖浓缩液；将发酵液45_55°C减压浓缩至原体积的1/5-1/10，并与胞内多糖浓缩液合并，加入95%乙醇，搅拌，使乙醇终浓度达到75%-80%,4°C沉淀8-12小时，收集沉淀，用无水乙醇洗涤3次，55_60°C恒温干燥，重复23次，得桦褐孔菌胞内外混合粗多糖。3.如权利要求1所述的用硫酸-苯酚法测定桦褐孔菌胞内外混合粗多糖中多糖的含量为45%-75%。4.如权利要求1所述的桦褐孔菌胞内外混合粗多糖在制备免疫增强剂方面的应用。全文摘要本发明涉及医药
技术领域：
，具体为从药用真菌桦褐孔菌液体深层发酵产物中提取得到一种具有免疫增强作用的桦褐孔菌胞内外混合粗多糖。无菌条件下取斜面菌种接入盛有新鲜的综合固体培养基的平皿内，经过一级发酵、二级发酵，将二级发酵产物进行抽滤，得到桦褐孔菌菌丝体和发酵清液；经浓缩、水提醇沉得到桦褐孔菌胞内外混合粗多糖。体内实验证明桦褐孔菌胞内外混合粗多糖均能延长小鼠肝癌H22和S180腹水瘤小鼠的生存时间；并能显著提高其胸腺指数和脾指数。而且能明显促进荷瘤小鼠血清中IL-2、TNF-α细胞因子的分泌。桦褐孔菌胞内外混合粗多糖可用于制备新的免疫增强制剂。本发明对开发利用药用真菌资源开辟了新的途径。文档编号C12P19/04GK101805763SQ20101012960公开日2010年8月18日申请日期2010年3月23日优先权日2010年3月23日发明者李玉,潘景芝,王琦,王金玲申请人:王琦