产气荚膜梭菌检测试剂盒及其使用方法

专利名称：产气荚膜梭菌检测试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种产气荚膜梭菌检测试剂盒及其使用方 法。
背景技术：
产气荚膜梭菌为厌氧芽胞菌，是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一，可引起典 型的食物中毒。美国疾病控制中心，估计每年因产气荚膜梭菌引起的食物中毒约近1万人。 产气荚膜梭菌广泛分布于环境中，易于形成芽胞。该细菌的芽胞长期存在于土壤和沉淀物 中，芽胞的热抵抗力很强。该菌也经常被发现在人和动物的肠道中存在。从牛肉、猪肉、羔 羊、鸡、火鸡、焖肉、红烧蔬菜，炖肉和肉汁中分离的产气荚膜梭菌，引起食物中毒的食品大 多是畜禽肉类和鱼类食物，牛奶也可因污染而引起中毒。此外不少熟食品，由于加温不够或 后污染而在缓慢的冷却过程中，细菌繁殖体大量繁殖并形成芽胞产生肠毒素，其食品并不 一定在色味上发现明显的变化，人们在误食了这样的熟肉或汤菜，就有可能发病。虽然传统产气荚膜梭菌检测方法是可靠的，但却很费力、耗时，需要4 7天才能 完成。由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。 因此，在需要及时、快速评价食品中微生物的安全性时，通常不被采用。以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中存在 一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染 和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real timePCR)技术虽然较 好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此 不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较 高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定 性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技 术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中恒温扩增 (IsothermalAmplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已 建立起来的环介导恒温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性。因此，需要一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的产气荚膜梭菌检测试剂盒 及其使用方法以解决上述问题。

发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种检测效果更全面、特异性 高、漏检率低的产气荚膜梭菌检测试剂盒。本发明的目的可以通过以下技术措施实现一种产气荚膜梭菌检测试剂盒，所述 的产气荚膜梭菌检测试剂盒包括以产气荚膜梭菌的16S rDNA基因为靶基因、基于环介导 恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。16S rDNA是编码原核生 物核糖体小亚基rRNA(16SrRNA)的基因。长度约为1500bp，是细菌分类学研究中最常用、
5最有用的“分子钟”，其序列包含10个可变区(variable region)和与之相同的11个恒定 区(constant region)，可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关；较之 23SrDNA等看家基因而异，它具有分子大小适中，突变率小等优点，素有“细菌化石”之称。 Woese与Olsen基于对16SrDNA的分析构建了现已被分认的全生命系统进化树，越来越多的 细菌依据16SrDNA被正确分类或重分类，尤其是许多环境中的细菌。同时，16S rDNA也被广 泛应用于各类生物的核酸检测中。对nt库(所有已经测序的核酸序列数据库)进行BLAST搜索，除产气荚膜梭菌 (Clostridium perfringens)外，无其它高同源性序列。故假阳性可能性极低，该序列适合 作为LAMP扩增的靶标序列。作为本发明产气荚膜梭菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的两对引物为外引物F3(l) (SEQ ID NO 1)
