专利名称：：生物催化法生产他汀类药物中间体的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及一种生物催化法生产他汀类药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物的方法，以及生产过程中所用到的菌株。
背景技术：
：他汀类药物是目前治疗高血压、高血脂等心血管疾病最有效的药物。瑞舒伐他汀，又称超级他汀，作为一种新型的疗效更好的他汀类药物，已日益受到人们的关注。但由于其手性侧链的合成工艺还不完善，使其制备成本相比其他他汀类药物要高出许多，所以销售价格一直居高不下，制约了其市场的开拓和发展，同时也妨碍了心血管疾病的有效控制和治疗。因为在他汀类药物的合成和制备工艺中，高光学纯度(>99%)的手性侧链的合成是关键步骤，同时也是难点，而其母体合成则相对比较简单。(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物作为合成瑞舒伐他汀侧链的关键中间体，其合成的收率和光学纯度的高低已成为整个瑞舒伐他汀合成工艺的瓶颈。如能以较少的步骤和较低的成本合成高光学纯度的(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物，瑞舒伐他汀的合成将会更加完善，而且成本会大大降低。但是目前为止，手性纯的(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物的合成还没有实现。利用传统的化学合成的方法，由于(R)-3_羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物的碳链长度比较短，而且含有羟基、羧基和酯基等活泼基团，而化学反应的条件又比较苛亥IJ，经常需要高温高压，很容易破坏产物分子的结构，所以化学方法不适合该产物的合成，也未见相关报道。在已报道的生物法制备中，主要是利用商品酶进行催化转化。例如，Jacobsen等利用商品化的脂肪酶、酯酶和α-糜乳蛋白酶等催化水解3-羟基戊二酸二乙酯来制备(R)-3-羟基戊二酸乙酯(JMolCatalB-Enzym,21:55_58；Tetrahedronlett.255235-5238)，但产率(80%)和产物的ee值(91%)都不是很高，更为重要的是商品酶的购置成本很高，因此也不适合应用于(R)_3-羟基戊二酸乙酯的产业化生产。腈化合物在自然界中大量的以无机腈和有机腈的形式存在。同时，其作为一种大宗商品也可以通过化学合成的方法生产得到。而从这些廉价的腈化合物出发可以制备高附加值、具有生物活性的有机酸类物质。例如消旋的4-氰基-3-羟基丁酸乙酯或其羟基取代衍生物的化学法制备工艺相当成熟，而且成本低廉。而通过水解其分子结构中的氰基，可以由4-氰基-3-羟基丁酸乙酯或其羟基取代衍生物制备得到(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物。但是同样的该物质分子中含有活泼的羟基、羰基和羧基，利用化学水解方法很容易产生不同结构的副产物，造成分离的困难。而通过微生物腈水解酶细胞选择性催化水解4-氰基-3-羟基丁酸乙酯或其羟基取代衍生物可以一步制备得到高光学纯度的(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物(反应式见下)，该水解反应体系简单，条件温和，而且腈水解酶的立体选择性也非常高。然而，由于底物4-氰基-3-羟基丁酸乙酯或其羟基取代衍生物都含有一个酯基，而一般含水解酶微生物细胞中都会含有水解酯基的酯酶或脂肪酶，所以该生物催化剂的筛选也是一大难题，迄今为止，也未见该腈水解酶菌株的相关报道。这些因素使得光学纯的(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物的合成难以实现。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>
发明内容本发明的目的是提供一种通过手性拆分外消旋的4-氰基-3-羟基丁酸乙酯或其羟基取代衍生物制备合成具有高光学活性的(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物的方法，并提供了一株从大自然的土壤及污水中筛选得到含有立体选择性腈水解酶酶活且不含有水解4-氰基-3-羟基丁酸乙酯或其羟基取代衍生物中酯基的酯酶的红平红球菌新菌株。