专利名称：：马立克氏病抗性纯合基因型鸡的检测方法
技术领域：
：本发明属生物学领域，具体是马立克氏病抗性纯合基因型鸡的检测方法。
背景技术：
：以前选育抗病品系主要用攻毒幸存者的繁殖或/和后裔测定。经典的例子是Cornell于1968采用该法进行多代选择，在第4代得到了主要用于科学研究的康乃尔MD抗病系和易感系。这些方法最简单，缺点是需要的基础群数量大，专门的攻毒环境，以及繁琐的后裔测定，育种成本高。
发明内容为了克服现有技术的不足，本发明提供一种马立克氏病抗性纯合基因型鸡的检测方法。本发明解决上述技术问题的技术方案是如下。马立克氏病抗性纯合基因型鸡的检测方法是采用PCR-RFLP技术，对MDV-1攻毒后的99羽霞烟鸡BLB2基因第2外显子进行PCR扩增，并对其PCR产物进行AluI、CaiI、CfrI、HinlI、HinfI和RsaI限制性内切酶酶切分析，利用对这6个位点酶切分析初步获得BLB2等位基因纯合型鸡只7羽；建立扩增BF2基因的PCR方法，并通过对获得的7羽纯合鸡BLB2与BF2基因测序，最终获得BLB2/BF2等位基因纯合型鸡只6羽；结合攻毒结果，认定其中MD抗性个体4羽，操作步骤如下1)鸡攻毒试验攻毒病毒材料的准备取MDV-1感染的鸭胚成纤维细胞培养物，每羽0.3mL腹腔注射10羽1日龄健康鸡，隔离饲养至1月龄左右时，翼下采集抗凝血，分离鸡外周血淋巴白细胞(PBLs)，利用禽肿瘤病三重PCR反应鉴别诊断技术进行检测，具体如下，MDV引物为上游引物5'TGCGATGAAAGTGCTATGGAGG3'，下游引物5，GAGAATCCCTATGAGAAAGCGC3'，REV引物为上游引物5'AAGTAAGGTGGTACGATCGTC3'，下游引物5'CTGCTTCATTCAGGTGTTCGCAAT3'，ALV引物为上游引物5'CATACTGGAGCCAATGGTT3'，下游引物5'AATGTTGTACCGAAGTACT3';引物比例为MDV:REV:ALV=1:2:l;PCR反应体系IOXPCRbuffer5iiL、25mMMgCL25iiL、10mMdNTPliiL、25pM上、下游引物各1iiL、Taq酶1.5U、DNA模板5iiL，灭菌三蒸水补足50iiL。反应循环参数95t:预变性lmin;35个循环94。C变性lmin、55t:退火lmin、72t:延伸lmin;72"后延伸8min;产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照，结果只有大小为317bp片断时，可确认MDV-l单一感染，采集鸡翅静脉抗凝血作为攻毒材料；鸡攻毒试验7日龄时取经病毒蚀斑计数含2500PFU的MDV-1，以0.4ml/羽腹腔注射所有试验鸡，至13周龄结束实验。试验鸡按常规方法分别隔离饲养并做常见疾病的防治工作，记录攻毒后死亡鸡及存活鸡的肿瘤发生及其检测结果。2)鸡PBLs的采集与分离4于攻毒后21天每羽2.02.5mL采集鸡血，分离PBLs，抽提DNA，于-2(TC保存备用。PBLs分离方法采集鸡翅静脉抗凝血约1.Oml，加入含O.5ml淋巴细胞分离液的离心管中，1，500r/min离心810分钟后，血液被分成数层，小心吸出分离液面的浅黄色层，即为所需的PBLs。3)试验鸡MD的确诊用传统的酚/氯仿DNA抽提方法提取鸡PBLs、羽囊、肝脏、脾脏和肾脏等内脏器官组织以及MDV-1细胞培养物的DNA，经禽肿瘤病三重PCR诊断技术检测只有大小为317bp片断时，可确认MDV-1单一感染。4)霞烟鸡BLB2基因的PCR扩增合成用于扩增BLB2基因第2外显子的引物上游弓|物火5'CAGCGTTCTTCTTCTGCGGT3'，下游引物为5'TCACCTTGGGCTCCACTGCG3'，扩增片段应为374bp;PCR反应体系10XPCRbuffer5iiL、80X甘油4iiL、二甲基亚砜2iiL、10mMd證liiL、25pM上、下游引物各1PL、Taq酶1.5U、DNA模板5iiL，灭菌三蒸水补足50iiL;反应循环参数95。C预变性lmin，35个循环(94。C变性30s、53。C退火30s、72。C延伸30s)，72。