AACCTTCATCACTCACGCG外引物B3(l) (SEQ ID NO 2)GCAATCCGCTATGAGATGGA内引物 FIP(I) (SEQ ID NO 3)TGATCGGCCACATTGGGACTGATTTTGGTTTCCCCCATTGTGCA内引物 BIP(I) (SEQ ID NO 4)CAGGTCGGCTACGCATCGTCTTTTCGGCGCATTAGCTAGTTGG或外引物F3(2) (SEQ ID NO 1)AACCTTCATCACTCACGCG外引物B3(2) (SEQ ID NO 2)GCAATCCGCTATGAGATGGA内引物 FIP (2) (SEQ ID NO 5)TGATCGGCCACATTGGGACTGAGGTTTCCCCCATTGTGCA内引物 BIP (2) (SEQ ID NO 6)CAGGTCGGCTACGCATCGTCCGGCGCATTAGCTAGTTGG或外引物F3(3) (SEQ ID NO 7)GGGGTAACGGCCTACCAA外引物B3(3) (SEQ ID NO 8)CCTCCTTGGGTACCGTCATT内引物 FIP (3) (SEQ ID NO 9)AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTTTTTGATGCGTAGCCGACCTGA内引物 BIP (3) (SEQ ID NO 10)CAATGGGGGAAACCCTGATGCATTTTTCTTCCCCAAAGACAGAGCT或外引物F3(4) (SEQ ID NO 7)GGGGTAACGGCCTACCAA
外引物B3(4) (SEQ ID NO 8)CCTCCTTGGGTACCGTCATT内引物 FIP (4) (SEQ ID NO 11)AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTGATGCGTAGCCGACCTGA内引物 BIP (4) (SEQ ID NO 12)CAATGGGGGAAACCCTGATGCATCTTCCCCAAAGACAGAGCT。作为本发明产气荚膜梭菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的产气荚膜梭菌检测 试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、甜菜碱、硫酸镁、显色液、稳定液和阳性对照。作为本发明产气荚膜梭菌检测试剂盒的更优选实施方式，所述的BstDNA聚合酶 酶浓度7-IOU/ μ L ；所述的缓冲液含0·18-0. 25mol/L Tris-HCl，0· 10-0. 15mol/L KCl， 0.07-0. 15mol/L (NH4)2SO4,15-30mmol/L MgSO4,1-2% TritonX-IOO ；所述的dNTPs 每种核苷酸浓度10-20mmol/L ；所述的甜菜碱浓度3-6mol/L ；所述的硫酸镁浓度100-200mmol/L ；所述的显色液为SYBR Green I 或 Eva Green ；所述稳定液为石蜡油；所述的阳性对照为产气荚膜梭菌基因组DNA。作为本发明产气荚膜梭菌检测试剂盒的最优选实施方式，所述的Bst DNA聚合酶 酶浓度8U/ μ L ；所述的缓冲液含0.2mol/LTris-HCl，0. lmol/L KCl，0. lmol/L(NH4)2SO4, 20mmol/L MgSO4,1% TritonX-100 ；所述的dNTPs 每种核苷酸浓度10mmol/L ；所述的甜菜碱浓度5mol/L ；所述的硫酸镁浓度150mmol/L。作为本发明产气荚膜梭菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的产气荚膜梭菌检测 试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其 分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。作为本发明产气荚膜梭菌检测试剂盒的更优选实施方式，所述的A、B两个空腔中 分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为缓冲液、 dNTPs、甜菜碱、硫酸镁、水和Bst DNA聚合酶的混合而成。环介导恒温扩增技术(LAMP)是一种快速、灵敏、准确的核酸检测方式，其扩增效 率超强，表现在两个方面(1)灵敏度比PCR高出的是数量级的差异；(2)扩增产物的DNA数 量，也比PCR产物高出太多，能够达到几个μ g，但过于灵敏和产物量的巨大，使得LAMP极易 容易污染，尤其是在LAMP扩增反应后需要反应管开盖加入显色剂，容易出现气溶胶污染。 而气溶胶污染会使得检测结果假阳性率高，并且污染其他样品，污染检测区域，同时还难以 去除。本发明的反应管通过隔板和稳定液的设计，有效地将显色液和工作液分隔开来，不仅 能保证在储运过程中相对保持完整封闭性，而且无需打开管盖，就可以实现显色反应，大大 降低气溶胶的污染。
本发明还提供一种使用产气荚膜梭菌检测试剂盒的方法，该方法包括如下步骤(1)将待测样品增菌，得到样品增菌液；(2)将样品增菌液提取样品模板DNA ；(3)在反应容器中加入Bst DNA聚合酶1.8 2. 4体积份数、缓冲液10体积份数、 dNTPs15 20体积分数、甜菜碱15 20体积分数、硫酸镁15 20体积分数、稳定液25 35体积份数、样品模板DNA 10体积份数、内引物FIP/BIP各2体积份数、外引物F3/B3各4 体积分数，恒温反应；(4)在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混勻，样品组显色与对照组相 同则为阳性，否则为阴性；所述步骤(3)中的内引物FIP/BIP和外引物F3/B3为以产气荚膜梭菌的16SrDNA 基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物。