本发明采用的技术方案是一种生物催化法生产(R)-3_羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物的方法，所述方法包括一种生物催化法生产(R)_3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物的方法，所述(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物结构如式(I)所示，所述方法包括在以式(II)所示化合物为底物，以红平红球菌CCTCCNo=M209244或CCTCCNo=M209194发酵培养获得的酶为催化剂的反应体系中，于1050°C下进行转化反应，反应结束后反应液经分离纯化得到相应的式(I)所示(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(II)式(I)、(II)中式(I)、(II)中R1为-H、-C(0)CH3、-C(0)CH2OCH3、-CH2OCH3(CH3)2(甲基异丙基醚)、TMDS(四甲基二硅醚)或TBDMS(叔丁基二甲基硅醚)。所述酶来自红平红球菌CCTCCNo=M209244或CCTCCNo:M209194经发酵培养获得的含酶菌体细胞。所述酶可直接以发酵液形式参与反应，也可将发酵液过滤获得的含酶菌体细胞加入反应体系中进行反应，所述菌体细胞也可经固定化后用于反应。通常，所述转化反应在pH7.O8.O的缓冲液中进行。优选的，所述反应体系中底物初始浓度为120mmol/L，含酶菌体细胞初始浓度为1IOgDCW/L(干菌体浓度)。所述含酶菌体细胞由如下方法制备得到将红平红球菌CCTCCNo=M209244或CCTCCNo=M209194接种至发酵培养基，30°C下振荡培养13天，获得含有含酶菌体细胞的发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为葡萄糖O20g，蛋白胨O10g，己内酰胺O5g,K2HPO4O2.Og,MgSO4·7H20O0.5g,NaClO2g,FeSO4·7H20O0.2g，溶剂为水，pH38。所述分离纯化方法如下反应液离心，取上清液用1lOmol/L的HCl溶液调pH为24，再用乙酸乙酯或正己烷萃取15次，合并乙酸乙酯或正己烷有机相，减压蒸馏蒸去乙酸乙酯或正己烷，即得到所述(R)_3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物。具体的，所述方法如下(1)将红平红球菌CCTCCNo=M209244或CCTCCNo=M209194接种至发酵培养基，30°C下振荡培养13天，获得含有含酶菌体细胞的发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为葡萄糖020g，蛋白胨0IOg,己内酰胺05g，K2HPO402.0g,MgSO4·7H2000.5g,NaCl02g,FeSO4·7H2000.2g，溶剂为水，pH38；(2)步骤(1)发酵液离心，取沉淀以生理盐水洗涤13次，得到的菌体细胞用1050mmol/L、pH69的Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液配制成1IOgDCW/L的菌悬液；(3)取步骤(2)菌悬液，加入底物(II)(4-氰基-3-羟基丁酸乙酯或其衍生物)至浓度为120mmol/L，于30°C下进行转化反应，反应结束后，反应液离心，取上清液用110mol/L的HCl溶液调pH为24，再用乙酸乙酯或正己烷萃取15次，合并乙酸乙酯或正己烷有机相，减压蒸馏蒸去乙酸乙酯或正己烷，即得到所述(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物。本发明筛选获得的新菌株为红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)ZJB-0910，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo:M209244，保藏日期2009年10月26日。本发明涉及的另一株菌株为红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)ZJB-09149，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo=M209194，保藏日期2009年9月4日，已在在先申请CN200910154891.5中作为新菌株予以保护。本发明利用一种腈水解酶的快速筛选方法，即钴离子显色法筛选得到的两株目标腈水解酶菌种，艮口RhodococcuserythropolisZJB-0910禾口RhodococcuserythropolisZJB-09149。其中ZJB-0910酶活较高。通过形态学、生理生化和16SrDNA鉴定，两菌株均属于红球菌属(Rhodococcus)的红平(erythropolis)种。