C后延伸8min;产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照，结果应只有大小为374bp片断一条；5)PCR产物的酶切分析PCR产物分别用限制性内切酶Alu1、Cai1、Cfr1、Hinl1、HinfI和Rsal进行酶切处理。反应体系10XbufferlyL，PCR产物5iiL，限制性内切酶均为5U，双蒸水补足10iiL。将样品混匀后离心，37t:水浴消化过夜，用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，分析酶切结果并利用表3得到纯合基因型组合的鸡；6)BLB2等位基因纯合型鸡只的确定对在这6个酶切位点所观测的纯合基因型组合的鸡只进行BLB2基因的克隆、序列测定。用2X的琼脂糖凝胶分离PCR产物，将目的带切下后用DNA纯化回收试剂盒纯化回收；除对PCR产物进行直接测序外，并将同一个样品的2次独立扩增、纯化产物与pMD18-T载体连接后转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞，提取质粒作为测序模板，每一个克隆最少挑取5个克隆子分别测序。7)BLB2基因序列同源性检索鉴定与比较分析通过美国国家生物技术信息中心网站的BLAST软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知基因进行序列同源性比较，以鉴定所获得的DNA序列。用DNAstar软件对等位基因第2外显子核苷酸序列和所编码的氨基酸序列进行比对分析，所引用的GenBank数据库中的BLB2基因序列来自白来航鸡3个不同单倍型MD中等抗性型B6、MD易感型B19、MD抗性型B"，抗性纯合基因型组合鸡的BLB2基因应与中等MD抗性B6单倍型核苷酸或MD抗性B21单倍型核苷酸同源性较高，而易感抗性纯合基因型组合鸡的BLB2基因应与MD易感型B19单倍型核苷酸同源性较高。8)BF2等位基因纯合型鸡只的确定合成上游引物为5'GCAGAGCTCCATACCCTGCGGTA3'，下游弓|物为5'TCTCCTGCCCAGCTCAGCCTT3'，用于扩增BF2基因第2内含子，第2外显子，第3内含子。用1.5%的琼脂糖凝胶分离PCR产物，切下目的带并用试剂盒纯化回收，对PCR产物进行直接测序，并将同一个样品的2次独立扩增、纯化产物与pMD18-T载体连接后转化到大肠杆菌DHsCi感受态细胞，提取质粒测序，每一个克隆最少挑取5个克隆子分别测序；PCR反应体系10XPCRbuffer5iiL、80X甘油4iiL、二甲基亚砜2iiL、10mMdNTPliiL、25pM上、下游引物各1PL、Taq酶1.5U、DNA模板5iiL，灭菌三蒸水补足50iiL;反应循环参数95。C预变性lmin，35个循环(94。C变性30s、53。C退火15s、72。C延伸60s)，72。C后延伸8min。产物用2.0%琼脂糖擬胶电泳，擬胶成像系统观察结果并拍照，结果应只有大小为765bp片断一条。9)BF2基因序列同源性检索鉴定与比较分析用经过我们序列测定的BF2DNA序列在美国国家生物技术信息中心网站的BLAST软件上搜索同源序列，以鉴定所获得的BF2基因；使用DNAstar软件对我们获得的BF2等位基因和其它不同单倍型的第2外显子、第3内含子核苷酸序列进行比对分析，所引用的GenBank数据库中的BF2基因序列来自白来航鸡3个不同单倍型MD中等抗性型B6、MD易感型B19、MD抗性型B2;抗性纯合基因型组合鸡的BF2基因应与中等MD抗性B6单倍型核苷酸或MD抗性B21单倍型核苷酸同源性较高，而易感抗性纯合基因型组合鸡的应与MD易感型B19单倍型核苷酸同源性较高。10)结合MDV-1攻毒结果及BLB2和BF2基因测序结果确定马立克氏病抗性纯合基因型鸡对由BLB2和BF2基因序列测定得到BLB2和BF2纯合基因型鸡只，结合它们攻毒后的发病情况，确定抗性纯合基因型鸡只。本发明与现有技术比较的益效是鸡马立克氏病是危害养禽业的三种主要疾病之一，MDV存在免疫抑制的危害，结果导致机体抵抗力以及对其它疫苗的免疫反应性下降，极易并发或继发感染其它病原，造成更大的损失。