作为本发明使用产气荚膜梭菌检测试剂盒的方法的优选实施方式，所述的两对引 物可以为外引物F3(l) (SEQ ID NO 1)AACCTTCATCACTCACGCG外引物B3(l) :(SEQ ID NO 2)GCAATCCGCTATGAGATGGA内引物 FIP(I) (SEQ ID NO 3)TGATCGGCCACATTGGGACTGATTTTGGTTTCCCCCATTGTGCA内引物 BIP(I) (SEQ ID NO 4)CAGGTCGGCTACGCATCGTCTTTTCGGCGCATTAGCTAGTTGG或外引物F3(2) (SEQ ID NO 1)AACCTTCATCACTCACGCG外引物B3(2) (SEQ ID NO 2)GCAATCCGCTATGAGATGGA内引物 FIP (2) (SEQ ID NO 5)TGATCGGCCACATTGGGACTGAGGTTTCCCCCATTGTGCA内引物 BIP (2) (SEQ ID NO 6)CAGGTCGGCTACGCATCGTCCGGCGCATTAGCTAGTTGG或外引物F3(3) (SEQ ID NO 7)GGGGTAACGGCCTACCAA外引物B3(3) (SEQ ID NO 8)CCTCCTTGGGTACCGTCATT内引物 FIP (3) (SEQ ID NO 9)AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTTTTTGATGCGTAGCCGACCTGA内引物 BIP (3) (SEQ ID NO 10)CAATGGGGGAAACCCTGATGCATTTTTCTTCCCCAAAGACAGAGCT
或外引物F3(4) (SEQ ID NO 7)GGGGTAACGGCCTACCAA外引物B3(4) (SEQ ID NO 8)CCTCCTTGGGTACCGTCATT内引物 FIP (4) (SEQ ID NO 11)AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTGATGCGTAGCCGACCTGA内引物 BIP(4) (SEQ ID NO 12)CAATGGGGGAAACCCTGATGCATCTTCCCCAAAGACAGAGCT。作为本发明使用产气荚膜梭菌检测试剂盒的方法的优选实施方式，步骤(3)中， 恒温反应的反应条件为温度63 65°C，反应时间45 90min。本发明所说的基于环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication of DNA，简称LAMP)快速检测产气荚膜梭菌的方法，是利用Bst DNA聚合酶和 根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性 识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果 在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎_环DNA混合物。LAMP反应 过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁 乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63 65°C )条件下45 90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传 统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员 的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本 低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩 增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特 异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即 可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。目前国家标准中以 微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴 定需2 3天，完成鉴定报告需10 15天；采用本发明的检测试剂盒仅需2小时。并且， 本发明的反应体系中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明的检测试剂盒只需一个恒 定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试 剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高 特异性；3.本发明的检测试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高； 4.