本发明菌株筛选方法如下用灭菌水将试样配成悬浮液，取0.510.Oml悬浮液到装有1100ml的富集培养基的三角瓶中，在2040°C，100300rpm的摇床上培养。每升富集培养基的成分为葡萄糖020g,K2HPO402.0g,MgSO4·7H2000.5g，NaCl02g，FeSO4·7H2000.2g，pH38，接种前加入经过滤除菌的4-氰基-3-羟基丁酸乙酯至0.052%。富集培养数天后，取产生浑浊的培养液再按上法依次循环培养05次，涂布至固体平板培养基。固体培养基成分除含13%的琼脂外，其余与富集培养基成分相同。从平板上挑取单菌落，转接至1100ml发酵培养基，在2040°C，100300rpm的摇床上培养数天。每升发酵培养基的成分为葡萄糖020g，蛋白胨010g，己内酰胺05g,K2HPO402.0g,MgSO4·7H2000.5g,NaCl02g,FeSO4·7H2000.2g,溶剂为水，PH38。培养结束后，用0IOOOOrpm离心机离心020min，离心得到的样品用00.8%的生理盐水润洗13次，得到被测样品。取该被测样品溶于pH为69的Tris-HCl缓冲液中，最终样品浓度为1IOgDCW/L(干菌体浓度)；添加底物4-氰基-3-羟基丁酸乙酯开始反应，使其终浓度为20150mmol/L。该反应体系于2050°C下反应，反应30240min后，加入等体积的含Co2+离子浓度为10100mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液(PH69)进行显色反应，反应时间为120min。若反应体系由品红色变为黄色，则表明该被测样品含有能催化水解4-氰基-3-羟基丁酸乙酯氰基的腈水解酶；如颜色不变，则被测样品中不含有该腈水解酶。阳性菌株再用高效液相色谱(HPLC)进行复筛，经复筛确定该腈水解酶整体细胞没有水解产物中的酯键。具体操作方法和条件为取反应液lml,IOOOOrpm离心弃菌体细胞终止反应，并得到上清液。取1020μ1该上清液进样作HPLC分析。分析条件为流动相05%(ν/ν)的三乙胺溶液乙腈(41)，检测波长为220275nm，流速为12ml/min。在该条件下，产物(R)_3_羟基戊二酸乙酯的保留时间为4.05min(详见图1)。通过HPLC的复筛及验证后，确定以上两株具有目标腈水解酶活力的阳性株RhodococcuserythropolisZJB-0910和ZJB-09149。取经以上两种经发酵培养基培养的菌体若干，用50mmolL—1、pH7.5的磷酸盐缓冲液配成1IOgDCW/L的菌悬液。配制浓度为20mmolL—1的4-氰基-3-羟基丁酸乙酯水溶液100ml，取520ml该底物溶液加入到520ml菌体溶液中，在1050°C、100200rpm条件下反应60300min。反应完毕后，IOOOOrpm离心得到上清液。HPLC分析得到产物的转化率。然后用1ION的HCl溶液将上清液调成酸性，再用乙酸乙酯萃取15次，合并有机相。然后用旋转蒸发仪在060°C条件下蒸去乙酸乙酯得到黄色液体。产物的比旋光度([a]D22)经测定为_1.9(c11.5，丙酮)，和文献值对比确定其立体构型为R型(JAmChemSoc，83:4228_4233，1961)。该产物分子结构由紫外光谱、核磁共振1H和13C谱、ESI-MS和红外光谱鉴定。从以上结果确定该产物为(R)-3-羟基戊二酸乙酯。该产物的ee值(^99%)利用正相色谱对经衍生化后的差向异构体分离后进行测定(Chromatographia，71:85-89，2010)。该菌体细胞同样适合于4-氰基-3-羟基丁酸乙酯β位羟基取代衍生物的立体选择性水解，产物的产率用气相色谱法分析。具体的，筛选方法如下(1)将用无菌水配制0.52%的土样悬浮液和污水悬浮液，分别接种15ml到50ml富集培养基中，在30°C，150rpm的摇床上培养13天。富集培养基的成分为葡萄糖020g/L,K2HPO402.0g/L,MgSO4·7H2000.5g/L,NaCl02g/L,FeSO4·7H2000.2g/L，pH38。分装后，在0.IMPa下灭菌1030min，接种前加入经除菌过滤的4-氰基-3-羟基丁酸乙酯至0.052%(ν/ν)0培养结束后，取产生浑浊的培养液再分别接种15ml到50ml富集培养基中，在30°C，150rpm的摇床上培养13天，如此循环35次。取长势相对较好的培养液涂布分离平板，30°C培养箱静止培养13天。平板培养基成分除加入13%的琼脂外，其余与富集培养基成分相同。(2)在平板培养基上挑取单菌落至50ml发酵培养基，在30°C，150rpm的摇床上培养13天。