本专利所建立的方法能检测到MD抗性纯合基因型鸡，并以其为种鸡来繁殖MD抗性鸡，这对从遗传素质上做好MD及相关免疫抑制性疾病的预防和控制具有极其可观的经济效益。图1是多重PCR检测YL040920/C6株感染的DEF和感染/非感染鸡的不同组织样品图。图中(A)M:DNA标准;1:MDV(317bp)，REV(291bp)和ALV(220bp)的阳性对照;2:CVI988(449bp，317bp，185bp)的阳性对照。(B)M:DNA标准;1:非感染鸡的脾脏;2:感染MDV-1的DEFs;3，4，5，6，7:感染鸡的PBLs、羽囊、肝脏、脾脏和肾脏；8:阴性对照。图2是PCR扩增霞烟鸡的BLB2基因图。图中1.18是DNA标准；2_17是部分样品图3是BLB2基因扩增片段在Alu1、Cai1、Cfr1、Hinl1、HinfI和RsaI酶切位点的PCR-RFLP基因型电泳检测图。图4是BF2基因重组质粒的PCR鉴定和酶切鉴定图。图中M:100bpDNA标准；1:重组质粒PCR产物(765bp);2:阴性对照；3:重组质粒酶切产物；4:重组质粒。具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。但必实施例1.鸡攻毒试验结果按
发明内容中鸡攻毒试验进行试验，攻毒后13周试验结束，MD抗性霞烟鸡存活14羽，普通霞烟鸡存活9羽(表1)，存活鸡只中MD抗性鸡肿瘤发生个数远少于普通霞烟鸡，从而获得了MD抗性与易感显著差异的个体。表1.攻毒后试验鸡肿瘤有无、死亡及存活情况组别存活、无肿瘤存活、有肿瘤死亡、无肿瘤死亡、有肿瘤Y271027K1221821注K群表示MD抗性鸡(C、D组)，Y群表示普通霞烟鸡(A、B组)；表中单位为"羽"。A、B、C、D四组鸡肿瘤死亡率、肿瘤发生率等情况如表2所示。经t检验表明MD抗性鸡肿瘤死亡率(43.38%)显著低于(p<0.05)普通霞烟鸡(65.15%)，肿瘤发生率(47.15%)差异极显著低于(p<0.01)普通霞烟鸡(73.86%)，说明这些实验动物可以作为MD抗性基因研究的主要素材。表2.攻毒后各组试验鸡的肿瘤发生、死亡、细菌分离情况(表中单位为"羽")组别鸡只数MD(MD)死亡数死亡率％MD(MD)肿瘤鸡只数肿瘤发生率％细菌阳性鸡A241666.671875.008B221463.631672.728C271244.441348.1410D261142.311246.15132.鸡外周血淋巴细胞(PBLs)的采集与分离MDV-1攻毒后于21天无菌采集并分离的全部试验鸡PBLs为材料。3.试验鸡MD的确诊试验鸡MD的确诊结果对鸡PBLs、羽囊、病鸡肝脏、脾脏和肾脏等内脏器官组织以及YL040920/C6DEF细胞培养物的DNA采用三重PCR方法检测MDV、REV和ALV。结果显示，脾脏和肾脏MDV阳性率达到100%，肝脏为96.18X，而在全部的检测样品中均未发现ALV、REV的感染，MDV、REV、ALV及疫苗株CVI988阳性对照见图1(A)，部分试验鸡的三重PCR检测结果见图1(B)。4.霞烟鸡BLB2基因的PCR扩增霞烟鸡BLB2基因的PCR扩增结果用建立的扩增BLB2基因的PCR方法从霞烟鸡PBLs的DNA样品中均能扩增到大小7为374bp的特异性目的片段如图2所示。对120个个体进行PCR-RFLP分型后，对从中所筛选出的8个个体进行克隆、测序和同源性比较表明，引物序列与MHCBLB2基因(GenBank收录号M29763)的锚定序列完全一致；该PCR扩增产物对应于目的基因第1内含子的3个核苷酸、第2外显子的第1127至1396位核苷酸、第2内含子的第1396至1482位核苷酸和第3外显子的15个核苷酸序列，长度为374bp。此表明该引物特异地扩增了BLB2基因的目的片段。5.PCR产物的酶切分析霞烟鸡BLB2基因的PCR扩增及PCR-RFLP分析结果从霞烟鸡PBLs的DNA样品中扩增到374bp的片段，测序和同源性比较表明，所扩增片段为BLB2基因片段；用限制性内切酶Alu1、Cai1、Cfr1、Hinl1、HinfI和RsaI对该片段进行酶切，基因型检测结果见图3;利用DNAstar软件预测BLB2基因(来自GenBank)酶切后的带型及本试验中检测到的带型见表3。