专利名称：一种红豆杉细胞系的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种红豆杉细胞系，本发明还涉及该细胞系的制备方法及其培养物的大规模生产方法。
背景技术：
红豆杉系红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)的一类乔木和灌木，从红豆杉可以提取化合物紫杉醇。紫杉醇是一种二萜类生物碱，经临床证明对治疗卵巢癌、肺癌、结肠癌、转移性乳腺癌、黑色素瘤、白血病等多种癌症有特效，致使紫杉醇成为当前最热门的抗癌药物之一。
目前紫杉醇主要从树皮中获取，来源极其有限，这不仅破坏了红豆杉资源和生态平衡，也根本无法满足人们对紫杉醇日益增长的需求。因此应用细胞培养的方法进行红豆杉的开发即可以满足临床对红豆杉药物的需求，也可以保护自然资源，维护生态环境。本发明寻找到了一种高产红豆杉细胞系，提高了利用植物细胞生产紫杉醇的工作效率，降低了生产成本。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种高产紫杉醇的红豆杉细胞系。
本发明以东北红豆杉种胚作为外植体，诱导愈伤组织，通过反复继代培养和筛选得到高产紫杉醇细胞系。该红豆杉细胞系具有以下特征生长旺盛、呈黄白色、水分充足、呈团粒状，质地均匀、略偏硬，红豆杉化合物含量为培养物干重的0.8-0.12％，培养周期25-35天。具体地说，本发明通过如下方法制备得到上述细胞系 (1)红豆杉种子种胚的培育 取天然东北红豆杉的种子，先用75％酒精浸泡10-30s，然后用1％氯化汞溶液消毒8-12min，再用无菌水反复冲洗4-5次，最后放在无菌滤纸上吸干种子表面水分，用无菌镊子接种在B5(配方见附表1)中添加0.5-3mg/L GA(赤霉素)、10-30g/L蔗糖、0.6g/L琼脂的固体培养基上，22-27℃暗培养，约10天种胚膨大，生胚芽。
(2)愈伤组织的诱导和培养 取种胚、胚芽做外植体，在无菌条件下，用无菌手术剪刀和无菌镊子将种胚、胚芽切成2-5mm长的小段，接种在B5(配方见附表1)中添加0.2mg/L-0.5mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤)、2mg/L-4mg/L NAA(萘乙酸)、0.6g/L琼脂及30g/L蔗糖的固体培养基上，22-27℃暗培养，7-10天诱导出愈伤组织。
(3)愈伤组织的继代筛选 本发明通过对红豆杉愈伤组织的诱导和培养得到了四种东北红豆杉细胞系白色系、黄色系、红褐色系和黄白色色系；对4种细胞系分别进行了继代培养，通过对其生长速度、红豆杉化合物含量的检测，确定紫黄白色细胞系为长势较好，紫杉醇化合物含量最高的细胞系。
选取紫黄白色细胞系为原始细胞系，用目测法从固体培养基中挑选颜色较深、鲜亮的黄白色愈伤组织在B5(配方见附表1)中添加0.2mg/L-0.5mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤)、2mg/L-4mg/LNAA(萘乙酸)、0.6g/L琼脂及30g/L蔗糖的固体培养基上继续继代培养。为更好的优化种子、纯化细胞系，继代时接种块大小控制在3mm以下。如此反复，对所选择细胞系逐步驯化，本发明经过近30代筛选获得了可以无限传代培养的稳定高产红豆杉细胞系Hu-1。
本发明的第二个目的在于提供上述红豆杉细胞系培养物的继代培养方法，其所用培养基为B5培养基(配方见附表1)中添加0.2mg/L-0.5mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤)、2mg/L-4mg/L NAA(萘乙酸)、0.6g/L琼脂及30g/L蔗糖，pH值5.2-5.8，接种块为4-6mm，培养条件温度22-27℃，暗培养，培养时间25-35天。继代时选择生长旺盛、颜色鲜艳、呈黄白色，结构致密、呈团粒状，质地均匀、略偏硬为特征的培养物继代。此外还对培养物的紫杉醇含量进行考察，选择综合性状好的培养物继代。
