专利名称：一种快速检测马立克氏病抗性鸡个体的方法
技术领域：
本发明属生物学领域，具体是一种快速检测马立克氏病抗性鸡个体的方法。
背景技术：
过去选定马立克氏病(MD)抗病品系主要用攻毒幸存者的繁殖或/和后裔测定。例 如Cornell 1968年使用此方法进行多代选择，在第4代获得了用于科学研究的康乃尔马立 克氏病抗病系和易感系。方法虽然简单，但需要专门的攻毒环境，基础群数量大，以及繁琐 的后裔测定，因此育种成本高。
发明内容
为了克服现有技术的不足本发明提供一种快速检测马立克氏病抗性鸡个体的方法。本发明解决上述技术问题的技术方案如下一种快速检测马立克氏病抗性鸡个体的方法，建立和利用快速鉴定马立克氏病 (MD)抗性/易感单倍体的半巢式PCR(snPCR)法，可以简单、快速、方便地鉴定MD抗性/易 感单倍体，进而鉴定出MD抗性鸡个体。该方法操作按以下步骤进行1.样品RNA的提取无菌翅静脉采集鸡血，分离鸡外周血淋巴白细胞(PBLs)，按产品说明书方法使用 Trizol RNA抽提试剂盒提取上述组织的总RNA ；2. cDNA 的合成取RNA样品14. 5 μ L，力口入25pm BF基因夕卜下游引物1 μ L，弓I物序列 为 5~-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3~，70 "C 5min,置于-20 "C 5min ；然后加入 5 μ L5 X RT-Buffer, 2 μ LlOmM dNTP，200U M-MLV 逆转录酶，25U Rnasin 并混勻，37°C 放置 lh，96°C作用5min，最终得25yL cDNA，保存于_20°C备用；3. snPCR第一轮扩增BF基因可变剪接部分——外显子7设计一对外引物外上游引物-GCAGGGAAGAAGGGGAAGGG-3“，外下游引物 -GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3“，用于扩增BF基因的第6外显子、第7外显子、第8外显
子以及3、非翻译区；T-UT的编码外显子，PCR反应体系10 XPCR buffer 5 μ LUOmM dNTP 1 μ L、25pM上、下游引物各1 μ L、Taq酶1. 5U、cDNA模板5 μ L，灭菌三蒸水补足50 μ L，反应 循环参数95°C预变性5min，35个循环95°C变性30sec、61°C退火30sec、72°C延伸45sec， 72°C后延伸lOmin，产物用2. 0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照，扩增结 果如仅有195bp片段的单倍体，初步定为抗性单倍体；扩增结果如有195bp和162bp片段的 单倍体，初步定为易感单倍体；4. snPCR第一轮扩增产物的克隆、序列测定对鸡的PBLs第一轮snPCR扩增产物进行克隆、序列测定用1. 5%的琼脂糖凝胶 分离PCR产物，切下目的带并用试剂盒纯化回收，纯化产物与PMD18-T载体连接后转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞，提取质粒DNA测序，所有目的带测序结果应为BF基因的相应片断；5. snPCR第二轮扩增BF基因可变剪接部分——外显子7设计一对内引物内上游引物-TACAACATTGCGCCCGGG-3"，内下游引物 -GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3"，内上游引物序列为第6外显子末端15个碱基和第8
外显子前3个碱基，因此，它恰好只能结合前面提到的162bp片断，而不能结合前面提到 的 195bp 片断，PCR 反应体系10XPCR buffer 5 μ LUOmM dNTP 1 μ L、25pM 上、下游引物 各1 μ L、Taq酶1. 5U、cDNA模板5 μ L，灭菌三蒸水补足50 μ L。反应循环参数95°C预变性 5min，35 个循环95°C变性 30sec、52°C退火 30sec、72°C延伸 45sec，72°C后延伸 lOmin。产 物用2. 0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照，扩增结果为阳性，即有141bp 片段的单倍体，定为易感单倍体；扩增结果为阴性，即无141bp片段的单倍体，定为抗性单 倍体，此个体即相应地的为MD抗性鸡。本发明与现有技术比较的有益效果是快速鉴定马立克氏病(MD)抗性/易感单倍体的半巢式PCR(snPCR)法可以简单、 快速、方便地鉴定MD抗性/易感单倍体，进而鉴定MD抗性鸡。通过建立的snPCR法的第一 次PCR扩增鸡外周血淋巴白细胞(PBLs)的BF基因，如有大小为195bp的目的带，此目的带 测序结果确认为BF基因的相应片断，且snPCR法的第二次PCR检测结果为阴性，那么此鸡 单倍体为MD抗性BF单倍体，此鸡相应地的为MD抗性鸡。