5.PCR产物的酶切分析霞烟鸡BLB2基因的PCR扩增及PCR-RFLP分析结果从霞烟鸡PBLs的DNA样品中扩增到374bp的片段，测序和同源性比较表明，所扩增片段为BLB2基因片段；用限制性内切酶Alu1、Cai1、Cfr1、HinlI、HinfI和RsaI对该片段进行酶切，基因型检测结果见图3;利用DNAstar软件预测BLB2基因(来自GenBank)酶切后的带型及本试验中检测到的带型见表3。表3.BLB2基因片段PCR-RFLP基因型电泳分型8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>根据预测结果(表3)及检测结果(图3)，初步确认在被检测的群体中有7羽BLB2等位基因纯合型鸡只(表4)。表4.在6个限制性酶切位点检测出的7羽纯合基因型组合鸡只观测到的PCR-RFLP基因型C#I战WIfoaIA5gbA6abbbAfbabB21gbabc23fba3"bD8abbbCbD12fb3b6.BLB2等位基因纯合型鸡只的确定经DNA序列后确定6羽BLB2等位基因纯合型鸡只，分别是A5、An、B21、C23、D8和7.BLB2基因序列同源性检索鉴定与比较分析纯合基因型鸡只的BLB2基因核甘酸序列的比较分析结果领U定的BLB2基因核甘酸序列与下载的参考序列的比对，同源性比较分析。结果发现在6羽BLB2等位基因纯合型霞烟鸡只中MD抗性个体AU、C23、D12、K8的核苷酸同源性高达100%，与中等MD抗性B6单倍型核苷酸同源性高达98.9%;MD抗性个体Au(与C23、D12相同)与易感个体ApBa的核苷酸同源性仅分别为91.4%和93.3%;易感个体~、821间的核甘酸同源性达95.5%，与白来航鸡的819单倍型(MD易感型)核苷酸同源性较高，分别达96.3%和94.8%。8.BF2等位基因纯合型鸡只的确定霞烟鸡BF2基因的PCR扩增及其重组质粒的鉴定结果用建立的扩增BF2基因的PCR方法从霞烟鸡PBLs的DNA样品中均能扩增到大小为765bp的特异性目的片段，pGM-T-BF2重组质粒PCR和EcoRI酶切结果见图4;对质粒DNA进行序列测定后，插入DNA片段的序列经GenBank数据库进行BLAST比较分析表明，所扩增片段为BF2基因片段，说明pGM-T-BF2重组质粒构建成功。9.BF2基因序列同源性检索鉴定与比较分析纯合基因型鸡只的BF2基因核甘酸序列的比较分析结果领淀的BF2基因核甘酸序列与下载的参考序列的比对，同源性比较分析。结果发现，在6羽BF2等位基因纯合基因型霞烟鸡只中MD抗性个体An、C23、D12的核苷酸同源性高达100%，与白来航鸡86单倍型(中等MD抗性型)核苷酸同源性较高，达到93.4%。MD抗性个体D8与MD抗性单倍型B21核苷酸同源性较高达93.8%;普通个体A5、B21间的核甘酸同源性达92.5%，并且与MD易感单倍型B19核苷酸同源性分别达91.6%和92.9%。10.结合MDV-1攻毒结果及BLB2和BF2基因测序结果确定抗性纯合基因型鸡只对7羽在上面6个酶切位点所观测的纯合基因型组合的鸡只进行BLB2基因的克隆、序列测定，测序结果为GenBank登录号(A5_EU502870，B21_EU579527，D^(与An，C23相同)-EU579528，D8_EU579529);并对7羽在上面6个酶切位点所观测的纯合基因型组10合的鸡只进行BF2基因的克隆、序列测定，测序结果为(GenBank登录号A5_EU620713，B21-EU620714，D12(与A、C23相同)_EU620715和D8_EU581948);测序结果表明这7羽中仅有6羽为BLB2/BF2等位基因纯合基因型鸡只，代号分别为A5、An、B21、C23、D8和D12，结合这6羽BLB2/BF2等位基因纯合型鸡只攻毒后的发病情况(表5)，我们推断An、C23、D12和D8为MD抗性个体。