专利名称：水稻颖壳发育基因启动子p-TRI1及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种水稻颖壳发育基因启动子P-TRIl及其应用。
背景技术：
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是单子叶植物发育生物学研究较理想的模式植物。水稻花器官还是粮食赖以形成的基础。对水稻花发育的研究已开始成为植物分 子遗传学的一个新的焦点。近年来有关水稻花发育基因调控的研究已取得了长足的进展。通过对拟南芥和金鱼草的同源异型基因突变体的研究，确定了双子叶植物的ABC 模式，即四个轮环的花器官是由三类基因的互作控制，这三类基因分别称为A、B、C类基因， 其中每类基因负责调控相邻两个轮环的花器官的形成。其中A类基因负责调控第一、第二 轮环，即花萼、花瓣的形成；B类基因负责调控第二、第三轮环，即花瓣、雄蕊的形成；C类基 因负责调控第三、第四轮环，即雄蕊、心皮的形成。通过对一些A、C类基因的突变体研究 表明，A、C两类基因的作用是相互拮抗的(Coen ES andMeyerowitz EM. The war of the whorls :Genetic interactions controlling flowerdevelopment. Nature,1991,353 31-37 ；Theissen G,and Saedler H. Plant biology. Floral quartets. Nature, 2001,409 469-471.)。水稻的花发育研究是在双子叶模式植物拟南芥和金鱼草的基础上发展起来的。单 子叶植物的花和花分生组织的许多特征明显不同于双子叶植物。在单子叶植物中，禾本 科植物的花最具多样性，其中水稻的花器官在禾本科植物中更具代表性。水稻花的单位 是小穗，小穗由两个颖片和一朵小花所构成，小花从内向外依次由一个雌蕊，六枚雄蕊，两 个浆片，一个内稃和一个外稃构成。尽管在花器构成方面双子叶植物和禾本科植物——7jC 稻具有很大差异，但其大致结构也可看成是由四个轮环组成。通过对一些已经克隆的突 变基因，如 SPWl(Nagasawa N, Miyoshi M, Sano Y, Satoh H, HiranoH, Sakai H, Nagato, Y.SUPERffOMANl and DROOPING LEAF genes control floral organidentity in rice. Development,2003,130 :705_718), DL(Yamaguchi T, NagasawaN, Kawasaki S, Matsuoka, Nagato Y, Hirano HY. The YABBY gene DROOPING LEAFregulates carpel specification and midrib development in Oryza sativa.The PlantCell,2004,16 500-509)以 及其他水稻的 MADS-box 基因，如 0sMADS2 和 0sMADS4，0sMADS3 和 0sMADS58 (Bommert P, Satoh-Nagasawa N, Jackson D, and Hirano HY.Genetics and evolution of inflorescence and flower development in grasses. PlantCell Physiol.,2005,46 69-78 ；Yamaguchi T, Lee DY, Miyao A, Hirochika H, An G, and Hiranoa HY. Functional diversification of the two C-class MADS Boxgenes 0sMADS3 and 0sMADS58 in Oryza sativa. Plant Cell, 2006,18 =15-28.)的研究表明，B类和C类基因在调控水稻浆片，雄蕊 和心皮的发育三个轮环上是保守的。但是有关内外颖的发育调控机制一直都比较模糊，也是最受争议的。Yuan 等(YuanZ, Gao S，Xue DW, Luo D，Li LT, Ding SY, Yao X，Wilson ZA, Qian Q，ZhangDB. Retardedpaleal controls palea development and floral zygomorphy in rice. PlantPhysiol. , 2009,149 =235-244.)发现了一个内颖发育异常的基因REP1。这个基因的 突变导致内颖发育异常，并且在变异的内颖中具有五个维管束组织，这一特质与外颖相似。 