专利名称：提取木本红树植物的总rna的方法及其专用提取液的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种提取木本红树植物的总RNA的方法及其专用提取液。
背景技术：
红树林(Mangrove)是热带海岸潮间的木本植物群落，是一种热带、南亚热带特有 的海岸带植物群落，因主要由红树科的植物组成而得名。红树是湿地的特色植物，全球共有 61个品种包括红树科的秋茄(Kadelia candel)和红海榄(Rhizophora stylosa)，使君子 ^4^1 ^ (Lumnitzera racemosa)等。具有海陆边缘生态系统的特有特点，是珍贵的物种资源。随着现代江河流域工 农业的迅猛发展，沿海城市人口与经济的快速增长，人为干扰使河口海湾区的环境污染日 趋严重。红树林作为一种海岸潮间带森林生态系统.对海湾河口区域的污染具有较高承 载力和耐受性(李裕红，章幼玉.重金属污染对红树植物影响的研究综述与展望.海峡 科学.2007,6 140 142.)。目前，国内外关于红树植物对重金属、有机污染物等的抗性 研究主要集中于红树植物对污染物的富集以及生长、形态和生理学方面(郑文教，王文 卿，林鹏.九龙江口桐花树红树林对重金属的吸收与累积.应用与环境生物字报.1996， 20:20 213.；郑逢中，林鹏，郑文教.红树植物秋茄幼苗对镉耐性的研究L丌.生态学 报.199414 (4) :408 414.；覃光球，严重玲，韦莉莉.秋茄幼苗叶片单宁、可溶性糖和脯 氨酸含量Cd胁迫的响应.生态学报.2006，沈(10) :3366 3371.；吴桂容，严重玲.镉对 桐花树幼苗生长及渗透调节的影响.生态环境.2006，15 (5) :1003 1008. ；Ravikumar S, WilliamsG P, Shanthy S, et al. Efect of heavy metals(Hg and Zn)on the growth andphosphate solubilising activity in halophilic phosphobaeteria isolated fromManakudi mangrove. Journal of environmental Biology,2007,28(1) :109 114·)。随着现代分子生物学的发展及其向各个学科的渗透，人们越来越认识到红树林这 一独特珍贵资源的重要性，越来越多的分子水平技术被应用于红树植物的研究。如采用等 位酶、限制性内切酶片断长度多态性等手段研究红树植物种群的遗传变异和生态分化问 题(潘文，周涵韬，陈攀，等.木榄属3种红树植物的遗传变异和亲缘关系分析.海洋科 学.2005, (5) :23 观.；黎中宝，林鹏.我国不同纬度白骨壤种群遗传多样性和遗传分 化的研究.海洋学报.2002，M(1) :142 147.)。但到目前为止，关于红树植物抗污染胁 迫的分子机理方面的研究还极少有报道。在分子水平探讨红树植物对重金属具较高耐受性 的分子生态机理，鉴定红树植物中高效的重金属结合物质及其调控基因，可以为可持续利 用红树林资源提供了更多的依据，对保护沿海及海洋生态系统具有重要的意义。获得高质量的RNA是进行分子生物学研究的必要前提。红树植物富含单宁和多 糖，普通的RNA提取方法(如盐酸胍法和TRIZOL法等)无法去除干扰，得不到高纯度的RNA。单宁也称植物多酚或鞣质。红树植物的单宁含量比较高，大多数红树植物的单宁 含量通常在10% 30% (林鹏、傅勤.中国红树林环境生态及经济利用.北京高等教育 出版社，1994:61 71.；林益明，向平，林鹏.红树林单宁的研究进展.海洋科学，2005，
329(3) :59 63.)。红树植物的单宁种类也比较多，Hsu等(王宗训.中国资源植物利用手 册[M].北京中国科学技术出版社，1989.)对秋茄中的缩合单宁进行了结构的研究，结果 不仅发现有原天竺葵定(propelargonidin) 二聚物、原花青定(procyanidin)三聚物这些 与其他物种共有的原花色素(缩合单宁)，还发现了 2种新的原花色素二聚物(秋茄素A-1、 A-2)和4个三聚物(秋茄素Β-1、Β-2、Β-3、Β-4)。