每L发酵培养基的成分为葡萄糖020g，蛋白胨010g，己内酰胺05g,K2HPO402.0g,MgSO4·7H2000.5g,NaClO2g，FeSO4·7H2000.2g，溶剂为水，pH38。培养结束后，用0IOOOOrpm离心机离心020min，离心得到的样品用00.8%的生理盐水润洗13次，得到的菌体用1050mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH69)配制成1IOgDCW/L(干菌体浓度)的菌悬液。(3)Co2+离子显色法的具体操作步骤如下取步骤(2)中配制而成的1IOgDCff/L(干菌体浓度)的菌悬液10100μ1于96孔板中，添加底物4-氰基-3-羟基丁酸乙酯开始反应，使其终浓度为20150mmol/L。该反应体系于2050°C下反应，反应30240min后，加入等体积的含Co2+离子浓度为10lOOmmol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH69)进行显色反应，反应时间为120min。在反应过程中，若反应体系由品红色变为黄色，则表明该被测样品含有能催化水解4-氰基-3-羟基丁酸乙酯氰基的腈水解酶；如颜色不变，则被测样品中不含有该腈水解酶。含阳性菌的反应液可用紫外分光光度计在370nm下连续测量其吸光度，并减去空白对照值，其阳性菌的吸光度值介于0.20.8之间，用未加菌体的反应液作为空白对照。(4)HPLC复筛及验证经Co2+离子显色法筛选得到的菌株按步骤(2)制成菌悬液。加入此菌悬液520ml于50ml的三角瓶中，添加底物4-氰基-3-羟基丁酸乙酯开始反应，使其终浓度为20150mmol/L。该反应体系于2050°C下反应，反应60240min后，取Iml该反应液在IOOOOrpm下离心弃菌体细胞终止反应，并得到上清液。取1020μ1该上清液进样作HPLC分析。高效液相色谱仪的型号为LC-IOA7(VP)(Shimadzu,Japan),色谱柱型号为HypersilODSC18(250mmX4.6mm，5μm)，紫外检测器型号为Spd-10AVpplus(Shimadzu，Japan)。分析条件为流动相:05%(ν/ν)的三乙胺溶液乙腈(41)，检测波长为220275nm，流速为12ml/min。在该条件下，产物(R)_3_羟基戊二酸乙酯的保留时间为4.05min(详见图1)。如果有产物吸收峰出现，那么就说明该菌株确实为阳性菌。(5)取筛选得到的两株菌株做生理生化和分子鉴定。最后经鉴定均为Rhodococcuserythropolis。(6)取经以上两种经发酵培养基培养的菌体若干，用50mmolΙ^、ρΗ7.5的磷酸盐缓冲液配成1IOgDCW/L的菌悬液。配制浓度为20mmol厂1的4-氰基-3-羟基丁酸乙酯水溶液100ml，取520ml该底物溶液加入到520ml菌体溶液中，在1050°C、100200rpm条件下反应60300min。反应完毕后，IOOOOrpm离心得到上清液。HPLC分析得到产物的转化率。然后用110N的HCl溶液将上清液调成酸性，再用乙酸乙酯萃取15次，合并有机相。然后用旋转蒸发仪在060°C条件下蒸去乙酸乙酯得到黄色液体。产物的比旋光度([a]D22)经测定为_1.9(c11.5，丙酮)，和文献值对比确定其构型为R型(JAmChemSoc，83:4228_4233，1961)。该产物的分子结构由紫外光谱、核磁共振1H和13C谱、ESI-MS和红外光谱鉴定。从以上结果确定该产物为(R)-3-羟基戊二酸乙酯。产物的ee值经测定为99%以上(Chromatographia，71:85_89，2010)。(7)配制各种不同的4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的羟基取代衍生物溶于无水乙醇(浓度为0lOOmmolL—1)，然后取0.5ml加入到9.5ml含有菌体的磷酸盐缓冲液(pH7.5，菌体浓度为1IOgDCW/L)开始反应。在1050°C、100200rpm条件下反应612h。反应结束后，IOOOOrpm离心得到上清液。GC分析得到产物的转化率。(8)步骤(7)中反应的各种产物的气相色谱(GC)分析方法如下气相色谱仪的型号为HP6890N,色谱柱型号为AT.FFAP毛细管柱，进样口温度为320°C，检测器温度为320°C，柱温升温程序为80°C开始，以10°C/min的速率升至220°C，然后保持IOmin。载气流速为lml/min。产物的ee值的测定方法与步骤(6)相同。本发明筛选得到的红平红球菌RhodococcuserythropolisZJB-0910和ZJB-09149为新发现的能手性拆分外消旋的4-氰基-3-羟基丁酸乙酯来制备(R)_3_羟基戊二酸乙酯的腈水解酶菌株，国内外未见报道。