专利名称：：一种培育转基因动物的方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及一种转基因动物的方法。
背景技术：
：植酸(phytate)，又名肌醇六磷酸，是一个含有六个磷酸基团的环状化合物，一种抗营养因子。在ra较大的范围内带负电荷，具有极强的螯合能力，可以与钙、镁、钾、钠、锌、铁、铜、锰等矿物质形成不溶性的植酸盐络合物。在低ra值时还可以与蛋白质分子的碱性基团结合，络合蛋白质，抑制消化酶如胃蛋白酶、淀粉酶、胰蛋白酶的活性。在自然界，禾谷类、兰科类和油料作物中约有18%88%的磷以植酸的形式贮存。单胃动物和人缺少分解植酸的酶而不能利用该种形式的磷，为了满足动物正常的生长、代谢需要，必须在动物的饲料中添加无机磷，这不仅造成了磷源的浪费，而且植酸磷随动物的粪便排出体外造成环境的磷污染。目前实际应用的植酸酶均来源于微生物。由于植酸酶在天然菌株中的产量很低以及酶本身一些性质和酶制剂加工工艺的限制导致植酸酶在工业化生产和应用中出现一系列问题。来源于埃氏大肠杆菌的植酸酶是目前发现的活性最高的植酸酶，比目前应用的曲霉来源植酸酶高出30倍。
发明内容本发明的目的在于提供一种培育转基因胚胎的方法。本发明提供的培育转基因胚胎的方法，是将植酸酶基因导入目的胚胎中，得到转基因胚胎。上述植酸酶基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。上述植酸酶基因是通过重组表达载体导入胚胎中的；所述重组表达载体是将核苷酸序列如序列表中序列l所示的基因插入pcDNA3.1(+)的多克隆位点间得到的重组表达载体。上述胚胎为原核期胚胎。上述胚胎可为除人以外的任何一种动物的胚胎，具体可为猪、牛、羊、猫、狗、兔或鼠的胚胎。本发明的又一目的在于提供一种培育转基因动物的方法。本发明提供的培育转基因动物的方法是将上述培育转基因胚胎的方法获得的转基因胚胎移植到雌性的目的动物的体内，得到磷利用率高于所述目的动物的转基因动物。上述目的动物可为除人以外的任何一种动物，具体可为猪、牛、羊、猫、狗、兔或鼠。实验证明本发明的转基因胚胎能表达即pA基因，本发明培育的转基因动物能检测到植酸酶的活性，具有可以水解植酸及其盐，释放出动物可利用的磷，使提高磷的利用率，降低粪磷含量。本发明将植酸酶基因构建到真核表达载体中，制备出能表达植酸酶的转基因动物，能大大提高动物体内的磷利用效率，可以水解植酸及其盐，释放出动物可利用的磷，使3提高磷的利用率，降低粪磷含量；同时提高钙、锌、铁、锰、镁、铜等无机营养离子以及能量、蛋白质和氨基酸的可利用性，消除植酸的抗营养作用，减少磷在环境中的排泄由此降低了农业负担并减缓水生环境的富营养化同时降低日粮中无机磷添加量(磷作为一种不可再生资源)缓解我国磷资源缺乏。图1为PCR扩增appA产物电泳图，其中左边是扩增的appA产物，右边是marker。图2为pcDNA-即pA质粒图谱。图3为细胞中appA表达水平。图4为细胞中植酸酶活性。图5为胚胎内植酸酶基因表达检测，其中M为marker,1_24为不同的转基因胚胎的植酸酶基因表达检测。图6为即pA转基因鼠PCR检测外源基因。图7为即pA转基因鼠SOUTHERNBLOT检测外源基因。图8为半定量检测appA表达电泳图。图9为粪便中总磷含量比较。图10为粪便中无机磷含量比较。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、转基因胚胎的制备—、目的基因(植酸酶基因(即pA)片段)的克隆以大肠杆菌DH5a(购自北京全式金公司，货号CD201)的基因组DNA为模板，以表1所示的a卯A-Ll(上游引物)和卿A-R1(下游引物)为引物的引导下，进行PCR扩增。反应体系为反应体系为50ii1，5iiL10XBuffer、8iiL2.5mMdNTP、liiL20iiM引物即pA-Ll、liiL20iiM引物即pA-Rl(引物序列见表1)、0.5iiL5U/yL高保真Tag聚合酶，2iil大肠杆菌DH5a的基因组DNA做模板，加超纯水至50yL(高保真Tag酶购自大连宝生物，货号DR010A)。PCR扩增程序:98。C10s，68。C2min，循环30次。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测如图1所示，扩增得到1299bp的片段，经测序表明该片段具有序列表中序列1所示的核苷酸。