本发明的检测试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发明的基因快速诊断 试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物—— 焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证 率高，更加明显可靠；6.由于选择了高保守性的16S rDNA基因作为靶基因设计引物，使得 本发明的检测试剂盒检测产气荚膜梭菌的准确率更高；7.在本发明检测试剂盒中采用特 制的反应管，减少了气溶胶污染的可能性，同时方便操作。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。下列缩略语适用于本发明LAMP loop-mediated isothermal amplification,环介导恒温扩增dNTP :deoxyribonucleoside triphosphate,Bst 酶Bst DNA polymerase (large fragment), Bst DNA 聚合酶(大片段)EDTA :ethylenediamine tetraacetic acid，Zi二月安0 !DNA deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸Betaine 甜菜碱Triton X-100 聚乙二醇辛基苯基醚实施例1试剂盒的制备(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物外引物F3(l) :(SEQ ID NO 1)AACCTTCATCACTCACGCG外引物B3(l) (SEQ ID NO 2)GCAATCCGCTATGAGATGGA内引物 FIP(I) (SEQ ID NO 3)TGATCGGCCACATTGGGACTGATTTTGGTTTCCCCCATTGTGCA内引物 BIP(I) (SEQ ID NO 4)CAGGTCGGCTACGCATCGTCTTTTCGGCGCATTAGCTAGTTGG。(2)购置DNA聚合酶Bst DNA聚合酶置于容器；(3)配制缓冲液缓冲液按 0. 18mol/L Tris_HCl，0. 10mol/L KCl，0. 07mol/ L(NH4)2SO4,15mmol/L MgSO4,1 体积％ TritonX-100 配制，置于容器；(4)配制dNTPs 每种核苷酸浓度按lOmmol/L配制，置于容器；(5)配制甜菜碱甜菜碱浓度按3mol/L配制，置于容器；(6)配制硫酸镁溶液硫酸镁浓度按lOOmmol/L配制，置于容器；(7)购置稳定液石蜡油，置于容器；(8)购置显色液SYBR Green I，置于容器；(9)提取阳性对照提取产气荚膜梭菌基因组DNA，置于容器；(10)将上述9个容器装成试剂盒，封装；制备工艺简述如下1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质 检；2、将反应液[即上述(2)_(6)步骤配制的液体]无菌分装，并按照实验用进行浓 度确定，抽样质检；3、将稳定液分装，抽样质检；4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；5、组装试剂盒。实施例2试剂盒的制备(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物 外引物 F3(2) :(SEQ ID NO 1) AACCTTCATCACTCACGCG
外引物 B3(2) :(SEQ ID NO 2)
GCAATCCGCTATGAGATGGA
内引物 FIP (2) :(SEQ ID NO 5)
TGATCGGCCACATTGGGACTGAGGTTTCCCCCATTGTGCA
内引物 BIP (2) :(SEQ ID NO 6)
CAGGTCGGCTACGCATCGTCCGGCGCATTAGCTAGTTGG。
(2)购置DNA聚合酶BstDNA聚合酶置于容器；
(3)配制缓冲液缓冲液按0. 25mol/L Tris-HCl，0. 15mol/L KCl，0. 15mol/ 2S04,30mmol/L MgSO4, 2 体积％ TritonX-100 配制，置于容器；
(4)配制dNTPs每种核苷酸浓度按20mmol/L配制，置于容器；
(5)配制甜菜碱甜菜碱浓度按6mol/L配制，置于容器；
(6)配制硫酸镁溶液硫酸镁浓度按200mmol/L配制，置于容器；
(7)购置稳定液石蜡油，置于容器；
(8)购置显色液EvaGreen，置于容器；
(9)提取阳性对照提取产气荚膜梭菌基因组DNA，置于容器；
(10)将上述9个容器装成试剂盒，封装； 其他同实施例1。
实施例3试剂盒的制备
(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物 外引物 F3(3) :(SEQ ID NO 7) GGGGTAACGGCCTACCAA
外引物 B3(3) :(SEQ ID NO 8)
CCTCCTTGGGTACCGTCATT
内引物 FIP (3) :(SEQ ID NO 9)
AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTTTTTGATGCGTAGCCGACCTGA
