专利名称：一种dna分子标记方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA分子标记方法，属于基因工程技术领域。
背景技术：
DNA分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，直接在DNA水平上 检测生物个体之间的差异，是生物个体在DNA水平上遗传变异的直接反映。目前广泛使用 的基于PCR基础的分子标记如RAPD、SSR, AFLP等或是扩增非编码区域，或是随机在基因组 中扩增，普遍距离编码序列较远或很难在目标性状基因附近存在标记位点，此类DNA分子 标记通称为随机DNA分子标记(random DNA markers, RDMs)；随着结构及功能基因组学的 飞速发展，基于目的基因开发形成的目的基因标记(gene targeted markersjTMs)成为一 类新型分子标记类型，如EST标记，SRAP标记，TRAP标记，IFLP标记，SSCP，SNP标记等。但 是每种分子标记方法均有其优势和不足之处，如RAPD方法简单、成本低，但重复性较差、检 测位点不多；SSR多为共显性、重复性好，但位点较少、引物开发成本高；ISSR标记是一种基 于微卫星序列发展起来的十分有效的分子标记，对传统意义上SSR之间的DNA序列进行PCR 扩增，而不是扩增SSR本身，但ISSR是一种显性标记(部分共显性)；AFLP谱带多，但分析程 序复杂、成本高，有时要用到同位素，而且甲基化敏感的限制酶由于基因组DNA的甲基化可 导致“假多态性”产生，识别AATIMlgWifee I酶常会引起一些物种基因组中标记分布不均 衡；EST标记普遍多态性低，SRAP标记和TRAP标记触及的表达序列较少，IFP和SSCP，SNP 标记则是根据已知基因序列开发来的，成本较高。最近，Collard和 Mackill (Collard B. C. Y. , and Mackill D. J. , 2009，Start codon targeted (SCoT) polymorphism: a simple, novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants, Plant. Mol. Biol. Rep. , 27(1): 86-93)开发的目标起始密码子多态性(startcodon targeted polymorphism, SCoT)分子 标记技术也是一种目的基因分子标记，其依据植物基因中的ATG翻译起始位点侧翼序列的 保守性，设计单引物并对基因组进行扩增。SCoT标记作为一种基于PCR技术的新型分子 标记具有操作简单、引物具有通用性、成本低廉、多态性高、可获得丰富的遗传信息等诸多 优点，能更好地反映物种的遗传多样性和亲缘关系(Collard B. C. Y.，and Mackill D. J.， 2009, Start codon targeted (SCoT) polymorphism: a simple, novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants, Plant. Mol. Biol. Rep. , 27(1) : 86-93)。SCoT标记不仅可以作为ISSR和RAPD的有效补充，而且是一种能跟 踪性状的新的分子标记，但是引物的来源有限，虽然理论上能覆盖全基因组，但是初期的引 物设计和筛选工作比较繁琐。因此为使辅助选择育种时的目标性更强，选择余地更大，分子 标记技术还有一定的发展空间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DNA分子标记方法。
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本发明的技术方案在于采用了一种DNA分子标记方法，其采用常规的PCR反应体 系和反应程序进行PCR扩增，扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳检 测，但其PCR反应所使用的引物为组合引物，其中一个引物为SCoT标记引物，另一个引物为 ISSR标记引物。所述的反应程序中，退火温度为45-55°C，在应用SC-SSR标记于特定物种时应对 扩增程序进行优化，保证标记分析体系的稳定性和可靠性。将综合SCoT分子标记和ISSR分子标记发展而来的这种新的分子标记方法命名为 SC-SSRCStart Codon-Simple Sequence R印eat，起始密码子微卫星多态性分子标记技术)。 由于SC-SSR标记的引物包括依据植物基因中的ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性序列 开发而来引物，因而使得到的位点与表达序列紧密连锁，为它的应用提供了一个广阔的前 景；SC-SSR标记是基于PCR的标记系统，所以操作更简便；使用优化的退火温度，保证了扩 增结果的稳定性；上游引物与下游引物之间可自由组配，因而用少数的引物可进行多种组 合，大大减少了合成引物的费用，同时也大大提高了引物的使用率。SC-SSR的多态性来源于 三方面一是ATG翻译起始位点区域与SSR之间的区域(图1，Product Α) ；二是SCoT单引 物可同时结合在双链DNA的正负链上的ATG翻译起始位点区域，从而扩增出两结合位点之 间的序列(图1，Product B)；三是ISSR引物扩增位于反向排列、间隔不太大的重复序列间 的基因组区段(图1，Product C)。上述DNA分子标记方法可以用在葡萄基因工程领域，包 括用于种质资源的鉴定评价、遗传图谱的构建、重要性状基因的标记、gDNA与cDNA指纹分 析及图位克隆、辅助选择育种等方面。本发明的优势在于(1)本发明方法是建立在PCR基础上的单引物扩增，操作简 单，并且特定的退火温度，保证了扩增结果的稳定性；(2)与ISSR标记相比，本发明方法是 一种目的基因分子标记，能有效产生和性状连锁的标记，方便分子标记辅助育种；与SCoT 标记相比，本发明方法因为还扩增了 SSR区间；并且本方法除了可以扩增出单独的ISSR标 记产生的多态性片段和单独的SCoT标记产生的多态性片段，还可以产生两种标记引物组 合所形成的多态性片段，多态性更强；(3)本发明方法是直接在原有引物基础上进行组合， 引物可以在物种间通用，大大减少了合成引物的费用，同时也大大提高了引物的使用率。