单宁对红树植物的重要性表现在其所处 的特殊的物理环境、化学环境和生物环境等各方面都有生态适应意义，如依赖单宁的聚盐 性是红树植物适应高盐度环境的最重要的机制(Hsu F L，Ncmaka G I,Nishioka I. Tannins andrelated compounds. XXXI. Isolation and characterization ofproanthocyanidins in Kandelia candel(L)[J], Druce Chem Pharm Bull,1985,33(3) :142 3152. ；Lin P,Fu Q. Environmental Ecology and EconomicUtilization of Mangroves in China[R]. China Higher Education Press Beijingand Springer-Verlag Berlin Heidelberg,2000.)。但 是，种类繁多、含量较高的单宁化合物却是红树植物RNA的提取困难的重要原因之一。单 宁化合物极易氧化，被氧化的单宁化台物(如醌类)能与RNA稳定地结合，导致RNA活性 丧失，在用苯酚、氯仿抽提时会导致RNA的丢失，或形成不溶性复合物(khneiderbauer A, Sandermann H, Ernst D. Isolation of functional RNA from plant tissue richin phenolic compounds. Analytical Biochemistry. 1991,197 (1) :91 95.)。普通的方法 (TRIZOL和硫酸胍法)无法提取红树植物的RNA，在提取过程中，强变性剂使红树植物细胞 破裂后释放出大量的单宁化合物，在酸性pH(pH4-6)条件下极易氧化使勻浆被变为褐色。
多糖的去除是RNA提取过程中另一个关键问题。多糖具有与RNA非常相似的理化 性质，很难将其与RNA分开。因此对多糖的处理不当，会导致RNA的提取出现两种后果，影响 进一步的生物学实验。第一，去除多糖的同时大量的RNA也被除去，使得RNA的产量受到影 响；第二，未能完全的去除RNA中的多糖，形成难溶于水的沉淀，或者溶解后为粘稠状溶液。
发明内容
本发明的目的是提供一种提取木本红树植物的总RNA的方法及其专用提取液。本发明提供的RNA提取缓冲液由1Tris-HCl、EDTA、NaCUSDS, DTT、β -巯基乙醇 和水组成；Tris-HCl 的终浓度为 75-125mmol 'T1jEDTA 的终浓度为 400-600mmol 'T1jNaCl 的终浓度为400-600mmol · Γ1, SDS的终浓度为(质量百分含量)，DTT的终浓度为 3-8mmol · L—1，β -巯基乙醇的终浓度为(质量百分含量)；ρΗ为8_9。所述RNA提取缓冲液具体可为=Tris-HCl的终浓度为IOOmmol · L—1，EDTA的终浓 度为500mmol · L—1，NaCl的终浓度为500mmol · L—1，SDS的终浓度为2% (质量百分含量)， DTT的终浓度为5mmol · L—1，β -巯基乙醇的终浓度为1. 5% (体积百分含量)；ρΗ为8. 5。所述RNA提取缓冲液在提取木本红树植物的总RNA中的应用也属于本发明的保护 范围。所述木本红树植物可为红树科(Rhizophoraceae)植物或使君子科 (Combretaceae)植物。所述红树科植物具体可为秋茄(Kadelia candel)、红海榄 (Rhizophora stylosa)等。所述使君子科植物具体可为榄李(Lumnitzera racemosa)等。本发明还保护一种提取木本红树植物的总RNA的方法，包括如下步骤(1)植物叶片加入PVP (聚乙烯吡咯烷酮)进行液氮研磨，得到粉末，用所述的RNA提取缓冲液进行提取，然后离心取上清；(2)加入NaCl水溶液混勻，再加入三氯甲烷混勻，离心取上层溶液；(3)加入NaCl水溶液混勻，再加入三氯甲烷混勻，离心取上层溶液；(4)加入2-丁氧乙醇，离心取上清；(5)加入 LiCl，沉淀 RNA ；(6)用乙醇水溶液洗涤。所述步骤中，2-丁氧乙醇的体积具体可为步骤C3)得到的上层溶液的体积的 1/4。所述步骤(5)中，所述LiCl以IOmol -L"1 LiCl水溶液的形式加入，加入体积为步 骤(4)得到的上清的体积的1/4。所述植物叶片、所述PVP、所述RNA提取缓冲液、所述步骤O)中的NaCl水溶液、 所述步骤O)中的三氯甲烷、所述步骤(3)中的NaCl水溶液和所述步骤(3)中的三氯甲 烷的配比具体如下0. 2g植物叶片0. 002-0. 004g PVP 0. 5mlRNA提取缓冲液:0. Iml 5mol 'T1NaCl水溶液0. 3ml三氯甲烷0. Iml 5mol 'T1NaCl水溶液0. 