表1、本发明中使用的引物4<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>二、转基因胚胎的获得1、重组表达载体的获得将上述步骤一中得到的PCR产物用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化(操作步骤见公司试剂盒)，用HindIII、EcoRI双酶切纯化产物；同时用HindIII、EcoRI双酶切pcDNA3.1(+)载体(后简称pcDNA载体)(购自invitrogen公司)；然后将酶切纯化后PCR扩增产物和酶切后的载体用连接酶(连接酶购自promega公司，货号M1804)连接；按公司要求操作步骤转化DH5a(购自北京全式金公司，货号CD201)感受态大肠杆菌；菌液涂琼脂糖凝胶板，于37t:培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体LB培养基中培养，部分菌液送公司测序(invitrogen北京公司)；选取测序结果表明含有即pA(核苷酸序列如序列表中序列1所示)的载体，命名为pcDNA-即pA(质粒图谱如图2所示)。2、获得转基因胚胎将上述步骤二中步骤1得到的pcDNA-即pA质粒用Seal酶切使之线性化，再将线性的pcDNA-即pA基因片段利用传统原核期胚胎显微注射法注射入原核期的小鼠胚胎，得到转基因胚胎。然后在M16培养基中(购自sigma公司，货号M7292)，培养至桑葚胚。取桑葚胚的胚胎直接做模板，按照ProtoScriptM-MuLVTaqRT-PCR试剂盒(购自NEB公司，货号E6400S)的操作说明，直接检测胚胎中即pA的表达(检测即pA引物为表l所示的即pA-RTLl和即pA-RTRl)。检测结果如图5所示，表明所检测的24个胚胎中，第6、10、16号胚胎能表达appA基因。实施例2、转基因小鼠的制备及检测分析—、转基因小鼠的获得1、制备转基因小鼠重复实施例1中得到的转基因胚胎的步骤，在线性的pcDNA-即pA基因片段注射入原核期的小鼠胚胎后，在M16培养基中(购自sigma公司，货号M7292)，培养至2细胞期，用检卵针将胚胎进行输卵管切口移植，将发情同步的假孕雌鼠用846合剂(购自长春军事医学科学院)O.125ml腹腔注射将其麻醉。剪背部毛酒精消毒后，在最后肋骨下方lcm、脊柱左侧0.5cm处剪开皮肤，引出卵巢、输卵管、子宫，找到输卵管膨大部并观察其走向，先用冲胚针头在囊膜无或少血管分布处穿一小洞，再将吸卵管通过囊膜上的小洞轻轻送进输卵管口在膨大部上端2030枚2细胞胚胎吹入适龄代母输卵管中。移植完毕后，将卵巢、输卵管、子宫复位，最后缝合创口。产下56只小鼠。2、阳性转基因小鼠的检测鉴定l)PCR检测将上述步骤1中产下的56只小鼠分别提取基因组DNA，然后以该基因组DNA为模板进行PCR检领"以分析转基因小鼠基因组DNA中相应基因的整合情况。PCR反应体系为50ii1，5iiL10XBuffer、8iiL2.5mMdNTP、liiL20iiMappA-RTLl、liiL20yM即pA-RTL1、0.5yL5U/yL高保真Tag聚合酶，100ng的模板，加超纯水至50iiL。PCR扩增程序95。C5min;94。C20s，退火温度56°C，72°Clmin，循环30次，最后72t:延伸5min。PCR扩增产物用1.6%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图6所示，(图6中，M为marker,+:阳性对照，pcDNA-即pA质粒DNA为模板；-:阴性对照，正常鼠DNA为模板；K为空白未加模板)；1-16:为转基因后代鼠扩增条带)，由图6可知l-16号泳道鼠基因组中能扩增出393bp左右的条带(1-16号泳道依次代表的鼠号是2，4，5，13，17，19，20，22，23，32，35，42，43，47，52，55)，和预期扩增的即pA条带一致；扩增产物送公司测序和序列表中序列1所示的appA序列一致。2)southern杂交检领lj以表1中a卯A定量检测引物即pA-RTLl和即pA-RTRl为引物，以pcDNA-即pA为模板，按照试剂盒(探针标记试剂盒购自i皿ogen-cn公司，货号DDLK-010)操作说明书体系加样；PCR运行程序如下95。