表5.6羽纯合基因型鸡只攻毒后的发病情况<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求马立克氏病抗性纯合基因型鸡的检测方法，其特征在于，采用PCR-RFLP技术，对MDV-1攻毒后的99羽霞烟鸡BLB2基因第2外显子进行PCR扩增，并对其PCR产物进行AluI、CaiI、CfrI、Hin1I、HinfI和RsaI限制性内切酶酶切分析，利用对这6个位点酶切分析初步获得BLB2等位基因纯合型鸡只7羽；建立扩增BF2基因的PCR方法，并通过对获得的7羽纯合鸡BLB2与BF2基因测序，最终获得BLB2/BF2等位基因纯合型鸡只6羽；结合攻毒结果，认定其中MD抗性个体4羽，操作步骤如下1)鸡攻毒试验攻毒病毒材料的准备取MDV-1感染的鸭胚成纤维细胞培养物，每羽0.3mL腹腔注射10羽1日龄健康鸡，隔离饲养至1月龄左右时，翼下采集抗凝血，分离鸡外周血淋巴白细胞(PBLs)，利用禽肿瘤病三重PCR反应鉴别诊断技术进行检测，具体如下，MDV引物为上游引物5’TGCGATGAAAGTGCTATGGAGG3’，下游引物5’GAGAATCCCTATGAGAAAGCGC3’，REV引物为上游引物5’AAGTAAGGTGGTACGATCGTC3’，下游引物5’CTGCTTCATTCAGGTGTTCGCAAT3’，ALV引物为上游引物5’CATACTGGAGCCAATGGTT3’，下游引物5’AATGTTGTACCGAAGTACT3’；引物比例为MDV∶REV∶ALV＝1∶2∶1；PCR反应体系10×PCRbuffer5μL、25mMMgCL25μL、10mMdNTP1μL、25pM上、下游引物各1μL、Taq酶1.5U、DNA模板5μL，灭菌三蒸水补足50μL。反应循环参数95℃预变性1min；35个循环94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min；72℃后延伸8min；产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照，结果只有大小为317bp片断时，可确认MDV-1单一感染，采集鸡翅静脉抗凝血作为攻毒材料；鸡攻毒试验7日龄时取经病毒蚀斑计数含2500PFU的MDV-1，以0.4ml/羽腹腔注射所有试验鸡，至13周龄结束实验，试验鸡按常规方法分别隔离饲养并做常见疾病的防治工作，记录攻毒后死亡鸡及存活鸡的肿瘤发生及其检测结果；2)鸡PBLs的采集与分离于攻毒后21天每羽2.0～2.5mL采集鸡血，分离PBLs，抽提DNA，于-20℃保存备用；PBLs分离方法采集鸡翅静脉抗凝血约1.0ml，加入含0.5ml淋巴细胞分离液的离心管中，1,500r/min离心8～10分钟后，血液被分成数层，小心吸出分离液面的浅黄色层，即为所需的PBLs；3)试验鸡MD的确诊用传统的酚/氯仿DNA抽提方法提取鸡PBLs、羽囊、肝脏、脾脏和肾脏等内脏器官组织以及MDV-1细胞培养物的DNA，经禽肿瘤病三重PCR诊断技术检测只有大小为317bp片断时，可确认MDV-1单一感染；4)霞烟鸡BLB2基因的PCR扩增合成用于扩增BLB2基因第2外显子的引物上游引物为5’CAGCGTTCTTCTTCTGCGGT3’，下游引物为5’TCACCTTGGGCTCCACTGCG3’，扩增片段应为374bp；PCR反应体系10×PCRbuffer5μL、80％甘油4μL、二甲基亚砜2μL、10mMdNTP1μL、25pM上、下游引物各1μL、Taq酶1.5U、DNA模板5μL，灭菌三蒸水补足50μL；反应循环参数95℃预变性1min，35个循环94℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸30s，72℃后延伸8min；产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照，结果应只有大小为374bp片断一条；5)PCR产物的酶切分析PCR产物分别用限制性内切酶AluI、CaiI、CfrI、Hin1I、HinfI和RsaI进行酶切处理；反应体系10×buffer1μL，PCR产物5μL，限制性内切酶均为5U，双蒸水补足10μL，将样品混匀后离心，37℃水浴消化过夜，用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，分析酶切结果并利用表3得到纯合基因型组合的鸡；6)BLB2等位基因纯合型鸡只的确