图1为SC-SSR标记方法扩增产物的多态性示意图2为SC-SSR标记引物SCoT 20/UBC 835在12个葡萄材料中扩增结果； 图3为SCoT标记引物SCoT 20在12个葡萄材料中扩增结果； 图4为ISSR标记引物UBC 835在12个葡萄材料中扩增结果； 其中图2-图4中的标号含义如下M为DL 2000 DNAMarker的电泳条带，1-12代表12 种葡萄品种，其对应的是相应材料扩增产物的电泳条带，1为98-2，2为洛浦早生，3为巨峰， 4为京秀，5为瑞比尔，6为森田尼，7为赤霞珠，8为霞多丽，9为藤稔，10为美人指，11为夏 黑，12为意大利。
具体实施例方式实施例1本实施例SC-SSR标记方法的步骤如下
(1)PCR扩增
PCR扩增的模板为12个葡萄品种(包括98-2、洛浦早生、巨峰、京秀、瑞比尔、森田尼、赤 霞珠、霞多丽、藤稔、美人指、夏黑、意大利)的基因组DNA，引物为SCoT引物20 (SCoT 20，具 体序列如表1所示)和ISSR引物835 (UBC 835，具体序列如表2所示)。PCR扩增的反应体 系采用常规的体系进行配制，反应条件为94°C预变性3min ；94°C变性lmin，50°C退火lmin， 72°C延伸2min，共35个循环；最后72°C延伸8min ；
(2)电泳检测(所用的电泳检测方法属于常规的检测方法)
首先制备1. 5%的琼脂糖凝胶，待胶凝固后，取PCR扩增产物，加入染色液并点样进行电 泳，电泳完成后，EB染色，紫外光下观察、拍照，电泳检测结果如图2所示。实施例2
本实施例SC-SSR标记方法的步骤如下
(1)PCR扩增所使用的模板和反应体系与实施例1相同，引物为SCoT引物4(SCoT4， 具体序列如表1所示)和ISSR引物863 (UBC 863，具体序列如表2所示)，反应条件为94°C 预变性3min ；94°C变性lmin，45°C退火lmin，72°C延伸2min，共35个循环；最后72°C延伸 8min ；
(2)电泳检测(所用的电泳检测方法属于常规的检测方法)
首先制备8%的聚丙烯酰胺凝胶，待胶凝固后，取PCR扩增产物，加入染色液并点样进行 电泳，电泳完成后，银染并在可见光下观察、拍照。实施例3
本实施例SC-SSR标记方法的步骤如下
(1)PCR扩增所使用的模板和反应体系与实施例1相同，引物为SCoT引物13(SCoT 13，具体序列如表1所示)和ISSR引物881 (UBC 881，具体序列如表2所示)，反应条件为 94°C预变性3min ；94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸2min，共35个循环；最后72°C 延伸8min ；
(2)电泳检测(所用的电泳检测方法属于常规的检测方法)
首先制备5%的聚丙烯酰胺凝胶，待胶凝固后，取PCR扩增产物，加入染色液并点样进行 电泳，电泳完成后，银染并在可见光下观察、拍照。实施例4
本实施例为对比例，采用SCoT标记方法和ISSR标记方法分别对实施例1中的12个葡 萄品种进行PCR扩增和电泳检测，用以与实施例1的检测结果进行对比。其中除了所使用 的引物不同之外，其他条件及方法均与实施例1的条件和方法相同，SCoT标记方法使用的 引物为SCoT 20，检测结果如图3所示；ISSR标记方法使用的引物为UBC 835，检测结果如 图4所示。由上述的图2-图4显示的结果可以看出，SC-SSR标记方法获得了较多的多态性 片段，优于单独的SCoT标记方法和ISSR标记方法，并且其PCR扩增效果与单独的标记引物 的扩增效果相当甚至更好，因此本发明方法是一种极为有效的分子标记方法。所述的引物序列附表如下 表1常用的SCoT引物序列
权利要求
一种DNA分子标记方法，采用常规的PCR反应体系和反应程序进行PCR扩增，扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，其特征在于PCR反应所使用的引物为组合引物，其中一个引物为SCoT标记引物，另一个引物为ISSR标记引物。
2.根据权利要求1所述的一种DNA分子标记方法，其特征在于所述的反应程序中，退 火温度为45-55°C。
全文摘要
本发明公开了一种DNA分子标记方法，所述方法是将SCoT标记引物与ISSR标记引物组合使用形成的一种新的标记方法SC-SSR。本发明方法操作简单，稳定性好，多态性高；综合了SCoT标记方法和ISSR标记方法的优势，也就是说不仅具有ISSR的多态性优势，而且可以使扩增位点与表达序列紧密连锁，可获得更丰富的遗传信息；本发明方法是直接在原有引物基础上进行组合，引物可以在物种间通用，大大减少了合成引物的费用，同时也大大提高了引物的使用率。
文档编号C12Q1/68GK101942504SQ20101012716
公开日2011年1月12日 申请日期2010年3月18日 优先权日2010年3月18日
发明者侯小改, 吴正景, 张君玉, 张国海, 李猛, 王娟, 郭大龙 申请人:河南科技大学