基因的表达在起始阶段也被限制在内颖原基中，之后扩散到其他的组织中。研究者使用了 组成型启动子进一步研究基因的功能。因而，对于内外颖的发育的机理研究，特别是与内外颖发育相关基因的研究就更少了。从突变体库中发现新的花器发育的新基因及其启动子不仅在水稻颖花发育机理研究 方面具有重要作用，在农业领域具有广阔的应用和市场前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻颖壳发育基因启动子P-TRIl及其应用。本发明提供的水稻颖壳发育基因启动子，其名称为p-TRIl，来源于稻属普通栽培 稻(0. sativa L.)93-11。本发明提供的DNA片段(启动子)，为如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。上述严格条件可为在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下 杂交并洗膜。序列表中序列1所示的DNA序列由2229个核苷酸组成，含有作用元件E2F、AP-2 和T-Ag，这些转录因子与细胞的分裂增殖相关。利用该基因启动子片段构建的诱导性表达 载体可以在植物细胞增殖区域特别是维管束区强烈地诱导目标基因的表达。含有所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的 保护范围。用于构建含有所述启动子的植物表达载体的出发载体可为pCAMBIA1300、pBI121、 pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1381 或 pCAMBIA1301_UbiN 等。所述重组载体可为在 pCambial381的多克隆位点插入DNA片段得到重组质粒。所述重组载体具体可为将序列1 所示DNA片段插入pCambial381的EcoRI和SalI酶切识别位点间得到的重组质粒。扩增所述DNA片段的全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述DNA片段可应用于启动目的基因表达。所述目的基因表达可为组织特异表达 和/或时间特异性表达。所述组织特异表达具体可为颖壳特异性表达。水稻颖壳上具有较 高的表达活性，特别是颖壳的维管束处达到最高，而在其他组织如剑叶、枝梗和节间中的表 达量极低，甚至不表达。所述时间特异性表达为花序发育期特异性表达。水稻花序发育的 各个时期(花序轴长度0. 2-6. 0cm)都有强烈表达。所述DNA片段可应用于培育转基因植物。所述转基因植物可为转基因水稻，如中 花17。所述应用中，可将所述重组载体导入水稻品种中花17，得到转基因水稻；所述转基因 水稻中，由所述DNA片段启动GUS基因的表达。本发明启动子的发现和其功能的阐明，将对水稻花器发育机理特别是颖壳发育机制的研究，具有特定粒型的水稻品种的选育具有重要的理论及实际意义。该启动子对于水稻颖壳发育分子机制的研究，以及水稻粒型分子育种具有重要的理论及实际意义。本发明 在农业领域具有广阔的应用和市场前景。
图1为93-11花序各个发育时期及不同器官中基因的表达分析，其中9InS 93-11的花序轴长度< 0. 5cm，9InL 花序轴长度在0. 5-1. 5cm，9InLl 9311花序轴长度在
1.5-3cm，9InL2 花序轴长度在3_4cm，9InL3 花序轴长度在4_5cm，9InL4 花序轴长度在5-6cm的发育成型的幼嫩颖壳(长度< 0. 5cm),9LE 成型绿色外颖，9PE 成型绿色内颖， 9ST 雄蕊，9PI 雌蕊和子房，9BRA 枝梗，9LEAF 剑叶，9N0DE 穗下节，9CULM 穗下节间。图2为以93-11基因组DNA为模板在引物7E⑶S引导下的PCR扩增产物；1为 MarkerIII (所用Marker为天根生化科技有限公司的Markerlll，货号MD102_01) ；2为PCR 产物。图3为P-TRIl转基因水稻的⑶S组织染色结果。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。所用引物合成及测序工作均由北京奥科生物科技有限责任 公司完成。93-11 国家种质资源库。中花17 国家种质资源库。pCambial381 =GenBank 号AF234302o实施例1、水稻颖壳发育基因启动子P-TRIl的发现一、水稻颖壳发育基因TRIl的发现将93-11经EMS(甲基磺酸乙脂)处理并经过多代自交和性状观察后，形成基因 型纯和的突变体系。通过对这些突变体系的筛选发现了一个颖壳发育异常的突变体，这个 突变体的具体表现是突变体颖壳比正常的野生型颖壳宽度变窄，即9311的颖壳宽度为