同时，也首次报道了利用红平红球菌的腈水解酶细胞立体选择性催化水解消旋的脂肪类β“羟基腈化合物或其衍生物为手性有机酸类物质。该腈水解酶的发现实现了从消旋的4-氰基-3-羟基丁酸乙酯或其羟基取代衍生物一步催化水解得到高光学纯度的(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物，不水解底物中的酯基，不产生任何副产物，克服了传统的合成方法如化学法在水解过程中所带来的副产物多、目标产物收率低和光学纯度不高等缺点。由于产物(R)_3-羟基戊二酸乙酯无法购买得到，因此本专利首次制备得到了高光学纯度的(R)_3-羟基戊二酸乙酯(ee彡99%)，并对该产物进行了结构鉴定。图1为(R)-3-羟基戊二酸乙酯的高效液相色谱图。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1运用Co2+离子显色法筛选能选择性催化水解4-氰基-3-羟基丁酸乙酯为(R)-3-羟基戊二酸乙酯的腈水解酶菌株(1)将用无菌水配制1%的土样悬浮液和污水悬浮液，分别接种5ml到45ml富集培养基中，在30°C，150rpm的摇床上培养2天。每升富集培养基的成分为葡萄糖5g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H200.5g，NaCl0.lg，FeSO4·7H200.02g，溶剂为水，pH6.5。分装后，在0.IMPa下灭菌20min，接种前加入经除菌过滤的4-氰基-3-羟基丁酸乙酯至(ν/ν)。培养结束后，取产生浑浊的培养液再分别接种Iml到49ml富集培养基中，在30°C，150rpm的摇床上培养2天，如此循环富集4次。取长势相对较好的培养液涂布分离平板，30°C培养箱静止培养2天。平板培养基成分除加入2%的琼脂外，其余与富集培养基成分相同。(2)在平板培养基上挑取单菌落至50ml发酵培养基，在30°C，150rpm的摇床上培养2天。每升发酵培养基的成分为葡萄糖10g，蛋白胨5g，己内酰胺2g，K2HPO40.5g,MgSO4·7Η200.2g，NaCllg，FeSO4·7Η200·02g，溶剂为水，pH6.8。在0.IMPa下灭菌20min。培养结束后，用IOOOOrpm离心机离心lOmin，离心得到的样品用0.8%的生理盐水润洗2次，得到的菌体用40mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)配制成10gDCW/L(干菌体浓度)的菌悬液。(3)Co2+离子显色法的具体操作步骤如下取步骤(2)中配制而成的IOgDCW/L(干菌体浓度)的菌悬液100μ1于96孔板中，添加底物4-氰基-3-羟基丁酸乙酯开始反应，使其终浓度为40mmol/L。该反应体系于35°C下反应，反应240min后，加入等体积的含Co2+离子浓度为lOmmol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH7.0)进行显色反应，反应时间为5min。在反应过程中，若反应体系由品红色变为黄色，则表明该被测样品含有能催化水解4-氰基-3-羟基丁酸乙酯氰基的腈水解酶；如颜色不变，则被测样品中不含有该腈水解酶。含阳性菌的反应液可用紫外分光光度计在370nm下连续测量其吸光度，并减去空白对照值，取吸光度最大样品作HPLC复筛和验证，用未加菌体的反应液作为空白对照。紫外分光光度计的型号为BeckmanDU800。(4)HPLC复筛及验证经Co2+离子显色法筛选得到的菌株按步骤(2)制成菌悬液。加入此菌悬液9ml于50ml的三角瓶中，添加底物4-氰基-3-羟基丁酸乙酯开始反应，使其终浓度为100mmol/L。该反应体系于35°C下反应，反应240min后，取Iml该反应液在IOOOOrpm下离心弃菌体细胞终止反应，并得到上清液。取10μ1该上清液进样作HPLC分析。高效液相色谱仪的型号为LC-IOA7(VP)(Shimadzu,Japan)，色谱柱型号为HypersilODSC18(250mmX4.6mm，5ym)，紫外检测器型号为Spd-10AVpplus(Shimadzu,Japan)。分析条件为流动相05%(ν/ν)的三乙胺溶液乙腈(41)，检测波长为260nm，流速为lml/min。在该条件下，产物(R)_3_羟基戊二酸乙酯的保留时间为4.05(详见图1)。如果有产物吸收峰出现，那么就说明该菌株确实为阳性菌。(5)取筛选得到的两株菌株做生理生化和分子鉴定。最后经鉴定均为Rhodococcuserythropolis。实施例2生物催化剂R.erythropolisCCTCCNO:M209244细胞制备从本发明选育得到的新腈水解酶产生菌种R.erythropolisCCTCCN0=M209244的试管斜面上挑取一环菌体，接种至50ml无菌种子培养基中，在30°C，150rpm的摇床上培养24h，得种子液。