专利名称：一种删除转基因动物中标记基因的方法及其专用序列盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及动物基因工程领域，特别涉及一种删除转基因动物中标记基因的方法 及其专用序列盒。
背景技术：
标记基因是帮助对转基因生物体进行筛选和鉴定的一类外源基因，虽然它们仅在 动植物筛选的早期阶段发挥作用，但如不剔除，会存留在成熟的转基因生物中，其安全性研 究不容忽视。标记基因的安全性主要考虑以下几点①转基因动物食品中的标记基因有无 直接毒性。任何基因都由4种碱基组成，人类食用的食品中大都含有DNA。长期的食用证 明，食品中的DNA及其降解产物对人体无毒害作用。目前转基因动物食品中所使用的标记 基因，其组成与普通DNA并无差异，因此，WH0(WH0，1991)及FDA(FDA，1994)认为转基因DNA 本身不会对人体产生直接毒害作用。②标记基因的水平转移问题。转基因动物中的外源基 因被摄入人体后，能否水平转移至肠道微生物或上皮细胞，从而对人体产生不利影响。特别 是抗生素标记基因是否会转移，从而降低抗生素在临床上的有效性(WHO，1994)。③标记基 因的表达产物是否会有直接或间接的毒害作用。位点特异性重组是在双链DNA片段之间发生的相互遗传交换，链的交换是通过对 DNA特定序列进行准确切割和连接，从而在基因和染色体水平实现对生物的遗传改造。相对 于共转化和转座子来说，位点特异性重组酶删除外源基因法是目前应用得最为广泛，删除 效率相对较高的技术(罗克明等.2005.高技术通讯，7. 15(7) 61)。根据序列相似性，重组酶家族可分为Int家族和解离酶-转化酶家族(王 鹰.2006.第三军医大学.博士论文)。来源于酪氨酸重组酶家族的位点特异性重组酶具有 高度同源性，目前研究比较明确的主要有大肠杆菌噬菌体Pl编码的Cre重组酶和酿酒酵母 FLP 重组酶(Belteki G. et al. 2003. Nat Biotechnol. 21(3) :321 324)、λ 噬菌体整合 酶、细菌 XerC 和 XerD 重组酶(Awatramani R. et al. 2003. Nat Genet. 35(1) :70 75)。λ 整合酶的attP位点长约240bp，包含整合宿主因子(大肠杆菌DNA结蛋白)和整合酶蛋白 “臂区”结合位点(Yang Y. et al. 2003. Nat Biotechnol. 21(4) :447 451)。Cre 重组酶是 一种较简单的酪氨酸重组酶，来源于Pl噬菌体Cre基因，属于Int酶超基因家族，其特异性 识别位点称为ΙοχΡ，仅长34bp，Cre重组酶识别DNA分子上的IoxP位点而发生重组，重组的 程度与重组酶的表达水平有关，在反应的任何阶段均不需要任何蛋白或能量等辅助因子参 与，其特异性和高效性使Cre/loxP系统在基因工程中运用十分广泛(Arin MJ, et al. 2001. J Cell Biol. 152(5) :645 649 ；Gong S et al. 2003. Nature. 425(7) :917 925)。FLP/ FRT和R/RS系统分别发现于酿酒酵母2 μ环质粒和酿酒酵母pSRl质粒。FLP为2 μ环质 粒编码的位点特异性重组酶，分子量34kDa，其识别位点是FRT (FLP recognitiontarget)， 有功能的最小FRT为一段34bp的DNA序列，结构与IoxP相似，所不同的是野生型FRT在 34bp的DNA序列侧翼还有一个13bp的反向重复序列，该序列可增强FLP介导的重组反应， 在体外它可影响重组过程中的切口形成和链交换。
位点特异性重组系统最大的特点是该系统很简单。第一，活化特异性重组酶不需 要辅助因子；第二，特异性位点仅31 34bp，容易合成；第三，重组过程无额外能量需求，重 组过程所需的能量由磷酸化酪氨酸中间体提供；第四，重组酶均为比较稳定的蛋白；第五， 可以很容易的合成一段DNA片段，该片段含有特异性的启动子来启动重组酶的表达，从而 使重组能定位、定时的发生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种序列盒。该序列盒可用于删除转基因动物中的标记基 因。本发明提供的序列盒，是将如下1)或2)插入序列表中序列1所示核苷酸片段的 多克隆位点中得到的DNA片段1)标记基因；2)标记基因表达盒所述标记基因表达盒由启动子、标记基因和终止子组成，所述多克隆位点的核苷酸序列如序列1的自5’端第79-143位所示。