内引物 BIP (3) :(SEQ ID NO 10)
CAATGGGGGAAACCCTGATGCATTTTTCTTCCCCAAAGACAGAGCT。
(2)购置DNA聚合酶BstDNA聚合酶置于容器；
(3)配制缓冲液缓冲液按0. 2mol/L Tris-HCl,0. lmol/L KCl，0. Imo 1/ 2S04,20mmol/L MgSO4,1 体积％ TritonX-100 配制，置于容器；
(4)配制dNTPs每种核苷酸浓度按lOmmol/L配制，置于容器；
(5)配制甜菜碱甜菜碱浓度按5mol/L配制，置于容器；
(6)配制硫酸镁溶液硫酸镁浓度按150mmol/L配制，置于容器；
(7)购置稳定液石蜡油，置于容器；
(8)购置显色液EvaGreen，置于容器；
(9)提取阳性对照提取产气荚膜梭菌基因组DNA，置于容器；
(10)将上述9个容器装成试剂盒，封装；其他条件与实施例1相同。在本发明的其他实施例中，可以针对产气荚膜梭菌的16S rDNA基因，根据LAMP技 术的引物设计原则设计得到其他的引物，例如外引物F3(4) (SEQ ID NO 7)GGGGTAACGGCCTACCAA外引物B3(4) (SEQ ID NO 8)CCTCCTTGGGTACCGTCATT内引物 FIP (4) (SEQ ID NO 11)AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTGATGCGTAGCCGACCTGA内引物 BIP (4) (SEQ ID NO 12)CAATGGGGGAAACCCTGATGCATCTTCCCCAAAGACAGAGCT。上述引物对均能达到本发明产气荚膜梭菌检测试剂盒的检测效果。实施例4产气荚膜梭菌检测试剂盒的应用本方法的主要技术要点是1)样品的制备和选择性增菌依据GB/T 4789. 13《食品微生物学检验产气荚膜 梭菌检验》方法进行样品制备和选择性增菌。2)提取增菌液模板DNA进行环介导等温扩增后进行快速筛选。3)阴性结果可以直接出报告，阳性结果采用传统方法分离鉴定后确认。本发明建立体系如下表示表1产气荚膜梭菌菌LAMP反应体系
组分工作液浓度加样量μ 反应体系终浓度ThermoPol缓沖液IOx2.5Ix外引物1 (F3)10 μπιοΙ/L0.50.2 μπιοΙ/L外引物2 (B3)10 μπιοΙ/L0.50.2 μηιοΙ/L内引物1 (FIP)40 μπιοΙ/L1.01.6 μπιοΙ/L内引物2 (BIP)40 μιηοΙ/L1.01.6 μπιοΙ/LdNTPs10 mmol/L41.6 mmol/L甜菜碱5 mol/L40.8 mol/LMgSO4150 mmol/L18 mmol/LBst DNA聚合酶8 U^L0.50.16 U/μ DNA模板/2.5/去离子水/7.5/1.1特异性特异性试验采用菌株来自各检验检疫局并经过GB方法确认。
12 1. 1. 1对上述菌株按照GB/T 4789. 13标准方法进行培养获得菌液，采用本发明方 法进行LAMP检测1)提取细菌DNA模板a)取增菌培养液1. 5ml于2ml离心管，IOOOOrpm,离心2min，去上请；b)加入Iml TE洗涤菌体一次，IOOOOrpm,离心2min，去上请；c)加入500 μ L TE (ρΗ8. 0)充分振荡，重悬菌体；d)往管中加入10 15 μ L溶菌酶溶液(50mg/ml，20000U/mg)至终浓度lmg/ml， 混勻，37°C，反应2 3h，并每IOmin振荡一次；e)再加入1(^1^蛋白酶1((2011^/1111)，混勻，371，反应111;f)接着加入52 μ L 10% SDS至终浓度1 %，混勻，37°C，温浴30min ；g)加入 100 μ L 5Μ NaCl，80 μ L CTAB/NaCl，混勻，65°C，温浴 IOmin ；h)加入等体积(约750 μ L)氯仿/异戊醇(24 1)，充分混勻，12000rmp,离心 5min ；i)小心移取上清至新的无菌2ml离心管中，加入等体积(约650yL)酚/氯仿/ 异戊醇(25 24 1)，充分混勻，12000rmp，离心5min ；j)小心移取上清液至另一新的无菌2ml离心管中，加入1/10体积的3MNa0Ac (pH6. 0)以及2倍体积(Iml)的冰冻无水乙醇，混勻，观察是否有絮状沉淀，-20°C 放置30min或者更长时间；k) 12000rmp，4°C离心，lOmin，去上清；1)加入冰冻70%乙醇洗涤沉淀，12000rmp，4°C离心，lOmin，去上清；m)沉淀置通风厨处风干(约30min)，加入200 μ L TE (ρΗ8. 0)溶解沉淀；η)加入 20g RNase A，37°C，反应 30min ；ο)再加入 400 μ L TE (ρΗ8. 0)和等体积(600 μ L)酚/ 氯仿 /异戊醇(25 24 1)， 充分混勻，12000rmp,离心5min ；ρ)小心移取上清至新的无菌2ml离心管中，加入1/10体积的3M NaOAc (ρΗ6. 0)和 2倍体积(Iml)的冰冻无水乙醇，混勻，-20°C放置30min或者更长时间；q) 12000rmp，4°C 离心，lOmin，去上清；r)加入冰冻70%乙醇洗涤沉淀，12000rmp，4°C离心，lOmin，去上清；s)沉淀置通风厨处风干后，加入适量ΤΕ(ρΗ8. 0)或者无菌水溶解，可立即使用。