C5min，94°C45S，56。Clmin，72。Clmin，30个循环后72。C延伸10min。得到的PCR产物作为探针进行southen杂交检测。杂交前在95t:变性5分钟后立即冰水中放置10分钟备用；大量抽提上述步骤1)验证过的PCR筛出的阳性鼠(鼠号分别是2，4，5，13，17，19，20，22，23，32，35，42，43，47，52,55)小鼠尾组织DNA，用HindIII及NotI双酶切基因组，浓縮基因组酶切产物为300ng/P1;于1%琼脂糖凝胶电泳分离各酶切片段，每孔上样50微升；然后使DNA原位变性后转移到带正电荷尼龙膜上。按照试剂盒操作说明进行预杂交、杂交及x-光片曝光检测杂交信号(购自innogen-cn公司，货号DIGD-210)。检测结果如图7(K为空白未加模板;+:阳性对照，pcDNA-即pA质粒DNA为模板；-:阴性对照，正常鼠DNA为模板)所示，结果表明，PCR检测阳性鼠样，southern杂交检测相应鼠样能检测出相应条带，说明1_16号样品所代表的转基因鼠(H6号泳道依次代表的鼠号是2，4，5，13，17，19，20，22，23，32，35，42，43，47，52，55))均为appA基因整合鼠。3)RT-PCR检测a、cDNA的制备从上述步骤2)鉴定筛出的1-16号阳性转基因小鼠尾部，分别采集100微升血液，按照天根血液总RNA提取试剂盒的(货号DP433)操作说明，提取各组细胞的总RNA;按照T0Y0B0反转录试剂盒(货号FSK-IOO)，将提取的总RNA反转录成cDNA。b、PCR检测以上述步骤a中制备的cDNA为模板，以即pA-RTLl和a卯A-RTRl为引物扩增，同时以小鼠beta-actin基因为内参(表1中引物actin-RTLl和actin-RTRl)，进行半定量PCR测定，PCR反应体系为50iil，5iiL10XBuffer、8iiL2.5mMdNTP、liiL20iiM上游引物、liiL20iiM下游引物、0.5iiL5U/yL高保真Tag聚合酶，lOOng模板，加超纯水至50pL。PCR扩增程序95。C5min;94。C20s，退火温度56°C，72°Clm，最后72。C延伸5min，内参beta-actin扩增时23个循环，其他模板扩增32个循环。PCR扩增产物用1.2X琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图8(k为不含模板的加样体系、M为marker、1-16号泳道依次代表的鼠号是2，4，5，13，17，19，20，22，23，32，35，42，43，47，52，55的不同转基因小鼠)所示，半定量PCR检测结果表明，2，5，7，10，15号泳道样品(依次代表的鼠号为4，17，20，32，52号转基因鼠)能扩增出阳性条带，说明对应的转基因小鼠能表达appA基因。二、转基因小鼠的磷利用率检测将上述步骤一中步骤2的3)检测的能表达即pA基因的5只转基因鼠分为转基因鼠组，另外取5只正常饲养的非转基因鼠为正常鼠组，分别收集两组鼠的粪便，测定粪便中有机磷及总磷含量(方法同，贺淹才，彭益强；《畜禽饲料和粪便的含磷量检测》[D];广东饲料；2001年第8巻第4期)，每组实验重复3次。测定结果表明正常鼠组和转基因鼠组粪便中有机磷占总粪便分别为0.323%，0.242%，两组差异显著(P〈0.05)(如图9所示)；正常鼠组和转基因鼠组粪便中总磷含量分别为1.754%，1.569%，两组差异显著(P<0.05)(如图10所示)。实施例3、即pA在动物细胞中表达的机理研究—、转基因细胞系的建立1、猪PK15细胞系细胞的获得从液氮中取出装有猪PK15细胞(购自中国科学院细胞库)的冻存小管，立即投入37-4(TC的温水中快速晃动，直至冻存液完全融解；在l-2min内完成复温；将细胞悬液移入无菌的离心管，加入5mL培养液，轻轻吹匀；将细胞悬液800-1000r/min离心5min，弃上清；向含有细胞沉淀的离心管加入lmL完全培养基，轻轻吹匀，将细胞悬液转入细胞培养瓶，加入适量的完全培养基进行培养，然后分成两组(转染空pcDNA质粒组及转染pcDNA-即pA组)，每组3个重复。2、获得转基因细胞系将实施例1得到的pcDNA-即pA质粒用Seal大量酶切线性化后，QIAGEN纯化试剂盒胶回收线性化片段，产物终浓度为500ng/ul用于细胞转染。