图1是本发明snPCR扩增BF基因外显子7的示意图。图2是本发明第一轮PCR扩增A5、B21, A11, C23、D12和D8PBLs BF基因可变剪接部 分——外显子7的产物。图中，M:DNA标准；1，3 分别为A5和B21的产物——195bp和162bp ；2，4，5，6 分 别为A11, C23，D12和D8的产物——195bp ；7 阴性对照。图3是本发明第一轮PCR扩增D12和AJ干脏、脾脏、心脏BF基因可变剪接部分—— 外显子7的产物。图中，M :DNA标准；1，2，3 分别为D12肝脏、脾脏和心脏的产物——195bp ；4，5，6 分别为A5肝脏、脾脏和心脏的产物——195bp和162bp。图4是本发明第一轮扩增霞烟鸡A5和D12PBLs中的BF基因外显子7PCR产物的核 苷酸序列。注加下划线的核苷酸序列为外引物序列，33个连续星号*表示可变外显子7全 部的33个被剪接掉的碱基.图5是本发明第二轮PCR扩增A5, B21，A11, C23，D12和D8PBLs BF基因可变剪接部 分——外显子7的产物。图中，M :DNA标准；1,3 分别为A5和B21的产物——141bp ；2，4，5，6 分别为A11, C23，D12和D8的产物；7 阴性对照。图6是本发明第二轮PCR扩增A5和D12内脏BF基因可变剪接部分——外显子7的产物。
图中，M :DNA标准；1，2，3 分别为D12肝脏、脾脏和心脏的产物；4，5，6 分别为、肝 脏、脾脏和心脏的产物——141bp。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
一种快速检测马立克氏病抗性鸡个体的方法，按以下步骤进行1.样品RNA的提取选取我们获得的4羽MD抗性霞烟鸡——A11，C23，D8和D12和2羽MD易感霞烟鸡—— A5和B21的PBLs、肝脏、脾脏和心脏，按产品说明书方法使用TrizolRNA抽提试剂盒提取上 述组织、器官的总RNA。2. cDNA 的合成取RNA样品14. 5 μ L，力卩入25pm BF基因外下游引物1 μ L，引物序列为 -GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3~, 70 "C 5min,置于-20 "C 5min ；然后加入 5yL
5XRT-Buffer,2y L IOmM dNTP，200U M-MLV 逆转录酶，25U Rnasin 并混勻，37°C 放置 lh， 96°C作用5min，最终得25 μ L cDNA，保存于_20°C备用。3. snPCR第一轮扩增BF基因可变剪接部分——外显子7根据GenBank数据库中提供的BF基因的mRNA序列，设计一对外引物外上游引 物 -GCAGGGAAGAAGGGGAAGGG-3“，外下游引物 -GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3“，用于扩 增BF基因的第6外显子、第7外显子、第8外显子以及3、非翻译区3:UT的编码外显子， 见图1，预计扩增片段约为195bp和162bp，引物合成由大连宝生物有限公司完成。PCR 反应体系10XPCR buffer 5 μ LUOmM dNTP 1 μ L、25pM 上、下游引物各 1 μ L、Taq酶1. 5U、cDNA模板5 μ L，灭菌三蒸水补足50 μ L。反应循环参数95°C预变性 5min，35 个循环95°C变性 30sec、61°C退火 30sec、72°C延伸 45sec，72°C后延伸 lOmin。产 物用2. 0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照。4. snPCR第一轮扩增产物的克隆、序列测定对MD抗性霞烟鸡D12和MD易感霞烟鸡A5的PBLs第一轮snPCR扩增产物进行克 隆、序列测定。用1. 5%的琼脂糖凝胶分离PCR产物，切下目的带并用试剂盒纯化回收，纯化 产物与pMDlS-T载体连接后转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞，提取质粒测序，测序反应由 上海生工生物工程有限公司完成。5. snPCR第二轮扩增BF基因可变剪接部分——外显子7根据snPCR第一轮扩增产物的测序结果，见图4，以及GenBank中的同源序列，设计 一条内引物内上游引物5—-TACAACATTGCGCCCGGG-3—，内下游引物与外下游引物相同。内 上游引物序列为第6外显子末端15个碱基和第8外显子前3个碱基，见图4，它恰好只能结 合162bp片断，而不能结合195bp片断，预计扩增片段约为141bp，引物合成由大连宝生物有 限公司完成。PCR 反应体系10XPCR buffer 5 μ LUOmM dNTP 1 μ L、25pM 上、下游引物各 1 μ L、Taq酶1. 5U、cDNA模板5 μ L，灭菌三蒸水补足50 μ L。反应循环参数95°C预变性 5min，35 个循环95°C变性 30sec、52°C退火 30sec、72°C延伸 45sec，72°C后延伸 lOmin。产 物用2. 0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照。