2)按研制的体系配制反应液，对上述模板进行LAMP反应，判断引物特异性。反应管中加入22 μ L的反应液+0. 5 μ L的DNA聚合酶+30 μ L的稳定液+2. 5 μ L待 检模板；65°C环介导等温反应60min ；往反应管中加入2 μ L显色液，封管后轻轻摇勻观察， 反应管液体呈绿色，为产气荚膜梭菌阳性，呈橙色则为阴性。所述的反应液为反应体系中的 缓冲液、dNTPs、甜菜碱、硫酸镁、水混合而成。产气荚膜梭菌ATCC13124检测结果阳性，6株产气荚膜梭菌分离株为阳性。乙型溶 血性链球菌为阴性，副溶血弧菌为阴性，李斯特氏菌为阴性，金黄色葡萄球菌为阴性，志贺 氏菌为阴性，大肠杆菌为阴性，沙门氏菌为阴性。1.1.2干扰实验1)取产气荚膜梭菌ATCCl3124、沙门氏菌CCTCCAB94006、乙型溶血性链球 菌CMCC (B) 32210、副溶血弧菌ATCCl7802、李斯特氏菌CCTCCAB97021、金黄色葡萄球菌 CMCC (B) 26003、志贺氏菌51334-20、大肠杆菌CCTCCAB200068共八株菌，液体培养到OD6tltl为 0.4左右，此时菌液浓度大约为108CFU/mL，进行10倍梯度逐倍稀释到浓度为IO7-IO2CFU/
mLo2)准备8个锥形瓶，每个盛有IOOmL肉汤培养基，8个瓶中接入终浓度分别为 (1) 102CFU/mL产气荚膜梭菌+104CFU/mL沙门氏菌；⑵102CFU/mL产气荚膜梭菌+IO4CFU/ mL乙型溶血性链球菌；(3) 102CFU/mL产气荚膜梭菌+104CFU/mL副溶血弧菌；⑷IO2CFU/ mL产气荚膜梭菌+104CFU/mL李斯特氏菌；(5) 102CFU/mL产气荚膜梭菌+104CFU/mL金黄色 葡萄球菌；(6) 102CFU/mL产气荚膜梭菌+104CFU/mL志贺氏菌；(7) 102CFU/mL产气荚膜梭菌 +104CFU/mL大肠杆菌；(8)七种菌(沙门氏菌、乙型溶血性链球菌、副溶血弧菌、李斯特氏 菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和大肠杆菌)的混合菌液(每种菌终浓度均为103CFU/mL)。3)按研制的体系配制反应液，对上述模板进行LAMP反应，判断引物特异性。反应管中加入22 μ L的反应液+0. 5 μ L的DNA聚合酶+30 μ L的稳定液+2. 5 μ L待 检模板；65°C环介导等温反应60min ；往反应管中加入2 μ L显色液，封管后轻轻摇勻观察， 反应管液体呈绿色，为产气荚膜梭菌阳性，呈橙色则为阴性。产气荚膜梭菌分别与乙型溶血性链球菌、副溶血弧菌、李斯特氏菌、金黄色葡萄球 综合以上实验结果，表明本发明方法对产气荚膜梭菌检测具有良好的特异性与抗 干扰性。1. 2灵敏度取目标菌菌液定量到约0. 4麦氏浊度，然后进行10倍梯度稀释，获得ICT1 10, 浓度的菌液；取其中的10_5 10_7浓度的菌液Iml按GB/T4789. 2进行平板计数(厌氧培 养)，另取KT1 10,浓度的菌液用于本发明方法做提取核酸及检测，比较等温扩增结果与 菌落计数结果判断灵敏度。步骤如下(1)取编号为ATCC13124菌液，用生理盐水稀释至约0. 4麦氏浊度；(2)取0. 5ml步骤1的稀释菌液加入4. 5ml无菌生理盐水中，混勻，获得10_1菌 液，如此类推获取KT1 10_1(1浓度的菌液；(3)取其中的10_5 10_7浓度的菌液Iml按GB/T4789. 2进行平板计数(厌氧培 养)；(4)另取10—1 10,浓度的菌液按本发明方法步骤进行提取及检测；(5)比较等温扩增结果与菌落计数结果判断灵敏度。
对10_4 10_6浓度的菌液按GB/T4789. 2做菌落计数结果见下表。
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综合上述结果，在本次实验中判断本发明方法灵敏度可达到1. 4X 104CFU/mL。实施例5实施例1的产气荚膜梭菌检测试剂盒对人工模拟样品的试验1样品制备、增菌培养1)接种和培养取标准待测菌株接入适当的培养基中，培养至600nm波长处吸光度在0. 35-0. 45 之间，取菌液做10倍梯度稀释，分别标记为IiT1 10_1(1。2)菌落计数取25g(mL)食品，按GB/T 4789. 13方法进行勻浆；分别取ImL不同稀释度的菌液 进行食品样品人工污染。3)增菌按GB/T 4789. 13方法作增菌处理。增菌后按GB/T 4789. 2方法进行菌落计数。2细菌模板DNA的制备(具体方法参照实施例4)3采用本发明实施例1的试剂盒进行LAMP方法检测1)反应过程a)在反应管中分别加入相应反应液22. 5 μ L、Bst酶0. 5 μ L，混勻，然后加入30 μ L 稳定液，最后在管中加入2. 5 μ L上述核酸摸板；b)反应管置65°C温育60min ；2)阴性对照、阳性对照设置以样品预处理液代替DNA模板作为阴性对照；以已知浓度的标准菌株DNA模板作为阳性对照。4结果观察在反应管中分别加入2 μ L显色液后观察结果；在阴性对照反应管为橙色，阳性对 照反应管呈绿色的条件下待检样品反应管呈绿色，则为阳性；待检样品反应管呈橙色，则可报告为阴性。若与上述条件不符，则本次检测结果无效，重新检测。5实验结果采用5类食品，每类食品分别以3种浓度水平接种进行人工模拟。每个样品重复 3次试验，确定结果。
