专利名称：一种制备同时表达多个基因的转基因动物的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种制备同时表达多个基因的转基因动物的 方法。
背景技术：
在传统制备转基因动物的研究中，往往借助真核表达载体来实现，通过分子生物 学手段将目的基因片段连接到真核启动子下游，整合到细胞基因组中后能指导外源基因表 达，该方法在基因表达及功能的研究中有着极其广泛的应用，传统转基因方法每次转基因 只整合一个目的基因，进而制备表达一个基因的转基因动物，如果涉及制备多基因转基因 动物，则需单独制备相应的单基因转基因动物，然后通过转基因动物间的交配等方法制备 转多基因动物的后代，这种制备多基因动物的方法费时费力而且耗费高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备转基因胚胎的方法。本发明提供的制备转基因胚胎的方法，是将植酸酶基因和人粘病毒抗性基因A均 导入目的胚胎中，得到转基因胚胎。上述植酸酶基因的核苷酸序列如序列表中序列1的自5’端第1360-2658位；上述 人粘病毒抗性基因A的核苷酸序列如序列表中序列1的自5’端第3803-5791位。上述植酸酶基因和人粘病毒抗性基因A具体可以是通过核苷酸序列如序列表中 序列1所示的DNA片段导入胚胎中。上述胚胎为原核期胚胎。上述胚胎为除人以外的任何一种动物的胚胎，具体可以是猪、牛、羊、猫、狗、兔或 鼠的胚胎。本发明的又一目的在于提供一种培育转基因动物的方法。本发明提供的培育转基因动物的方法是将上述的制备转基因胚胎的方法所制备 的转基因胚胎移植到雌性的目的动物的体内，得到能同时表达多个基因的转基因动物。上述目的动物可为除人以外的任何一种动物，具体可以是猪、牛、羊、猫、狗、兔或鼠。本发明利用构建的同时表达植酸酶和人粘病毒抗性基因的真核表达载体 pcDNA-appA-MxA，利用显微注射法制备了含双基因(植酸酶基因(appA)和人粘病毒抗性基 因A(MxA))的转基因猪。能同时检测出转基因猪种同时整合双基因本发明的载体显著优 势表现在一次转基因实现多基因的同时表达，为制备转联合基因动物等提供一种便捷的手 段。
图1 扩增appA凝胶电泳图。
图 2 :pcDNA-appA 质粒图谱。图3 扩增MxA凝胶电泳图。图 4 :pcDNA-MxA 质粒图谱。图 5 :pcDNA-appA-MxA 质粒图谱。图6 显微注射AMP基因后胚胎定量检测appA及MxA的表达。图7 :AMP转基因猪PCR检测外源基因。图8 :AMP转基因猪SOUTHERN BLOT检测外源基因。
图9 定量检测appA及MxA的表达。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、转基因胚胎的制备一、重组表达载体的构建实施例1、表达双基因的载体的构建1、单基因表达载体基本构件的获得(1)真核表达载体pcDNA-appA的制备以大肠杆菌DH5 a (购自北京全式金公司， 货号CD201)为模板，以表1中列举的扩增appA的引物扩增植酸酶基因(appA)片段。反应 体系为反应体系为 50ii l，5ii L 10XBuffer,8 u L 2. 5mM dNTPU U L 20 ii M 引物 appA-Ll、 luL 20 ii M弓丨物appA-Rl (弓丨物序列见表1)、0. 5 y L5U/ u L高保真Tag聚合酶，2 yl大肠 杆菌DH5a做模板，加超纯水至50iiL(高保真酶购自大连宝生物，货号DR010A)。PCR扩 增程序98°C 10s,68°C 2min，循环30次。PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测(如图 1所示)。PCR产物用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化(操作步骤见公司试剂盒)，用 Hindlll、EcoR I双酶切纯化产物；同时用Hindlll、EcoR I双酶切pcDNA3. 1 (+)载体(购 自invitrogen公司)；将PCR扩增产物和酶切后的载体连接(连接酶购自promega公司， 货号M1804)；按公司要求操作步骤转化DH5 a (购自北京全式金公司，货号CD201)感受态 大肠杆菌；菌液涂琼脂糖凝胶板，于37°C培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体LB培养 基中培养，部分菌液送公司测序(invitrogen北京公司)；选取测序结果表明含有appA (核 苷酸序列如序列表中序列1的自5’端第1360-2658位所示)的载体，提取质粒备用，将该 测序表明正确的质粒命名为pcDNA-appA(质粒图谱如图2所示)。 (2)真核表达载体pcDNA-MxA的制备 以人cDNA (提取人的离体血液提取总RNA，反转录而来)为模板，以表1中列举的 扩增MxA的引物扩增人粘病毒抗性基因A (MxA)片段。反应体系为反应体系为50ia，5i!L 10 XBuffer,8 u L 2. 5mM dNTPU U L 20 ii M 引物 Mx_Ll、1 ii L 20 ii M 引物 Mx_Rl (序列见表 1)、0. 5 u L5U/ u L高保真Tag聚合酶，lOOng人cDNA为模板，加超纯水至50 y L(高保真酶 购自大连宝生物，货号DR010A)。PCR扩增程序98°C 10s，68°C 2min，，循环30次。PCR扩 增产物用琼脂糖凝胶电泳检测(图3)。
PCR产物用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化(操作步骤见公司试剂盒)，用 Hindlll、EcoR I双酶切纯化产物；同时用Hindlll、EcoR I双酶切pcDNA3. 1 (+)载体(购 自invitrogen公司)；将PCR扩增产物和酶切后的载体连接(连接酶购自promega公司， 货号M1804)；按公司要求操作步骤转化DH5 a (购自北京全式金公司，货号CD201)感受态 大肠杆菌；菌液涂琼脂糖凝胶板，于37°C培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体LB培养 基中培养，部分菌液送公司测序(invitrogen北京公司)；选取测序结果表明含有MxA片段 (核苷酸序列如序列表中序列1的自5’端第3803-5791位所示)的载体，提取质粒备用，将 该测序表明正确的质粒命名为pcDNA-MxA(质粒图谱如图4所示)。2、双基因表达载体AMP构建以上述pCDNA-appA(质粒图谱如图2所示)为模板，以表1所列的引物扩增表1 所列的相应构件。5iiL 10XBuffer,8 u L 2. 5mM dNTPU U L 20 ii M 引物 CMV-appA-Ll、 luL 20 ii M 弓丨物 CMVappA-Rl (序列见表 1)、0. 5 u L5U/ P L 高保真 Tag 聚合酶，lOOng pcDNA-appA质粒，加超纯水至50 P L (高保真酶购自大连宝生物，货号DR010A)。PCR扩增 程序98°C 10s,68°C 3min，循环30次。PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产 物部分测序(invitrogen公司)；表明扩增得到的CMV-appA-BGH pA片段(核苷酸序列如 序列表中序列1的自5'端第618-2977位所示)；CMV-appA_BGH pA片段由依次串连的CMV 启动子、appA和BGH终止子组成；其中CMV启动子(核苷酸序列如序列表中序列1的自5' 端第671-1358位所示)、appA(核苷酸序列如序列表中序列1的自5'端第1360-2658位 所示)和BGH终止子(核苷酸序列如序列表中序列1的5'端第2735-2959位所示)。上述PCR产物CMV-appA-BGH pA片段用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化(操 作步骤见公司试剂盒)，用Mlu I酶切纯化产物；同时用Mlu I单酶切pcDNA-MxA质粒；将 PCR扩增产物和酶切后的载体连接(连接酶购自promega公司，货号M1804)；按公司要求操 作步骤转化DH5ci (购自北京全式金公司，货号CD201)感受态大肠杆菌；菌液涂琼脂糖凝胶 板，于37°C培养箱中培养过夜。挑单菌落接种于液体LB培养基中培养，菌液PCR检测插入片段中CMV-appA-BGH pA片段(扩增体系同上扩增CMV-appA-BGH pA片段部分(引物见表1)，其中模板改为菌液 2微升)，结果有对应的CMV-appA-BGH pA片段扩增条带，将上述两样的部分菌液送公司测 序(invitrogen北京公司)；结果表明获得含有CMV-appA-BGH pA片段和MxA表达盒的重 组表达载体，将该载体命名为pcDNA-appA-MxA，简称为AMP。