2.84士0. 08mm，突变体的颖壳宽度为2.33士0. 11mm。但二者的颖壳在长度上无差异。最明 显的特征是在其尖端展现出三角形状的变异，故命名为tril。将tril分别与93-11，特青，桂朝2号，中花17，C418等常规品种进行杂交，杂交 F1代表现野生型颖壳特征，从而可以推测出控制这个突变性状的基因是隐身的。杂交5经 过自交后产生F2后代中隐性个体，即表型与tril相同的单株与野生表型的单株比例接近 3 1 (X2xc < X2xo.05jl = 3. 84)。由此可以得出水稻三角颖壳性状由一个隐性单基因控制， 这个基因被命名为TRIl。首先用tril与桂朝2号杂交的小F2,将基因TRIl初略定位在第二染色体的SSR 标记RM213附近。之后，用tril与C418回交F2中的隐形个体将基因TRIl初步定位在两 个标记RM8048和RM3850(RM213附近)之间。这之后，应用四个标记之间的在两个亲本之 间具有差异的SSR标记(RM3774、RM14165、RM3248、RM1255)以及一个CAPs标记(Cl)和两个测序标记(C2，C3)最终将基因定位在一个CAPs标记(Cl)和一个测序标记之间，中间的 物理距离约60kb。分别上述获得的区域，设计引物对HXl (HX1F/HX1R)，扩增tril和93_11基因组 DNA，寻找EMS诱变产生的基因序列方面的差异。PCR扩增的反应体系为水稻基因组DNA模 板 20ng，Taq Plus DNA 聚合酶 0. 5U，2. 0 μ 1 10 XPCR 缓冲液(IOOmM Tris 'ClpH9. 0,500mM KCl, 15mM Mg2+, 1% Triton X-100)，100 μ M dNTPs，正向引物 0. 2 μ M，反向引物 0. 2 μ M，用 ddH20补充反应体系至20 μ 1。PCR反应条件为先94°C4min ；随后94°C 45sec，58°C 45sec， 72°C 2min，共31个循环；再72°C IOmin0通过浓度为1 %的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物 中是否有目的条带，检测到明亮单一的目的条带后再送奥科测序(测序引物为HX1R)。测序 结果进行比对，发现与93-11相比，tril中一个C碱基缺失(gagacgca——gagacga)，从而 导致编码序列发生移码。HXlF :5，-gtactggcaaagcaagatgg-3，；HXlR :5，_atcgggaagcagattcatcc_3，。通过转RNAi载体验证了突变体性状是由于基因TRIl的功能缺失引起的。二、水稻颖壳发育基因启动子P-TRIl的发现首先研究TRIl在水稻各个发育时期和不同的组织中的表达情况。通过对不同组 织的RNA提取和之后的实时荧光定量PCR数据分析，发现TRIl在启动子的牵引下，具有时 空表达差异。在水稻小穗发育的各个时期均有较高水平的转录本积累，在水稻内、外颖、雌 蕊和穗下节中均有表达，但在剑叶和节间中表达量很低，在雄蕊的花药中基本不表达(图 1)。利用primerf引物设计软件设计引物，在引物两端引入限制性内切酶识别位点及 保护碱基，引物序列如下7EGUSF :5，-aRcGAATTCctRccacaaRatatRttcRR-3’ 7EGUSR :5，-a caei￡eA￡gcaacctgaatcacaagaagc-3’;7EGUSF中，带下划线碱基为限制性内切酶EcoRI识别 位点，其前面的age为保护碱基；7EGUSR中，带下划线碱基为限制性内切酶SalI的识别位 点，其前面的aca为保护碱基。以93-11的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应程序为先94°C 5min ；然 后 94°C 30sec，58°C 45sec，68°C 2min30sec，共 30 个循环；最后 68°C lOmin，获得目的产物。 反应结束后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示。将PCR产物 进行测序，测序结果表明，PCR产物具有序列表的序列1所示的DNA片段，将序列表的序列1 所示的DNA片段命名为p-TRIl(水稻颖壳发育基因启动子)。将序列1所示的DNA片段在promoter scan(http //www-bimas. cit. nih. gov/molbio/proscan/) r^WifyMfi, RM^t^^.^ 内含有与细胞的分裂增殖相关的转录因子作用元件E2F、AP-2和T-Ag。实施例2、P-TRIl转基因水稻的获得及其鉴定一、P-TRIl植物表达载体的构建一、p-LTT7植物表达载体的构建