在阴性质控和阳性质控正常的情况下，当人工污染样品的菌落计数为2000CFU/mL 时被检出阳性。实施例6实施例2的产气荚膜梭菌检测试剂盒对自然样品的试验抽取市场食品样品180份，其中肉制品50份、水产品50份、调味品30份、乳制品 30及蛋制品20份，分别采用本发明实施例2的试剂盒、实施例5的方法及GB/T 4789. 13传 统方法检测产气荚膜梭菌。
本标准方法与GB/T 4789. 13传统培养方法结果一致性较好。实施例7采用反应管的产气荚膜梭菌检测试剂盒本实施例的产气荚膜梭菌检测试剂盒，采用的试剂和引物与实施例1相同，试剂 盒还包括反应管，反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B 两个空腔的纵向延伸的隔板，其中空腔A内装有22. 0 μ L的LAMP反应液和0. 5 μ L的Bst DNA聚合酶，液体上层由石蜡封存；空腔B内装有2. 0 μ L的LAMP反应显色液，液体上层也 由石蜡封存，将该反应管-20°C保存。本实施例采用反应管作为容器，对产气荚膜梭菌进行LAMP检测，同时设有阳性对 照组和阴性对照组，具体包括如下步骤取上述制备的反应管三支，采用移液枪分别加入阴性对照样品、待检测样品和阳性对照样品各2. 5 μ L，加样时枪头穿透保护液层，样品加至反应管A腔内，盖紧管盖并做好 标记,移至反应区。将上述反应管均于65°C恒温反应Ih。反应结束，将反应管倒置甩动1次，再正置甩动1次，使工作液与显色液充分混合 均勻后观察。若反应管与阳性对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管与阴性对照管一样显现 橙色则为阴性。在LAMP反应过程中，显色液与工作液密封状态好，没有发生互相泄露的情况，后 期显色反应时，倒置甩动操作使得显色液和工作液混合，显色结果清晰。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。
权利要求
一种产气荚膜梭菌检测试剂盒，其特征在于，所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒包括以产气荚膜梭菌的16S rDNA基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。
2.根据权利要求1所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒，其特征在于，所述的两对引物为 外引物F3⑴AACCTTCATCACTCACGCG 外引物B3⑴ GCAATCCGCTATGAGATGGA 内引物FIP(I)TGATCGGCCACATTGGGACTGATTTTGGTTTCCCCCATTGTGCA 内引物BIP(I)CAGGTCGGCTACGCATCGTCTTTTCGGCGCATTAGCTAGTTGG 或外引物F3⑵ AACCTTCATCACTCACGCG 外引物B3⑵ GCAATCCGCTATGAGATGGA 内引物FIP (2)TGATCGGCCACATTGGGACTGAGGTTTCCCCCATTGTGCA 内引物BIP (2)CAGGTCGGCTACGCATCGTCCGGCGCATTAGCTAGTTGG 或外引物F3(3) GGGGTAACGGCCTACCAA 外引物B3(3) CCTCCTTGGGTACCGTCATT 内引物FIP (3)AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTTTTTGATGCGTAGCCGACCTGA 内引物BIP (3)CAATGGGGGAAACCCTGATGCATTTTTCTTCCCCAAAGACAGAGCT 或外引物F3(4) GGGGTAACGGCCTACCAA 外引物B3(4) CCTCCTTGGGTACCGTCATT 内引物FIP (4)AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTGATGCGTAGCCGACCTGA 内引物BIP (4)CAATGGGGGAAACCCTGATGCATCTTCCCCAAAGACAGAGCT。
3.根据权利要求1所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒，其特征在于，所述的产气荚膜梭 菌检测试剂盒还包括BstDNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、甜菜碱、硫酸镁、显色液、稳定液和阳 性对照。
4.根据权利要求3所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒，其特征在于， 所述的Bst DNA聚合酶酶浓度7-10U/ μ L ；所述的缓冲液含0. 18-0. 25mol/L Tris_HCl，0. 10-0. 15mol/L KC1，0. 07-0. 15mol/ L(NH4)2SO4,15-30mmol/L MgSO4,1-2 体积％ TritonX-100 ； 所述的dNTPs 每种核苷酸浓度10-20mmol/L ； 所述的甜菜碱浓度3-6mol/L ； 所述的硫酸镁浓度100-200mmol/L ； 所述的显色液为SYBR Green I或Eva Green ； 所述稳定液为石蜡油；所述的阳性对照为产气荚膜梭菌基因组DNA。