3ml三氯甲烷。所述木本红树植物可为红树科(Rhizophoraceae)植物或使君子科 (Combretaceae)植物。所述红树科植物具体可为秋茄(Kadelia candel)、红海榄 (Rhizophora stylosa)等。所述使君子科植物具体可为榄李(Lumnitzera racemosa)等。所述PVP具体可为分子量为40，000的PVP。本发明的方法的主要优点在于选用碱性提取缓冲液(pH = 8. 5左右)，一定程度 上防止了单宁化合物的氧化；在提取过程中加入PVP，PVP中的CO-N=对酚类化合物具有较 强的结合能力，可以螯合一部分酚类化合物；由于碱性条件的提取缓冲液会减弱PVP的螯 合作用，为了防止单宁化合物影响RNA的提取，在缓冲液中加入了 DTT(还原剂)和β-巯基 乙醇，有效地防止了单宁类物质的氧化；采用LiCl沉淀RNA，LiCl可以选择性的沉淀RNA， 能够获得比较纯净的RNA ；由于红树植物的特殊性，单纯的LiCl沉淀也不能完全去除多糖 的干扰，为了解决这个问题，在沉淀RNA之前采用20% 2- 丁氧乙醇先去除一部分多糖，由 于RNA、多酚和多糖在2- 丁氧乙醇中的溶解度不同，这样不仅去除了多余的多糖，同时也去 除掉了在溶液中残留的酚类物质。采用本发明的方法提取出来的RNA，可以直接用于合成 cDNA，进行建库、分子克隆、RACE等分子生物学操作。
图1为总RNA的琼脂糖凝胶电泳图；1 =TRIZOL提取的秋茄叶片RNA ；2 本发明的 方法提取的秋茄叶片RNA ；3 本发明的方法提取的红海榄叶片RNA ；4 本发明的方法提取 的榄李叶片RNA。图2为cDNA的琼脂糖凝胶电泳图；1 =TRIZOL提取的秋茄叶片RNA合成cDNA ；2 本发明的方法提取的秋茄叶片RNA合成cDNA ；3 本发明的方法提取的红海榄叶片RNA合成 cDNA ；4 本发明的方法提取的榄李叶片RNA合成cDNA。图 3 为目的基因 PCR 扩增结果；M :Trans2K Plus DNA Marker ；1 :PCR 产物。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。用于实施例的植物秋茄(Kadelia candel)、红海榄(Rhizophora stylosa)、榄李 (Lumnitzera racemosa)，均由何振艳于2008年3月采自于福建省厦门市陨笪湖，移栽于中 国科学院植物研究所温室培养。TRIZOL 购于 Invitrogen 公司；TransScript II Reverse Transcriptase KID 购于TRANS公司；DEPC、异硫氰酸胍、PVP等购自上海生工；Dnase I、Rase抑制剂、TaKaRa 3，-Full RACE Core Set Ver. 2. O Kit、TaKaRa 5，-Full RACE Kit 等购自大连宝生生物 公司；无Rase塑料管和枪头购于hvitrogen公司。用于RNA提取的研钵、药匙、镊子、试剂 瓶等均在240°C条件干热灭菌浊以上。实施例1、采用本发明的方法提取植物总RNA一、采用本发明的方法提取RNA提取缓冲液由Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS、DTT、β -巯基乙醇和水组成；Tris-HCl 的终浓度为IOOmmol · Λ EDTA的终浓度为500mmol · Λ NaCl的终浓度为500mmol · Λ SDS的终浓度为2% (质量百分含量)，DTT的终浓度为5mmol · β -巯基乙醇的终浓度为 1.5% (体积百分含量)；ρΗ为8. 5。取0. 5ml提取缓冲液装在1. 5ml离心管中65°C预热。分别提取秋茄(Kadeliacandel)、红海榄(Rhizophora stylosa)和榄李 (Lumnitzera racemosa)的 RNA,方法如下1、将0. 2g幼嫩叶片置于液氮中，加入PVP(分子量40，000) (PVP的加入量为叶片 质量的1-2% )研磨至粉末，迅速转移至提取液中，剧烈震荡离心管，将其混勻；2、室温平放 5min，4°C、12000g 离心 lOmin，取上清；3、加入0. Iml 5mol · L—1 NaCl水溶液充分混勻，加入0. 3ml三氯甲烷漩涡震荡 2min，充分混勻，4°C、12000g离心IOmin ；此时，溶液分为两层，取上层溶液；4、加入0. Iml 5mol · L—1 NaCl水溶液充分混勻；加入0. 