6. snPCR第二轮扩增产物的克隆、序列测定对MD易感霞烟鸡A5的PBLs第二轮snPCR扩增产物进行克隆、序列测定。用1. 5% 的琼脂糖凝胶分离PCR产物，切下目的带并用试剂盒纯化回收，纯化产物与pMDlS-Τ载体连 接后转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞，提取质粒DNA进行测序，测序反应由上海生工生物 工程有限公司完成。结果1. snPCR第一轮扩增BF基因可变剪接部分——外显子7MD易感霞烟鸡A5和B21的PBLs cDNA样品中都能扩增到195bp和162bp两个片 段，表明鸡B复合体两种BF mRNA中的一种有外显子7缺失；MD抗性霞烟鸡A11, C23，D12和 D8的PBLs cDNA样品中只能扩增到195bp的片段，表明两种BF mRNA都无外显子7缺失，见 图2。结果IsnPCR第一轮扩增BF基因可变剪接部分——外显子7MD易感霞烟鸡A5和B21的PBLs cDNA样品中都能扩增到195bp和162bp两个片段，表明鸡B复合体两种BF mRNA中的一个有外显子7缺失；MD抗性霞烟鸡All，C23，D12 和D8的PBLs cDNA样品中只能扩增到195bp的片段，表明两种BF mRNA都无外显子7缺失， 见图2。从MD易感霞烟鸡A5的肝脏、脾脏、心脏cDNA样品中都能扩增到195bp和162bp的 片段，表明两种BF mRNA中的一种有外显子7缺失；而从MD抗性霞烟鸡D12的肝脏、脾脏、心 脏cDNA样品中都只能扩增到195bp的片段，表明都无外显子7缺失，见图3。测序结果和同 源性比较表明，所扩增片段均为BF基因片段。2. snPCR第一轮扩增产物的序列测定结果测定的BF*D12基因的195bp片断核甘酸序列GenBank登录号为EU746446 ；测定的 BF*A5基因162bp片断核甘酸序列GenBank登录号为EU746447，它们的比对结果见图4。3. snPCR第二轮扩增BF基因可变剪接部分一一外显子7MD易感霞烟鸡A5和B21PBLs的cDNA第二轮PCR扩增到141bp的片段；而MD抗性 霞烟鸡A11, C23，D12和D8PBLs的cDNA第二轮PCR扩增不到141bp的片段及其它片断，见图 5。MD易感霞烟鸡A5的肝脏、脾脏、心脏cDNA第二轮PCR扩增到141bp的片段；而从 MD抗性霞烟鸡D12的肝脏、脾脏、心脏cDNA第二轮PCR扩增不到141bp的片段及其它片断， 见图6。4. snPCR第二轮扩增产物的序列测定结果测定BF*A5基因的141bp片断核甘酸序列，测序结果和同源性比较表明，所扩增片 段为BF基因片段1 TACAACATTG CGCCCGGGAG CAACCCCTCC ATCTGAGTGC TGTGCTTCAGCCTGCAAGGA 61 GCCAACAGTC CACACCAGCA TTTGGGGTCG GCGATGGACA CAGCCCCATCCTCTTGACCT 121 CTCACATCTC ATTCTGCTTC C快速鉴定MD抗性/易感单倍体的snPCR法可以简单、快速、方便地鉴定MD抗性/ 易感单倍体，进而鉴定鸡的MD抗性/易感。但针对BF基因纯种鸡和杂种鸡，鉴定的具体结 果不尽相同。对于BF基因纯种的鸡，如果通过我们建立的snPCR法检测结果为阳性，即有一条141bp的目的带，且目的带测序结果确认为BF基因的部分片断，那么此鸡单倍体为MD易 感BF单倍体，此鸡相应地为MD易感鸡，如本发明的霞烟鸡A5和B21 ；如果通过我们建立的 snPCR法检测结果为阴性，即无141bp的目的带，且第一次PCR有大小为195bp的目的带，此 目的带测序结果确认为BF基因的部分片断，那么此鸡单倍体为MD抗性BF单倍体，此鸡相 应地的为MD抗性鸡，如本研究的霞烟鸡A11, C23，D12和D8。对于BF基因杂种的鸡，如果通过我们建立的snPCR法检测结果为阳性，那么此鸡 一定有一条单倍体为MD易感BF单倍体，但无法确定另一条单倍体是BF抗性还是BF易感 单倍体，因而无法确定此杂种鸡是MD抗性鸡还是易感鸡；如果通过我们建立的snPCR法检 测结果为阴性，那么此杂种鸡的两条单倍体一定都是MD抗性BF单倍体，此杂种鸡相应地的 为MD抗性鸡。综上所述，不管是BF基因纯种还是杂种鸡，如果通过我们建立的snPCR法检测结 果为阴性，那么此鸡的两条单倍体一定都是MD抗性BF单倍体，此鸡相应地的为MD抗性鸡。 这将为方便、经济地鉴定MD抗性鸡个体及培育鸡MD抗性的核心种群提供非常有用的分子工具。