本发明的第三个目的在于提供一种大规模生产上述细胞系培养物的方法。本发明方法将液体摇床培养与固体培养相结合，用高产红豆杉细胞系Hu-1做种子，置于装有150mL液体培养基的500mL培养瓶中悬浮培养，液体培养基为B5培养基(配方见附表1)添加0.2mg/L-0.5mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤)、2mg/L-4mg/LNAA(萘乙酸)及30g/L蔗糖，pH值5.2-5.8，接种量3-6％(W/V，g.fw/ml)，培养条件温度为22-27℃，摇床转速100-120rpm，培养时间20-25天，收集。
在利用生产用种进行大规模生产的同时，根据生产量大小，可以从中选择生长旺盛、颜色鲜艳、呈黄白色，结构致密、呈团粒状，质地均匀、略偏硬为特征的愈伤组织留种。此外上述方法中液体培养和固体培养可同期进行，这样可以将生产周期缩短。在生产过程中还可以对培养物的紫杉醇含量进行考察，选择综合性状好的培养物留种。
本发明细胞系可用于红豆杉细胞培养物的大规模生产，不仅满足了临床需求，而且保护了国家珍稀植物红豆杉。
本发明的优点主要体现 (1)本发明提供的细胞系紫杉醇含量高，紫杉醇含量占培养物干重的0.08-0.12％(2)生长旺盛，细胞生长速率可达16-18g干重/升/月，培养周期短，25-35天。(3)稳定性高，可无限传代。(4)通过本发明方法可进行大规模生产，与野生型相比生产周期大大缩短，并且所生产的培养物质量稳定产量高。(5)本发明方法不占耕地，不破坏红豆杉野生资源，保护了生态环境，解决了红豆杉资源短缺的问题。
具体实施例方式 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
实施例1红豆杉细胞系的获得 取天然红豆杉的种子，先用75％酒精浸泡10-30s，然后用1％氯化汞溶液消毒8-12min，再用无菌水反复冲洗4-5次，最后放在无菌滤纸上吸干种子表面水分，用无菌镊子接种在1/2MS(配方见附表1)中添加0.5-3mg/L GA(赤霉素)、10-30g/L蔗糖、0.6g/L琼脂的固体培养基上，22-27℃培养，约10天种子即可萌发长。
取胚芽做外植体，在无菌条件下，用无菌手术剪刀和无菌镊子将无菌苗根、茎、叶及子叶、胚芽切成2-5mm长的小段，接种在MS(配方见附表1)中添加0.2mg/L-0.5mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤)、2mg/L-4mg/L NAA(萘乙酸)、0.6g/L琼脂及30g/L蔗糖的固体培养基上，22-27℃暗培养，25-35天诱导出愈伤组织。
本发明通过对雪莲愈伤组织的诱导和培养得到了四种新疆雪莲细胞系白色系、黄色系、红褐色系和黄白色系；对4种细胞系分别进行了继代培养，通过对其生长速度、紫杉醇化合物含量的检测，确定黄白色细胞系为长势较好，紫杉醇化合物含量最高的细胞系。
选取黄白色细胞系为原始细胞系，用目测法从固体培养基中挑选颜色较深、色彩鲜亮的黄白色愈伤组织在B5(配方见附表1)中添加0.2mg/L-0.5mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤)、2mg/L-4mg/L NAA(萘乙酸)、0.6g/L琼脂及30g/L蔗糖的固体培养基上继续继代培养。为更好的优化种子、纯化细胞系，继代时接种块大小控制在3mm以下。如此反复，对所选择细胞系逐步驯化，本发明经过近40代筛选获得了可以无限传代培养的稳定高产红豆杉系Hu-1，该细胞系生长旺盛、颜色鲜艳、呈黄白色，结构致密、呈团粒状，质地均一、容易分离；红豆杉紫杉醇含量为细胞干重的0.08-0.12％。
实施例2生产方法 1、固体培养 1.1种子的选取 用显微镜观察检测，选取颜色黄白色、长势较好、分散性好、颗粒均匀无污染的培养物作生产用种。
2.2培养基 B5(配方见附表1)中添加0.2mg/L-0.5mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤)、2mg/L-4mg/LNAA(萘乙酸)、0.6g/L琼脂及30g/L蔗糖的固体培养基 2.3接种 无菌条件下，挑取生长旺盛、颜色鲜艳、呈黄白色，分散性好、颗粒均匀、无污染的细胞团转接至固态培养基上，接种块大小为4-6mm。