5.根据权利要求4所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒，其特征在于， 所述的Bst DNA聚合酶酶浓度8U/ μ L ；所述的缓冲液含0. 2mol/L Tris-HCl,0. lmol/L KC1，0. lmol/L (NH4) 2S04, 20mmol/L MgSO4,1 体积％ TritonX-100 ；所述的dNTPs 每种核苷酸浓度lOmmol/L ； 所述的甜菜碱浓度5mol/L ； 所述的硫酸镁浓度150mmol/L。
6.根据权利要求3、4或5所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒，其特征在于，所述的产气荚 膜梭菌检测试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下 部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。
7.根据权利要求6所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒，其特征在于，所述的A、B两个空 腔中分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为缓 冲液、dNTPs、甜菜碱、硫酸镁、水和Bst DNA聚合酶的混合而成。
8.一种使用如权利要求3所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒的方法，其特征在于，该方 法包括如下步骤(1)将待测样品增菌，得到样品增菌液；(2)将样品增菌液提取样品模板DNA；(3)在反应容器中加入BstDNA聚合酶1. 8 2. 4体积份数、缓冲液10体积份数、dNTPs 15 20体积分数、甜菜碱15 20体积分数、硫酸镁15 20体积分数、稳定液25 35体 积份数、样品模板DNA 10体积份数、内引物FIP/BIP各2体积份数、外引物F3/B3各4体积 分数，恒温反应；(4)在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混勻，样品组显色与对照组相同则 为阳性，否则为阴性；所述步骤(3)中的内引物FIP/BIP和外引物F3/B3为以产气荚膜梭菌的16SrDNA基因 为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物。
9.根据权利要求8所述的使用产气荚膜梭菌检测试剂盒的方法，其特征在于，所述的3两对引物为外引物F3⑴ AACCTTCATCACTCACGCG 外引物B3⑴ GCAATCCGCTATGAGATGGA 内引物FIP(I)TGATCGGCCACATTGGGACTGATTTTGGTTTCCCCCATTGTGCA 内引物BIP(I)CAGGTCGGCTACGCATCGTCTTTTCGGCGCATTAGCTAGTTGG 或外引物F3⑵ AACCTTCATCACTCACGCG 外引物B3⑵ GCAATCCGCTATGAGATGGA 内引物FIP (2)TGATCGGCCACATTGGGACTGAGGTTTCCCCCATTGTGCA 内引物BIP (2)CAGGTCGGCTACGCATCGTCCGGCGCATTAGCTAGTTGG 或外引物F3(3) GGGGTAACGGCCTACCAA 外引物B3(3) CCTCCTTGGGTACCGTCATT 内引物FIP (3)AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTTTTTGATGCGTAGCCGACCTGA 内引物BIP (3)CAATGGGGGAAACCCTGATGCATTTTTCTTCCCCAAAGACAGAGCT 或外引物F3(4) GGGGTAACGGCCTACCAA 外引物B3(4) CCTCCTTGGGTACCGTCATT 内引物FIP (4)AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTGATGCGTAGCCGACCTGA 内引物BIP (4)CAATGGGGGAAACCCTGATGCATCTTCCCCAAAGACAGAGCT。
10.根据权利要求8或9所述的使用产气荚膜梭菌检测试剂盒的方法，其特征在于， 步骤(3)中，恒温反应的反应条件为温度63 65°C，反应时间45 90min。
全文摘要
本发明提供一种产气荚膜梭菌检测试剂盒，所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒包括以产气荚膜梭菌的16S rDNA基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本发明的产气荚膜梭菌检测试剂盒检测效果更全面、漏检率低。
文档编号C12Q1/04GK101892299SQ201010114229
公开日2010年11月24日 申请日期2010年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者冯家望, 尹斌, 曹以诚, 李丹琳, 杜正平, 柯佳佳, 田文武, 陈洵 申请人:广州华峰生物科技有限公司