AMP的质粒图谱如图5所示。测序表明，AMP具有序列表中序列1的核苷酸序列，其序列中含有appA表达盒和 MxA表达盒。其中appA表达盒由依次串联的CMV启动子(核苷酸序列如序列表中序列1的自 5'端第671-1358位所示)、appA(核苷酸序列如序列表中序列1的自5'端第1360-2658位 所示)和BGH终止子(核苷酸序列如序列表中序列1的5'端第2735-2959位所示)组成； MxA表达盒由依次串联的CMV启动子(核苷酸序列如序列表中序列1的5'端第3114-3802 位所示)、MxA(核苷酸序列如序列表中序列1的5'端第3803-5791位所示)和BGH终止 子(核苷酸序列如序列表中序列1的5'端第5868-6092位所示)组成。二、转基因胚胎的制备1、将步骤一得到的 pcDNA-appA-MxA 用 Seal (购自 fermentas 公司，货号 ER0431)
5及Smal (购自fermentas公司，货号ER0661)双酶切后琼脂糖凝胶电泳回收6. 9Kb大小的 条带，稀释成5ng/ia。测序表明，该6. 9Kb大小的条带的核苷酸序列如序列表中序列1所
7J\ o将上述6. 9Kb大小的线性化片段利用显微注射的方法注射到猪的原核期胚胎中， 得到转基因胚胎，在NCSU 23培养基中(购自millipore公司，货号MR-182-D)培养至8细 胞期。2、转基因胚胎检测取其中部分胚胎的基因组DNA直接作为模板，按照ProtoScript M-MuLV TaqRT-PCR试剂盒(购自NEB公司，货号E6400S)操作说明(引物为表1所列举的appA及 MxA的定量PCR检测引物)，直接检测胚胎中appA(引物是表1中的appA-RTLl和appA-RTRl)及 MxA(引物是表 1 中的 hMxl-RTLl 和 hMxl-RTRl)。PCR 反应体 系为 50 u l,5u L10XBuffer,8 u L2. 5mM dNTPU U L20 ii M 上游引物、1 ii L20yM 下游引物、 0. 5 u L5U/ u L高保真Tag聚合酶，加超纯水至50 u L，以获得的小猪基因组DNA为待检测模 板，PCR扩增程序95°C 5min ；94°C 20s，退火温度56°C，72°C lm，循环30次，最后72°C延伸 5min。PCR扩增产物用1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出分别能扩增出appA、MxA基因的， 结果表明，所检测的24个胚胎中，第13和第17号胚胎检测出能同时表达appA基因及MxA 基因(图6)。实施例2、转基因动物的制备一、制备转基因动物按实施例1中方法制备的转基因胚胎，体外发育到8细胞期，然后将在体外通过阴 道子宫颈移植到发情同步的母猪子宫角经过培养得到38个转基因猪。二、转基因猪的整合检测1、PCR 检测利用appA和MxA定量检测引物(见表1)检测转基因猪基因组DNA中相应基因的 整合检测上述转基因猪中外源基因的整合情况。PCR反应体系及扩增体系同实施例1的步骤二的转基因胚胎检测相同，筛选出分 别能扩增出appA和MxA基因的猪(图7)(图中，+ 阳性对照，pcDNA-appA-Mx质粒为模 板；-阴性对照，正常猪DNA为模板；1-23 为不同转基因后代猪扩增条带)。从图7的上图中可见1_23号猪中3、6、11、17、20、22号猪基因组DNA能扩增出 355bp左右的条带，条带和预期扩增的appA条带一致；从图7的下图可见1_23号猪中猪中 3、6、11、17、20、22号猪基因组DNA能扩出325bp条带和预期扩增的MxA条带一致。扩增产 物测序表明扩增出的片段的核苷酸序列均正确。2、southen 杂交检测分别以表1中appA和MxA的定量PCR检测引物为引物，按照试剂盒操作说明书体 系加样；PCR 运行程序如下:95°C 5min，94°C 45S，56°C lmin，72°C lmin，30 个循环后 72°C延 伸10min(探针标记试剂盒购自innogen-cn公司，货号DDLK_010)，得到两个PCR产物。分别以上述两个PCR产物为探针进行southen杂交检测，杂交前在95°C变性5分 钟后立即冰水中放置10分钟备用；大量抽提步骤1中鉴定过的编号为3、6、11、17、20、22 号转基因猪的猪耳组织DNA，用Hindlll及Not I双酶切基因组，浓缩基因组酶切产物至300ng/ul ；于琼脂糖凝胶电泳分离各酶切片段，每孔上样50微升；然后使DNA原位变 性后转移到带正电荷尼龙膜上。