3ml三氯甲烷，充分混勻， 4°C、12000g离心lOmin，取上层溶液；5、加入1/4体积的2- 丁氧乙醇，室温放置20min，4°C、12000g离心lOmin，取上清；6、加入1/4体积的IOmol · L-1 LiCl水溶液，混勻，_20°C过夜；7、4°C、12000g 离心 15min，取沉淀；8、用Iml 75% (体积百分含量)乙醇水溶液洗涤1_2次，晾干；9、取30 μ 1 DEPC水溶解沉淀。二、硫氰酸胍一步法(对照甲)提取总RNA参考《分子克隆实验指南》的方法(Sambrook J，Fritsch EF, Maniatis Y著(金 冬雁，黎孟枫等译)(1992)分子克隆实验指南(第2版).科学出版社.北京，352 355.) 提取秋茄(Kadelia candel)幼嫩叶片的总RNA。材料研磨后，加入提取液，待细胞裂解，溶 液呈棕色，并伴有粘稠物在液体的表面，说明单宁类化合物已经被氧化，且糖类物质已经被 释放出来，导致实验无法继续进行。三、TRIZOL法(对照乙)提取总RNA
用试剂盒提取秋茄(Kadelia candel)幼嫩叶片的总RNA。TRIZOL总RNA提取试 剂盒购于^vitrogen公司，严格按照试剂盒说明书操作。材料研磨后，加入提取液，待细胞 裂解，溶液呈棕色，并伴有粘稠物在液体的表面，说明单宁类化合物已经被氧化，且糖类物 质已经被释放出来，导致实验无法继续进行。四、RNA质量检测1、用紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度取Ιμ RNA溶液至无RNA酶的PCR管，用DEPC水稀释100倍，检测在紫外光沈Onm 和^onm的吸光值，结果见表1。表1红树植物RNA含量的检测
od260od280od260/od280对照乙0. 02210. 02131. 0375秋茄0. 15530. 08151. 9055榄李0.15470. 08051. 9217红海榄0. 03390. 01811.8729从表中的数据可以看出，三种红树的RNA的0D26Q/0D28Q均在1. 8-2. 0之间，进一步 验证了 RNA具有较好的完整性。2、电泳检测RNA的完整性用1. 2 %琼脂糖凝胶电泳检测RNA (见图1)。由图1可见，采用本发明的方法提取的RNA，出现3条条带Q8S、18S、5. 8S)。其中 28S比18S条带亮，亮度大概在2倍左右，说明RNA完整性较好。3、cDNA 的合成采用 TRANS 公司的 iTransScript II Reverse Transcriptase KID 提供的方法用 RNA合成 cDNA。按照 TransScript II Reverse Transcriptase KID 提供方法严格操作。结 果见图2。由图2可见，改良方法RNA合成得cDNA在0. l-2kb,而TRIZOL方法获得的RNA 合成的cDNA均在11Λ以下，说明改良法提取得RNA质量较高，有较高的转录活性，普通的 TRIZOL方法提取的RNA质量不能满足以后的实验要求4、KcCAS (Kadelia candel Cycloartenol Synthase)基因克隆以步骤2合成的秋茄cDNA为模板，根据KcCAS基因(GENBANK ACCESSION NUMBERAB292609)设计引物(5' -ATGTGGCGGCTCAAGATTGC-3‘； 5’ -CAAGAAGCCTGCAACACCC-3’)，PCR克隆KcCAS基因。PCR产物的电泳结果见图3，克隆到 了 2277bp的DNA片段。PCR产物的测序结果见序列表的序列1，所获得的DNA片段即KcCAS 基因。该实验进一步证明了通过本发明的方法提取的RNA质量高，可以用于分子克隆操作。序列表<110>中国科学院植物研究所<120>提取木本红树植物的总RNA的方法及其专用提取液
<130>CGGNARY102071
<160>1
<210>1
<211>2277
<212>DNA
〈213〉秋茄(Kadelia candel)
<400>1
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caggaaatcatgggggttttcaataggaattgtacgatta gttattctgcgtacaaggtc2220
attttccctatctgggcactgggagaataccgatgccggg tgttgcaggcttcttga227权利要求