2.4固体培养 培养温度22-27℃，暗培养周期25-35天。
3培养物的收集及循环生产 2、液体摇床培养 2.1选种 选取固体培养20-24天，长势较好，颜色鲜艳，呈黄白色，颗粒均匀，质地均一，容易分离的本发明细胞系Hu-1培养物作种子。
2.2培养基配制 采用500ml培养瓶，每瓶装120-150ml培养液，培养液成分为B5(配方见附表1)中添加0.2mg/L-0.5mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤)、2mg/L-4mg/L NAA(萘乙酸)及30g/L蔗糖，pH值为5.2-5.8；高温灭菌121℃，20min。
2.3接种 无菌条件下，将培养物用镊子夹碎后接种到装有120-150ml培养液的500ml培养瓶中，接种量3-6％(W/V，g.fw/ml)。
2.4摇床培养 培养条件培养温度为22-27℃，摇床转速100-120rpm，培养时间8-10d。
培养过程中，多观察，发现染菌立即挑出。
3培养物的收集及循环生产 3.1留种 大规模生产的同时，可以从中选择生长旺盛、颜色鲜艳、呈黄白色，结构致密、呈团粒状，质地均匀、略偏硬为特征的愈伤组织留种。
3.2培养物收集 收集剩余培养物，低温真空干燥，即可。根据需要，可以将干燥的培养物磨成粗粉或细粉，或者用来提取紫杉醇。
附表1培养基配方
权利要求
1.一种东北红豆杉高产细胞系。
2.权利要求1所述细胞系的建立方法，其特征在于，采用野生东北红豆杉的种胚为外植体，在含激素的B5(配方见附表1)培养基上诱导愈伤组织并进行继代筛选，激素组合为0.1-0.5mg/L 6-BA和1-5mg/L NAA，培养温度为22-27℃，15～20天继代一次。
3.如权利要求2所述的继代筛选方法，其特征在于，继代时从白色系、黄色系、红褐色系、黄白色系中选择生长旺盛、颜色鲜艳呈黄白、水分充足、结构明显的培养物继代。
4.如权利要求3所述的继代培养方法，其特征在于，继代时还包括对培养物中紫杉醇含量进行考察，选择综合性状好的培养物继代。
5.权利要求1所述细胞系的大规模生产方法，其步骤包括
1)用权利要求4中选出的综合性状好的培养物作种子，采用固态培养的方法制种；
2)将步骤1)得到的种子用于液态培养。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)液体摇床培养所用培养基为添加0.1-0.5mg/L 6-BA与1-5mg/L NAA激素组合的B5培养基(配方见附表1)，接种量3-6％(W/V，g.fw/ml)，培养条件pH值为5.2-5.8，培养温度为22-27℃，摇床转速100-120rpm，暗培养，培养25天收集培养液及干物质。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)固体培养选择黄白色、长势良好、分散性好、颗粒均匀、无污染的培养物作种子进行固态培养生产，接种到含激素的B5培养基(配方见附表1)上，激素组合为0.1-0.5mg/L 6-BA与1-5mg/LNAA，接种块为4-6mm，培养条件温度22-27℃，暗培养，培养时间15～20天。
8.如权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，还包括对培养物的紫杉醇含量进行考察，选择综合性状好的培养物留种。
全文摘要
本发明提供了一种稳定、高产紫杉醇的东北红豆杉细胞系，紫杉醇含量可达培养物干重的0.8-0.12％，是野生红豆杉的4-6倍。本发明还提供了一种该细胞系的培养技术及大规模快速生产该细胞系培养物的方法，该方法采用液-固培养相结合，通过液体培养制种，固体培养得到培养物，从中选择综合性状好的留种用于液体培养，如此反复。该方法可用于大规模生产，与野生型相比生产周期大大缩短，并且质量稳定，产量高。此外，该方法不占耕地，不破坏红豆杉野生资源，保护了生态环境，解决了新疆雪莲资源短缺的问题。
文档编号C12N5/04GK101768567SQ201010100380
公开日2010年7月7日 申请日期2010年1月25日 优先权日2010年1月25日
发明者刘汉石 申请人:大连普瑞康生物技术有限公司, 陈梓, 初颖