每升种子培养基的成分为葡萄糖8g，蛋白胨5g，K2HPO40.5g,MgSO4·7H200.2g，溶剂为水，pH自然，在0.IMPa下灭菌20min。种子液以3%(ν/ν)接种量转接至装有100.Oml无菌发酵培养基中，在30°C，150rpm的摇床上培养48h。每升发酵培养基的成分为葡萄糖20g，蛋白胨10g，己内酰胺IgjK2HPO40.5g，MgSO4·7Η200.2g，溶剂为水，pH7.0。在0.IMPa下灭菌20min。培养结束后，按实施例1制得菌悬液，干细胞浓度为(3.0g/L)，其中缓冲溶液由pH7.0的Tris-HCl换成pH7.5的磷酸盐缓冲液(50mmol/L)。实施例3生物催化剂R.erythropolisCCTCCNO=M209149细胞制备该整体细胞催化剂的制备方式同实施例2。实施例4利用CCTCCNO:M209244细胞选择性催化水解外消旋4_氰基_3_羟基丁酸乙酯为(R)-3-羟基戊二酸乙酯配制浓度为20mmolL—1的4_氰基-3-羟基丁酸乙酯水溶液100ml，取IOml该底物溶液加入到IOml按实施例2法制备得到的菌体溶液中，在30°C，ISOrpm条件下反应240min。反应结束经检测，(R)_3_羟基戊二酸乙酯(ee^99%)的转化率为46.5%，说明基本上(R)_4-氰基-3-羟基丁酸乙酯已经转化为产物，而剩下的就是(S)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。实施例5利用CCTCCNO:M209149细胞选择性催化水解外消旋4-氰基-3-羟基丁酸乙酯为(R)-3-羟基戊二酸乙酯配制浓度为20mmolL—1的4_氰基_3_羟基丁酸乙酯水溶液100ml，取IOml该底物溶液加入到IOml按实施例3法制备得到的菌体溶液中，在30°C，ISOrpm条件下反应240min。反应结束经检测，(R)_3_羟基戊二酸乙酯(ee彡99%)的转化率为35.6%。说明利用该菌体细胞也能实现消旋的4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的拆分，但转化率不如CCTCCNo:M209244o实施例6产物(R)-3-羟基戊二酸乙酯的结构表征取乙酸乙酯萃取后的产物，分别做紫外光谱、核磁共振1H和13C谱、ESI-MS和红外光谱鉴定。产物的立体构型采用测定比旋光度的方法来确定。紫外最大吸收波长为220nm(水溶液中)，峰形规则光滑，没有其他杂峰。1HNMR:1.30(3H,t)，2.58(2H，d)，2.62(2H，d)，4.20(2H，q)，4·50(lH，m)，13CNMR13.8,40.3,40.5,60.8,64.5，171.8，175.7。ESI-MS(正离子模式):[M+H]+，177.5;[M+Na]+，199.1；[M+K]+，214.0，产物的实际分子量为176.19。红外光谱(IR)的结果为=3443.6(σ0Η),2985,2938(σC_H),1726(σc=0),1412(δ。H)，1213，1085(oc_。)。从测得的产物的比旋光度[[α]D22-1.9(c11.5，丙酮)]可以确定该产物构型为R型(JAmChemSoc，83:4228_4233，1961)。从以上鉴定结果看，该产物的结构与(R)_3-羟基戊二酸乙酯相同，证明确实为(R)-3-羟基戊二酸乙酯。实施例711利用M209244菌体细胞立体选择性催化水解4_氰基_3_羟基丁酸乙酯的各种羟基取代衍生物为相应的产物酸配制各种不同的4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的羟基取代衍生物溶于无水乙醇(浓度为IOOmmol厂1)，然后取0.5ml加入到9.5ml含有菌体的磷酸盐缓冲液(pH7.5，菌体浓度为5gDCW/L)开始反应。在30°C、180rpm条件下反应612h。反应结束后，IOOOOrpm离心得到上清液。GC分析得到产物的转化率。结果如下表所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求一种生物催化法生产他汀类药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物的方法，所述(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物结构如式(I)所示，所述方法包括在以式(II)所示化合物为底物，以红平红球菌CCTCCNoM209244或CCTCCNoM209194发酵培养获得的酶为催化剂的反应体系中，于10～50℃下进行转化反应，反应结束后反应液经分离纯化得到相应的式(I)所示(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物；式(I)、(II)中R1为-H、-C(O)CH3、-C(O)CH2OCH3、-CH2OCH3(CH3)2、TMDS或TBDMS。