上述标记基因可以是EGFP、Ne0myCin或其他荧光蛋白基因(如红色荧光蛋白基因 RFP、黄色荧光蛋白基因YFP等)、其他抗生素抗性基因(如潮霉素抗性基因Hyg)。在一实施例中，上述序列盒可以是在序列1所示核苷酸片段的多克隆位点间上游 至下游依次插入CMV、EGFP, IRES和Neomycin-polyA构成的DNA片段A ；EGFP的核苷酸序 列如序列表中序列3所示；Neomycin-polyA的核苷酸序列如序列表中序列5所示；CMV的核 苷酸序列如序列表中序列2所示；IRES的核苷酸序列如序列表中序列4所示。在另一实施例中，上述序列盒可以是在序列1所示核苷酸片段的多克隆位点 间上游至下游依次插入CMV、EGFP-poIyA, CMV，和Neomycin-polyA构成的DNA片段B ； EGFP-poIyA的核苷酸序列如序列表中序列6所示；Neomycin-polyA的核苷酸序列如序列表 中序列5所示；CMV的核苷酸序列如序列表中序列2所示；CMV，的核苷酸序列如序列表中序 列7所示。本发明的另一目的在于提供一种用于删除转基因动物中的标记基因的重组表达 载体。本发明提供的用于删除转基因动物中的标记基因的重组表达载体，是含有任一所 述的序列盒的能转化动物细胞的重组表达载体。在一实施例中，所述重组表达载体是将上述的序列盒(DNA片段A)与所述 pMD18-TSimple连接得到的。在另一实施例中，所述重组表达载体是将上述的序列盒(DNA片段B)与所述 PMD18-T Simple连接得到的。含有任一所述的重组表达载体的转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范 围之内。任一所述的序列盒在删除转基因动物中的标记基因中的应用也属于本发明的保 护范围之内。任一所述的序列盒在基因打靶载体构建中的应用也属于本发明的保护范围之 内。任一所述的重组表达载体在删除转基因动物中的标记基因中的应用也属于本发明的保护范围之内。 本发明在筛选标记基因neo和GFP的两端添加了重组酶融合识别位点LoxP-FRT， 旨在筛选标记基因发挥完作用之后利用FLP重组酶将它们删除。实验证明pCF载体、 pCF-pA载体分别转染PK15细胞系，通过G418筛选获得相应的单克隆细胞系，在此基础上二 次转染表达重组酶FLP的质粒pOG44，使用相对定量PCR检测标记基因表达和流式细胞技术 检测标记基因的删除效率。应用相对定量PCR反应验证质粒pOG44转染前后标记基因在表 达量上的变化，结果表明质粒P0G44转染后标记基因的表达量显著下降(P <0.05)。流式 细胞仪检测PCF质粒、pCF-pA质粒删除效率分别为23. 59%、28. 16%。结果表明该FLP重 组酶可有效删除选择标记基因。
图1 标记基因表达载体结构示意图，其中A、B分别代表质粒pCF、质粒pCF_pA。图2 =FLP重组酶处理前后绿色荧光蛋白表达变化(荧光显微镜下拍照)，其中A、 B分别代表FLP重组酶处理前pCF质粒转染组及其阴性对照组细胞绿色荧光蛋白表达情况， C、D分别代表FLP重组酶处理前pCF-pA质粒转染组及其阴性对照组细胞绿色荧光蛋白表 达情况，E、F分别代表FLP重组酶处理后pCF质粒转染组细胞及其阴性对照组细胞绿色荧 光蛋白表达情况，G、H分别代表FLP重组酶处理后pCF-pA质粒转染组细胞及其阴性对照组 细胞绿色荧光蛋白表达情况。图3 荧光定量PCR检测FLP重组酶处理前后标记基因表达量相对变化，其中A、C 分别代表FLP重组酶处理前pCF-pA、pCF质粒转染细胞标记基因相对表达量，B、D代表FLP 重组酶处理后pCF-pA、pCF质粒转染细胞标记基因相对表达量。图4 流式细胞仪检测FLP重组酶处理前后绿色荧光蛋白表达变化，其中A、B分别 代表FLP重组酶处理前后pCF质粒转染组细胞绿色荧光蛋白表达情况，C、D代表FLP重组 酶处理前后PCF-pA质粒转染组细胞绿色荧光蛋白表达情况。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、用于删除转基因动物中的标记基因的重组载体的构建一、含有序列1所示的核苷酸的重组质粒pMD-CreFLP的构建1、Cre和FLP重组酶融合识别位点合成合成下面两段核苷酸序列第一段序列5 ’ -ACGCGTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACCGAAGTTCCTATACTCTAGAAAC TATAGGAACTTCAGATCTGTCACACTTAAGGAATTCGCTCAGATATCGGATCC-3’第二段序列5 ’ -CGCGGGCTAGCCCGGGATTCCGGAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACCGAAG TTCCTATACTCTAGAAACTATAGGAACTTCAGCGCT-3'2、将上述两段单链分别退火形成双链DNA具体步骤如下①将合成的寡核苷酸干粉短暂离心；②离心后的寡核苷酸用超纯
5水稀释至终浓度IOOpmol/ μ 1 ；③按表1 (以第一段序列为例)配置20 μ 1退火反应体系；表1双链DNA退火反应
权利要求
一种序列盒，是将如下1)或2)插入序列表中序列1所示核苷酸片段的多克隆位点中得到的DNA片段1)标记基因；2)标记基因表达盒所述标记基因表达盒由启动子、标记基因和终止子组成，所述多克隆位点的核苷酸序列如序列1的自5’端第79 143位所示。
2.根据权利要求1所述的序列盒，其特征在于所述标记基因是EGFP、Neomycin或红 色荧光蛋白基因RFP、黄色荧光蛋白基因YFP或潮霉素抗性基因Hyg。
3.根据权利要求2所述的序列盒，其特征在于所述序列盒是在序列1所示核苷酸片 段的多克隆位点间从上游至下游依次插入CMV、EGFP, IRES和Neomycin-polyA构成的DNA 片段；EGFP的核苷酸序列如序列表中序列3所示；Neomycin-polyA的核苷酸序列如序列表 中序列5所示；CMV的核苷酸序列如序列表中序列2所示；IRES的核苷酸序列如序列表中序 列4所示。
4.根据权利要求2所述的序列盒，其特征在于所述序列盒是在序列1所示核苷酸片 段的多克隆位点间从上游至下游依次插入CMV、EGFP-poIyA, CMV’和Neomycin-polyA构成 的DNA片段；EGFP-polyA的核苷酸序列如序列表中序列6所示；Neomycin-polyA的核苷酸 序列如序列表中序列5所示；CMV的核苷酸序列如序列表中序列2所示；CMV’的核苷酸序列 如序列表中序列7所示。
5.一种用于删除转基因动物中的标记基因的重组表达载体，是含有权利要求1-4任一 所述的序列盒的能转化动物细胞的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是将权利要 求3所述的序列盒与所述pMDIS-T Simple连接得到的。
7.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是将权利要 求4所述的序列盒与所述pMDIS-T Simple连接得到的。
8.含有权利要求5-7任一所述的重组表达载体的转基因细胞系或重组菌。
9.权利要求1-4任一所述的序列盒在删除转基因动物中的标记基因中的应用或者在 基因打靶载体构建中的应用。
10.权利要求5-7任一所述的重组表达载体在删除转基因动物中的标记基因中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种删除转基因动物中标记基因的方法及其专用序列盒。该序列盒是是将如下1)或2)的基因插入序列表中序列1的多克隆位点中得到的DNA片段1)标记基因；2)标记基因表达盒所述标记基因表达盒由启动子、标记基因和终止子组成。将该序列盒插入骨架载体构成的重组载体pCF和pCF-pA转染PK15细胞系，通过G418筛选获得相应的单克隆细胞系，在此基础上二次转染表达重组酶FLP的质粒pOG44，结果表明质粒pOG44转染后标记基因的表达量显著下降(P＜0.05)。流式细胞仪检测pCF质粒、pCF-pA质粒删除效率分别为23.59％、28.16％。结果表明该FLP重组酶删除系统可有效删除标记基因。
文档编号C12N1/15GK101935652SQ201010033989
公开日2011年1月5日 申请日期2010年1月12日 优先权日2010年1月12日
发明者崔文涛, 李和刚, 李奎, 杨述林, 汪亮 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所