转染的具体步骤为转染前1天，向每孔含10%胎牛血清(购自GIBCO公司，货号21640-079)的500iiLDMEM高糖培养基(购自GIBCO公司，货号12100_046)的24孔板中分别接种0.5-2X105个猪PK15细胞，使细胞在转染前达到90-95%的汇合；用50yL的无血清、无抗生素的培养基分别稀释0.8g待转染DNA(其中，转染空pcDNA质粒组使用Seal线性化的pcDNA，转染pcDNA-即pA组使用Seal线性化的pcDNA-即pA质粒)，并温和地混匀；使用前将脂质体温和摇匀，将2iiLlipefectaminTM-2000加入50iiL的无血清、无抗生素的DMEM培养基(购自GIBCO公司，货号12100-046)并轻轻混匀，于室温孵育5min;5min后，分别将50L的各组DNA稀释液加入50yL的脂质体稀释液，轻轻混匀并于室温放置20min;将100yL的DNA脂质体混合物加入到准备好的孔内，轻轻来回晃动培养板，将其置于37°C、饱和湿度、5%C02的培养箱中培养，于4-6h后用完全培养基代替转染培养基，在后代培养中，于细胞培养液中加入G418(购自Gibco，货号11811-023)，筛选两周。分别得到转染空pcDNA质粒和转染pcDNA-即pA质粒的转基因细胞系。二、检测分析1、即pA表达水平检测l)cDNA的制备按照试剂盒(购自北京天跟公司，货号DP430)操作说明，提取上述转染空pcDNA质粒组及转染pcDNA-即pA组细胞的总RNA;按照T0Y0B0反转录试剂盒(购自T0Y0B0公司，货号FSK-IOO)，将提取的总RNA分别反转录成cDNA。2)荧光定量PCR检测以上述步骤l)中制备的cDNA为模板，以猪GAPDH基因为内参(如表l所示，引物为mGAPDH-Ll和mGAPDH-Rl)，进行荧光定量PCR测定appA(a卯A引物为表1所示的即pA-RTLl和即pA-RTRl)表达量，上样体系按照ABI定量试剂说明书上样，反应体系为20ii1，10iiL2XMixturer(TAKARA，货号DRR041A)、1iiL20iiM上游引物、1PL20iiM下游引物、l微升cDNA，加超纯水至20iiL。PCR扩增程序95。C5min;94。C20s，退火温度56°C，72°Clm，循环40次，最后72。C延伸5min。荧光定量检测结果如图3所示，进行即pA表达水平检测时，以转染空pcDNA质粒对照组为基准，转pcDNA-即pA组合的表达水平分别是对照组的32.27倍。(图3中纵坐标是定量PCR仪显示的格式，以logl。值为单位，各组的值为每组目的基因的表达水平和内参的表达水平的比值。以对照组细胞相应基因表达为参照基数o，其余各组表达水平值为对照组相应基因表达的倍数)。2、植酸酶活性的测定收集上述步骤一中步骤2得到的转染空pcDNA质粒组和转染pcDNA-即pA质粒组细胞，利用反复冻融法破碎细胞，离心、收集细胞上清即为酶粗提液，粗酶液经5倍稀释后，测定稀释液中的细胞植酸酶活性。植酸酶活性的测定采用钼酸铵显色法，参照程海娜等(程海娜；《黑曲霉植酸酶菌株选育及其酶的分离纯化和性质研究》[D];湖南师范大学；2003年)方法进行。实验3次重复，对照组(即转染空pcDNA质粒组)的lml稀释液中细胞植酸酶活力分别为0.082单位、0.075单位及0.088单位，转染pcDNA-即pA质粒组的lml稀释液中细胞植酸酶活力分别为0.239单位、0.221单位及0.244单位。如图4所示，实验组植酸酶活性是对照组平均2.88倍。1个单位的植酸酶活指lmin内从植酸钠中分解出其lpmol的无机磷。序列表〈110〉中国农业科学院北京畜牧兽医研究所8〈120〉一种培育转基因动物的方法〈160>1〈210>1〈211>1299〈212>DNA〈213>±矣氏大肠杆菌(Escherichiacoli)〈400〉1tctteatcccatttttetctcttctgattccgtteaccccgcaatctgca60ttcgctcagagtgagccggagctg皿gctgg腿gtgtggtgattgtcagtcgtcatggt120gtgcgtgctcc皿cc皿ggccacgcaactgtcaccccagacgcatggcca180acctggccggtea皿ctgggttggctgacaccgcgcggtggtgagcteatcgcctetctc240ggacattecc皿cgccagcgtctggtegccg3Cgg3ttgCgggctgcccg300cagtctggtc郷tcgcgattettgctgatgtcgacgagcgtecccgtea皿C3ggCg皿360gccttcgccgccgggctggcacctgactgtgc皿teaccgtecatecccaggcagatecg420tccagtcccgatccgttettteatcctcte皿皿ctggcgtttgccaactggateacgcg■皿cgtgactgacgcgatcctC3gC3gggC3gg郷gt咖ttgctgacttteccgggcat540CggC皿3Cggcgtttcgcgaactgg皿cgggtgctteattttccgcaatcaaacttgtgc600ctteaacgtgcga皿gctgttcatteacgcaggcatteccatcggaactc660皿ggtgagcgccgacaatgtctcatteaccggtgcggt皿gcctcgcatc皿tgctgacg720aagatetttctcctgcaaca3gC3C3ggg3atgccggagccggggtgggg皿gg3tC3CC780gattcacacc3gtgg皿C3Ccttgcteagtttgcateacgcgcaattttetttgttecaa840cgcacgccagaggttgcccgcagccgcgccaccccgttettegatttgatC皿g3C3gCg■ttgacgccccatccaccgca皿皿C3ggCgtetggtgtgacattecccacttcagtgctg960tttetcgccgg3cacgatectaatctggca皿tctcggcggcgractggagctc皿ctgg1020acgcttcccggtcagccgg3taacacgccgcc郷tggtg雄tggtgtttg雄gctgg1080cgtcggcteaccagtggattcaggtttcgctggtcttccagactttecag1140c卿tgcgtgate皿3cgccgctgtcatteaatecgccgcccgg卿ggtg皿actgacc1200ctggc郷atgtga卿gcg朋3tgCgC3gggcatgtgttcgttggcaggttttecgc朋1260atcgtg朋tgaccggcgtgcagtttgtea1299权利要求一种培育转基因胚胎的方法，是将植酸酶基因导入目的胚胎中，得到转基因胚胎。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述植酸酶基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述植酸酶基因是通过重组表达载体导入胚胎中的；所述重组表达载体是将核苷酸序列如序列表中序列1所示的基因插入pcDNA3.1(+)的多克隆位点间得到的重组表达载体。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述胚胎为原核期胚胎。5.根据权利要求l-4中任一所述的方法，其特征在于所述胚胎为猪、牛、羊、猫、狗、兔或鼠的胚胎。6.—种培育转基因动物的方法，是将权利要求1-5中任一所述的方法制备的转基因胚胎移植到雌性的目的动物的体内，得到磷利用率高于所述目的动物的转基因动物。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述目的动物为猪、牛、羊、猫、狗、兔或鼠。全文摘要本发明的目的在于提供一种培育转基因动物的方法。本发明还提供一种培育转基因胚胎的方法，该培育转基因胚胎的方法，是将植酸酶基因导入目的胚胎中，得到转基因胚胎。将上述的转基因胚胎移植到假孕雌性动物的体内，得到转基因动物。本发明的转基因胚胎能表达appA基因，本发明培育的转基因动物能表达植酸酶的活性，具有可以水解植酸及其盐，释放出动物可利用的磷，使提高磷的利用率，降低粪磷含量。文档编号C12N5/10GK101775370SQ20101003420公开日2010年7月14日申请日期2010年1月13日优先权日2010年1月13日发明者唐中林,崔文涛,李奎,杨述林,牟玉莲,白立景,鞠辉明申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所