1.一种RNA提取缓冲液由Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS、DTT、β -巯基乙醇和水组成； Tris-HCl 的终浓度为 75-125mmol ·Ι^，EDTA 的终浓度为 400-600mmol 'L^1jNaCl 的终浓度为 400-600mmol · L-1，SDS的终浓度为1-3% (质量百分含量)，DTT的终浓度为3-8mmol · L-1， β-巯基乙醇的终浓度为1-3% (质量百分含量)；ρΗ为8-9。
2.如权利要求1所述的RNA提取缓冲液，其特征在于Tris-HCl的终浓度为 IOOmmol · Λ EDTA的终浓度为500mmol · Λ NaCl的终浓度为500mmol · Λ SDS的终浓度 为2% (质量百分含量)，DTT的终浓度为5mmol · L—1，β -巯基乙醇的终浓度为1. 5% (体 积百分含量)；ρΗ*8.5。
3.权利要求1或2所述RNA提取缓冲液在提取木本红树植物的总RNA中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述木本红树植物为红树科 (Rhizophoraceae)植物或使君子科(Combretaceae)植物；所述红树科植物为秋 茄(Kadeliacandel)或红海榄(Rhizophora stylosa)；所述使君子科植物为榄李 (Lumnitzera racemosa)。
5.一种提取木本红树植物的总RNA的方法，包括如下步骤(1)植物叶片加入PVP进行液氮研磨，得到粉末，用权利要求1或2所述的RNA提取缓 冲液进行提取，然后离心取上清；(2)加入NaCl水溶液混勻，再加入三氯甲烷混勻，离心取上层溶液；(3)加入NaCl水溶液混勻，再加入三氯甲烷混勻，离心取上层溶液；(4)加入2-丁氧乙醇，离心取上清；(5)加入LiCl，沉淀RNA；(6)用乙醇水溶液洗涤。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中，2-丁氧乙醇的体积为步骤 (3)得到的上层溶液的体积的1/4。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述步骤(5)中，所述LiCl以 IOmol · L-1LiCl水溶液的形式加入，加入体积为步骤(4)得到的上清的体积的1/4。
8.如权利要求5至7中任一所述的方法，其特征在于所述植物叶片、所述PVP、 所述RNA提取缓冲液、所述步骤中的NaCl水溶液、所述步骤中的三氯甲烷、所 述步骤(3)中的NaCl水溶液和所述步骤(3)中的三氯甲烷的配比如下0. 2g植物叶 片0. 002-0. 004g PVP 0. 5mlRNA 提取缓冲液0. Iml 5mol · L^1NaCl 水溶液0. 3ml 三氯甲烷0. Iml 5mol · L^1NaCl水溶液0. 3ml三氯甲烷；所述PVP为分子量为40，000 的 PVP。
9.如权利要求5至8中任一所述的方法，其特征在于所述木本红树植物为红树科 (Rhizophoraceae)植物或使君子科(Combretaceae)植物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述红树科植物为秋茄(Kadeliacandel) 或红海榄(Rhizophora stylosa)；所述使君子科植物为榄李(Lumnitzeraracemosa)。
全文摘要
本发明公开了一种提取木本红树植物的总RNA的方法及其专用提取液。本发明提供的提取液由Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS、DTT、β-巯基乙醇和水组成；Tris-HCl的终浓度为75-125mmol·L-1，EDTA的终浓度为400-600mmol·L-1，NaCl的终浓度为400-600mmol·L-1，SDS的终浓度为1-3％(质量百分含量)，DTT的终浓度为3-8mmol·L-1，β-巯基乙醇的终浓度为1-3％(质量百分含量)；pH为8-9。本发明提供的方法是使用所述提取液提取木本红树植物的总RNA。采用本发明的方法提取出来的RNA，可以直接用于合成cDNA，进行建库、分子克隆等分子生物学操作。
文档编号C12N15/10GK102140447SQ201010103768
公开日2011年8月3日 申请日期2010年1月29日 优先权日2010年1月29日
发明者何振艳, 陈宏林, 麻密 申请人:中国科学院植物研究所