1、以93-11水稻的基因组DNA为模板，用特异性引物对T7EUS (T7EUSF/T7EUSR)，使 用东洋纺(Τ0Υ0Β0)生物公司的KODplus酶反应试剂盒进行PCR扩增，反应结束后，对PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化2229bp的DNA片段(p_LTT7)(所用回收试剂盒为天根生化科技有限公司的DNA产物纯化试剂盒，货号DP204-02)。2、用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切步骤1回收的PCR产物。3、用限制性内切酶EcoRI和Sal I酶切植物表达载体pCambial381，回收载体骨架。4、将步骤2的酶切产物与步骤3的载体骨架(5-10摩尔酶切产物1摩尔载体骨架)连接(16°C过夜)；连接产物转化大肠杆菌TOPlO (北京拓英坊科技有限公司)感受态， 涂布具有卡那霉素抗性的LB平板，37°C培养14-16个小时，挑取白斑37°C摇菌后提取重组 质粒。5、将重组质粒进行测序，测序结果表明，得到了重组质粒pCambia1381-pTRIl (在 pCambial381的EcoRI和SalI酶切位点之间插入序列表的序列1所示的DNA片段)。二、转化水稻将pCambia1381-pTRIl用基因枪法转化中花17的成熟胚愈伤组织，用含50mg/L 潮霉素的NB培养基进行2轮筛选，每轮筛选20-30天，经预分化、分化得到阳性植株。将阳 性植株进行PCR鉴定，结果表明，得到了 Ttl代转基因植株。将pCambial381用基因枪法转化日本晴的成熟胚愈伤组织，用含50mg/L潮霉素的 NB培养基进行2轮筛选，每轮筛选20-30天，经预分化、分化得到Ttl代转空载体对照植株。三、转基因水稻的组织表达特异性分析将Ttl代植株进行自交，得到Ttl代植株的种子(T1代)。将Ttl代植株的种子(转基因植株和转空载体对照植株)进行培养，对获得的稻穗 进行GUS组织染色，结果发现转基因植株的GUS基因在水稻颖壳即内外颖上具有较高的表 达活性，特别是颖壳的维管束处达到最高，而在其他组织如剑叶、枝梗和节间中的表达量极 低，甚至不表达(图3)；转空载体对照植株的各个发育时期的组织和器官均未染色成功，脱 色反应之后均为白色的。实施例2的实验重复进行三次，都得到的同样的结果。
权利要求
一种DNA片段，为如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。
2.含有权利要求1所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为在pCambial381的多 克隆位点插入权利要求1所述DNA片段得到重组质粒。
4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为将序列1所示DNA片 段插入pCambial381的EcoRI和SalI酶切识别位点间得到的重组质粒。
5.扩增权利要求1所述DNA片段的全长或其任意片段的引物对。
6.权利要求1所述DNA片段在启动目的基因表达中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述目的基因表达为组织特异表达和/或 时间特异性表达。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述组织特异表达为颖壳特异性表达，优选 颖壳维管束特异性表达；所述时间特异性表达为花序发育期特异性表达。
9.权利要求1所述DNA片段在培育转基因植物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述转基因植物为转基因水稻，优选中花 17 ；所述应用中，将权利要求4所述重组载体导入水稻品种中花17，得到转基因水稻；所述 转基因水稻中，由权利要求1所述DNA片段启动GUS基因的表达。
全文摘要
本发明公开了一种水稻颖壳发育基因启动子p-TRI1及其应用。本发明提供的启动子来源于稻属普通栽培稻(O.sativa L.)93-11，为如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。本发明启动子的发现和其功能的阐明，将对水稻花器发育机理特别是颖壳发育机制的研究，具有特定粒型的水稻品种的选育具有重要的理论及实际意义。该启动子对于水稻颖壳发育分子机制的研究，以及水稻粒型分子育种具有重要的理论及实际意义。本发明在农业领域具有广阔的应用和市场前景。
文档编号C12N15/11GK101812451SQ20101012241
公开日2010年8月25日 申请日期2010年3月11日 优先权日2010年3月11日
发明者付永彩, 刘凤霞, 孙传清, 孙连军, 才宏伟, 朱作峰, 李晓娇, 谢道昕, 谭禄宾 申请人:中国农业大学