FSA00000012111900011.tif2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述酶来自红平红球菌CCTCCNo=M209244或CCTCCNo=M209194经发酵培养获得的含酶菌体细胞。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述转化反应在pH7.O8.O的缓冲液中进行。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述反应体系中底物初始浓度为120mmol/L，含酶菌体细胞初始浓度为1IOgDCW/L。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述含酶菌体细胞由如下方法制备得到将红平红球菌CCTCCNo=M209244或CCTCCNo:M209194接种至发酵培养基，30°C下振荡培养13天，获得含有含酶菌体细胞的发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为葡萄糖O20g，蛋白胨O10g，己内酰胺O5g，K2HP04O2.Og，MgSO4·7H20O0.5g，NaClO2g,FeSO4·7H20O0.2g，溶剂为水，pH38。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述分离纯化方法如下反应液离心，取上清液用1lOmol/L的HCl溶液调pH为24，再用乙酸乙酯或正己烷萃取15次，合并有机相，减压蒸馏蒸去乙酸乙酯或正己烷得到所述(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)将红平红球菌CCTCCNo=M209244或CCTCCNo=M209194接种至发酵培养基，30°C下振荡培养13天，获得含有含酶菌体细胞的发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为葡萄糖020g，蛋白胨0IOg,己内酰胺05g，K2HPO402.0g,MgSO4·7H2000.5g，NaCl02g,FeSO4·7H2000.2g，溶剂为水，pH38；(2)步骤(1)发酵液离心，取沉淀以生理盐水洗涤13次，得到的菌体细胞用1050mmol/L、pH69的Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液配制成1IOgDCW/L的菌悬液；(3)取步骤(2)菌悬液，加入底物化合物(II)至浓度为120mmol/L，于30°C下进行转化反应，反应结束后，反应液离心，取上清液用1lOmol/L的HCl溶液调pH为24，再用乙酸乙酯或正己烷萃取15次，合并有机相，减压蒸馏蒸去乙酸乙酯或正己烷，得到所述(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物。8.红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)ZJB-0910，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo=M209244，保藏日期2009年10月26日。全文摘要本发明提供了一种通过手性拆分外消旋的4-氰基-3-羟基丁酸乙酯或其羟基取代衍生物制备合成具有高光学活性的他汀类药物中间体(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物的方法及菌株，所述方法包括在以式(II)所示化合物为底物，以红平红球菌CCTCCNoM209244或CCTCCNoM209194发酵培养获得的酶为催化剂的反应体系中，于10～50℃下进行转化反应，反应结束后反应液经分离纯化得到式(I)所示化合物。本发明实现了从消旋的4-氰基-3-羟基丁酸乙酯或其羟基取代衍生物一步催化水解得到高光学纯度的(R)-3-羟基戊二酸乙酯或其羟基取代衍生物，不水解底物中的酯基，不产生任何副产物，克服了传统的合成方法如化学法在水解过程中所带来的副产物多、目标产物收率低和光学纯度不高等缺点。文档编号C12N1/20GK101805756SQ20101010748公开日2010年8月18日申请日期2010年1月30日优先权日2010年1月30日发明者沈寅初,董华平,郑裕国申请人:浙江工业大学