定对在这6个酶切位点所观测的纯合基因型组合的鸡只进行BLB2基因的克隆、序列测定，用2％的琼脂糖凝胶分离PCR产物，将目的带切下后用DNA纯化回收试剂盒纯化回收；除对PCR产物进行直接测序外，并将同一个样品的2次独立扩增、纯化产物与pMD18-T载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒作为测序模板，每一个克隆最少挑取5个克隆子分别测序；7)BLB2基因序列同源性检索鉴定与比较分析通过美国国家生物技术信息中心网站的BLAST软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知基因进行序列同源性比较，以鉴定所获得的DNA序列，用DNAstar软件对等位基因第2外显子核苷酸序列和所编码的氨基酸序列进行比对分析，所引用的GenBank数据库中的BLB2基因序列来自白来航鸡3个不同单倍型MD中等抗性型B6、MD易感型B19、MD抗性型B21，抗性纯合基因型组合鸡的BLB2基因应与中等MD抗性B6单倍型核苷酸或MD抗性B21单倍型核苷酸同源性较高，而易感抗性纯合基因型组合鸡的BLB2基因应与MD易感型B19单倍型核苷酸同源性较高；8)BF2等位基因纯合型鸡只的确定合成上游引物为5’GCAGAGCTCCATACCCTGCGGTA3’，下游引物为5’TCTCCTGCCCAGCTCAGCCTT3’，用于扩增BF2基因第2内含子，第2外显子，第3内含子；用1.5％的琼脂糖凝胶分离PCR产物，切下目的带并用试剂盒纯化回收，对PCR产物进行直接测序，并将同一个样品的2次独立扩增、纯化产物与pMD18-T载体连接后转化到大肠杆菌DH6α感受态细胞，提取质粒测序，每一个克隆最少挑取5个克隆子分别测序；PCR反应体系10×PCRbuffer5μL、80％甘油4μL、二甲基亚砜2μL、10mMdNTP1μL、25pM上、下游引物各1μL、Taq酶1.5U、DNA模板5μL，灭菌三蒸水补足50μL；反应循环参数95℃预变性1min，35个循环94℃变性30s、53℃退火15s、72℃延伸60s，72℃后延伸8min；产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照，结果应只有大小为765bp片断一条；9)BF2基因序列同源性检索鉴定与比较分析用经过我们序列测定的BF2DNA序列在美国国家生物技术信息中心网站的BLAST软件上搜索同源序列，以鉴定所获得的BF2基因；使用DNAstar软件对我们获得的BF2等位基因和其它不同单倍型的第2外显子、第3内含子核苷酸序列进行比对分析，所引用的GenBank数据库中的BF2基因序列来自白来航鸡3个不同单倍型MD中等抗性型B6、MD易感型B19、MD抗性型B2；抗性纯合基因型组合鸡的BF2基因应与中等MD抗性B6倍型核苷酸或MD抗性B21单倍型核苷酸同源性较高，而易感抗性纯合基因型组合鸡的应与MD易感型B19单倍型核苷酸同源性较高；10)结合MDV-1攻毒结果及BLB2和BF2基因测序结果确定马立克氏病抗性纯合基因型鸡对由BLB2和BF2基因序列测定得到BLB2和BF2纯合基因型鸡只，结合它们攻毒后的发病情况，确定抗性纯合基因型鸡只。全文摘要本发明公开了马立克氏病抗性纯合基因型鸡的检测方法。采用PCR-RFLP技术，对MDV-1攻毒的99羽霞烟鸡BLB2基因第2外显子进行PCR扩增，并对其PCR产物进行AluI、CaiI、CfrI、Hin1I、HinfI和RsaI限制性内切酶酶切分析，对这6个位点酶切分析初步获得BLB2等位基因纯合型鸡只7羽；通过对这7羽纯合鸡BLB2与BF2基因测序，最终获得BLB2/BF2等位基因纯合型鸡只6羽；结合攻毒结果，认定其中MD抗性个体4羽。本发明建立的方法能检测到MD抗性纯合基因型鸡，并以其为种鸡来繁殖MD抗性鸡，这对从遗传素质上做好MD及相关免疫抑制性疾病的预防和控制具有极其可观的经济效益。文档编号C12Q1/68GK101792801SQ20101010287公开日2010年8月4日申请日期2010年1月29日优先权日2010年1月29日发明者李娅,赵子轶,金元昌,韦信贤,韦平申请人:广西大学