按照试剂盒操作说明进行预杂交、杂交及X-光片曝光检测 杂交信号(购自innogen-cn公司，货号DI⑶-210)。检测结果(图8)表明，southern杂 交检测的编号为3、6、11、17、20、22号转基因猪中整合了 appA基因和MxA基因。三、RT-PCR检测分别从步骤二中筛出的编号为3、6、11、17、20、22号转基因猪的猪耳静脉采集100 微升血液，按照天根血液总RNA提取试剂盒(货号DP433)操作说明，提取各组细胞总RNA ； 按照T0Y0B0反转录试剂盒(货号FSK-100)，将提取的总RNA反转录成cDNA.分别以上述的cDNA为模板，用表1中appA和MxA定量PCR检测引物，进行半定量 PCR检测appA和MxA，其中以猪GAPDH基因为内参(引物见表1)，PCR反应体系为50 yl， 5u L10X Buffer,8 u L 2. 5mM dNTPU U L 20 ii M 上游引物、1 ii L 20yM 下游引物(扩增 appA.MxA及猪GAPDH的引物分别见表1)、0. 5 u L5U/ u L高保真Tag聚合酶，lOOng模板，加 超纯水至50ii L。PCR扩增程序95°C5min ；94°C 20s，退火温度 56°C，72°C lm，，最后 72°C延伸 5min， 内参GAPDH扩增时23个循环，其他模板扩增32个循环。PCR扩增产物用1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测(图9)。半定量结果表明，3、20号猪 均能检测到MxA和appA的表达，说明对应的转基因猪能同时表达MxA及appA基因。表1 本发明中用于扩增载体构件的引物表1 本发明中用于扩增载体构件的引物
序列表
<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种制备同时表达多个基因的转基因动物的方法
<160>1
<210>1
<211>6915
<212>DNA
<213>1
<400>1actcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgt60
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1权利要求
一种制备转基因胚胎的方法，是将植酸酶基因和人粘病毒抗性基因A均导入目的胚胎中，得到转基因胚胎。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述植酸酶基因的核苷酸序列如序列表 中序列1的自5’端第1360-2658位；所述人粘病毒抗性基因A的核苷酸序列如序列表中序 列1的自5，端第3803-5791位。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述植酸酶基因和人粘病毒抗性基因A 是通过核苷酸序列如序列表中序列1所示的DNA片段导入胚胎中。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述胚胎为原核期胚胎。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述胚胎为猪、牛、羊、猫、狗、兔 或鼠的胚胎。
6.一种培育转基因动物的方法，是将权利要求1-5中任一所述的方法制备的转基因胚 胎移植到雌性的目的动物的体内，得到能同时表达多个基因的转基因动物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述目的动物为猪、牛、羊、猫、狗、兔或鼠。
全文摘要
本发明公开了一种制备同时表达多个基因的转基因动物的方法。本发明还公开了一种制备转基因胚胎的方法，上述制备转基因胚胎的方法，是将植酸酶基因和人粘病毒抗性基因A均导入目的胚胎中，得到转基因胚胎。将转基因胚胎移植到雌性的目的动物的体内，即可得到表达多个基因的转基因动物。本发明的显著优势表现在一次转基因实现多基因的同时表达，为制备转联合基因动物等提供一种便捷的手段。
文档编号C12N15/85GK101851637SQ201010034318
公开日2010年10月6日 申请日期2010年1月15日 优先权日2010年1月15日
发明者唐中林, 崔文涛, 李奎, 杨述林, 樊俊华, 牟玉莲, 白立景, 鞠辉明 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所