权利要求
一种快速检测马立克氏病抗性鸡个体的方法，其特征在于，该方法操作按以下步骤进行1)样品RNA的提取无菌翅静脉采集鸡血，分离鸡外周血淋巴白细胞(PBLs)，按产品说明书方法使用Trizol RNA抽提试剂盒提取上述组织的总RNA；2)cDNA的合成取RNA样品14.5μL，加入25pm BF基因外下游引物1μL，引物序列为5`-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3`，70℃5min，置于-20℃5min；然后加入5μL 5×RT-Buffer，2μL 10mM dNTP，200U M-MLV逆转录酶，25U Rnasin并混匀，37℃放置1h，96℃作用5min，最终得25μL cDNA，保存于-20℃备用；3)snPCR第一轮扩增BF基因可变剪接部分——外显子7设计一对外引物外上游引物5`-GCAGGGAAGAAGGGGAAGGG-3`，外下游引物5`-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3`，用于扩增BF基因的第6外显子、第7外显子、第8外显子以及3`非翻译区3`-UT的编码外显子，PCR反应体系10×PCR buffer 5μL、10mM dNTP 1μL、25pM上、下游引物各1μL、Taq酶1.5U、cDNA模板5μL，灭菌三蒸水补足50μL，反应循环参数95℃预变性5min，35个循环95℃变性30sec、61℃退火30sec、72℃延伸45sec，72℃后延伸10min，产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照，扩增结果如仅有195bp片段的单倍体，初步定为抗性单倍体；扩增结果如有195bp和162bp片段的单倍体，初步定为易感单倍体；4)snPCR第一轮扩增产物的克隆、序列测定对鸡的PBLs第一轮snPCR扩增产物进行克隆、序列测定用1.5％的琼脂糖凝胶分离PCR产物，切下目的带并用试剂盒纯化回收，纯化产物与pMD18-T载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒DNA测序，所有目的带测序结果应为BF基因的相应片断；5)snPCR第二轮扩增BF基因可变剪接部分——外显子7设计一对内引物内上游引物5`-TACAACATTGCGCCCGGG-3`，内下游引物5`-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3`，内上游引物序列为第6外显子末端15个碱基和第8外显子前3个碱基，因此，它恰好只能结合前面提到的162bp片断，而不能结合前面提到的195bp片断，PCR反应体系10×PCR buffer 5μL、10mM dNTP 1μL、25pM上、下游引物各1μL、Taq酶1.5U、cDNA模板5μL，灭菌三蒸水补足50μL。反应循环参数95℃预变性5min，35个循环95℃变性30sec、52℃退火30sec、72℃延伸45sec，72℃后延伸10min。产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照，扩增结果为阳性，即有141bp片段的单倍体，定为易感单倍体；扩增结果为阴性，即无141bp片段的单倍体，定为抗性单倍体，此个体即相应地的为MD抗性鸡。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测马立克氏病抗性鸡个体的方法。该方法操作按以下步骤进行1)样品RNA的提取，2)cDNA的合成，3)snPCR第一轮扩增BF基因可变剪接部分——外显子7，4)snPCR第一轮扩增产物的克隆、序列测定，5)snPCR第二轮扩增BF基因可变剪接部分——外显子7。本发明与现有技术比较的有益效果是建立和利用快速鉴定马立克氏病(MD)抗性/易感单倍体的半巢式PCR(snPCR)法，可以简单、快速、方便地鉴定MD抗性/易感单倍体，进而鉴定出MD抗性鸡个体。
文档编号C12Q1/68GK101838695SQ201010127859
公开日2010年9月22日 申请日期2010年3月19日 优先权日2010年3月19日
发明者李娅, 赵子轶, 金元昌, 韦信贤, 韦平 申请人:广西大学