专利名称：：一种生产猪生长激素的方法及其专用dna片段的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及一种生产猪生长激素的方法及其专用DNA片段。
背景技术：
：真核生物基因的一个基本特征是它们被一个或多个内含子所间隔，这些间隔DNA在转录后被除去以形成具有完整读码框的mRNA，这一过程叫做内含子的剪接。内含子如何进化，有什么生物学作用，都是近代生物学急需解决的问题。内含子一度被认为是无确定性质的序列，是基因组的垃圾，但越来越多的研究者逐渐认识到内含子有重要的生物学功能。根据剪接机制的不同，可将内含子分为3类真核mRNA内含子、自我剪接内含子和真核tRNA内含子。真核mRNA内含子最初被认可的功能主要有2种，一是通过外显子的复制和移动简化新基因的进化历程；二是通过可变剪接由单基因表达多种蛋白，丰富了蛋白的多样性。随着分子生物学的发展，人们发现真核mRNA内含子对基因表达的调控不只发生在前体RNA的剪接阶段，而是与转录、RNA编辑、mRNA的出核运输、mRNA翻译和无义衰变等过程形成一个网络，共同调控基因表达。虽然一些基因本身并不含有内含子，或是表达并不需要内含子的参与，通过对不同生物正向同源基因内含子-外显子的比较分析，发现内含子变异性超过外显子，但在许多情况下，真核mRNA内含子的存在都可以大大提高转基因生物的基因表达，真核mRNA内含子已成为提高转基因生物外源基因表达的重要元件之一。猪生长激素(porcinegrowthhormone,pGH)是猪垂体前叶分泌的长为190个氨基酸的单链多肽类激素，其基因组由四个内含子(第1、第2、第3和第4内含子)和5个外显子组成，它能加速蛋白质的合成和脂类的代谢，因而具有较高的商业价值和科研价值，我们发现不同内含子对生长激素基因的表达有很大的差异。
发明内容本发明的目的在于提供一个DNA片段。本发明提供的DNA片段，是如下1)或2):1)其核苷酸序列如序列表中序列3的自5'端6-1108位所示；2)其核苷酸序列如序列表中序列3所示。上述1)的DNA片是含第1和第2内含子的GH基因。含有上述DNA片段的重组载体也属于本发明的保护范围之内。具体地，上述重组载体是将上述的DNA片段插入pcDNA3.1(+)的多克隆位点构成的重组表达载体。含有上述DNA片段的转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。上述转基因细胞是将上述DNA片段导入真核细胞中构成的转基因细胞。进一步，上述述DNA片段是通过上述的重组载体导入所述真核细胞中的。上述真核细胞可以是猪PK15细胞。含有上述DNA片段的表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围之内。本发明的又一目的在于提供上述DNA片段、上述的重组载体或者上述的转基因细胞在生产猪生长激素中的应用。实验证明pcDNA-GH12组的GH表达量是转pcDNA质粒对照组的16410倍；pcDNA-GH12组的GH与内参beta-actin比值为0.278，显著高于正常对照组(转pcDNA空载体组)的0.016。说明含有第1，2内含子的情况下，GH的表达量更高。图1:PCR扩增GHcDNA产物电泳图，M是marker,1是GHcDNA。图2:PCR扩增GHgenomics产物电泳图，M是marker,1是GHgenomics。图3:含不同内含子pcDNA-GH质粒示意图谱。图4:不同生长激素的真核表达载体示构建示意图。图5:实时荧光定量PCR测定各组细胞中GH表达水平。图6:各组细胞GH及内参beta-actinwesternblot检测结果。图7:各组细胞GH蛋白表达的差异(灰度比值)。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。本发明依赖的遗传资源是猪(Susscrofa)(大白猪品系，购自唐山市新基源种猪有限公司)，由于是购买，所以其原始来源不清楚。实施例1含不同内含子GH的真核表达载体的构建1、真核表达载体pcDNA-GHcDNA的制备以猪(Susscrofa)(大白猪品系，购自唐山市新基源种猪有限公司)cDNA(以猪血液提取的总RNA反转录而来)为模板，以表1中列举的扩增GH的引物扩增猪GHcDNA片段(GENBANK号为M22761的自5'端第125-775位核苷酸序列)。反应体系为反应体系为50iil，5iiL10XBuffer、8iiL2.5mMdNTP、liiL20iiM引物GHcDNA-Ll、1iiL20yM弓l物GH-R1(引物序列见表1)、0.5iiL5U/yL高保真Tag聚合酶，2y1大肠杆菌DH5a做模板，加超纯水至50iiL(高保真酶购自大连宝生物，货号DR010A)。PCR扩增程序98°C10s，68°C2min，循环30次。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测(如图l所示)。PCR产物用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化(操作步骤见公司试剂盒)，用HindlII、XbaI双酶切纯化产物；同时用HindlII、XbaI双酶切pcDNA3.1(+)载体(购自invitrogen公司)；将PCR扩增产物和酶切后的载体连接(连接酶购自promega公司，货号M1804);按公司要求操作步骤转化DH5a(购自北京全式金公司，货号CD201)感受态大肠杆菌；菌液涂琼脂糖凝胶板，于37t:培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体LB培养基中培养，部分菌液送公司测序(invitrogen北京公司)；选取测序结果表明含有GHcDNA(其核苷酸序列如序列表中序列l所示)的载体，提取质粒备用，将该测序表明正确的质粒命名为pcDNA-GHcDNA。其中，序列1有657个碱基，序列1的自5'端第6位至656位的核苷酸序列与GENBANK号为M22761的自5'端第125-775位相同。表1:本发明中用于扩增载体构件的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注表中带*的序列中斜体字部分为kozak序列。[OO37]2、真核表达载体pcDNA-GHgenomics的制备以猪(Susscrofa)(大白猪品系，购自唐山市新基源种猪有限公司)基因组DNA(以提取的大白猪血液基因组而来)为模板，以表l中列举的扩增GHgenomics的引物扩增猪GH基因组DNA片段(GENBANK号为M17704的自5'端第240-1817位核苷酸序列)。反应体系为反应体系为50ii1，5iiL10XBuffer、8iiL2.5mMdNTP、liiL20yM弓l物GHgenomic-Ll、1iiL20iiM引物GH-R1(序列见表1)、0.5iiL5U/iiL高保真Tag聚合酶，100ng人cDNA为模板，加超纯水至50yL(高保真酶购自大连宝生物，货号DR010A)。PCR扩增程序98°C10s，68°C2min，循环30次。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测(图2)。PCR产物用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化(操作步骤见公司试剂盒)，用HindlII、XbaI双酶切纯化产物；同时用HindlII、XbaI双酶切pcDNA3.1(+)载体(购自invitrogen公司)；将PCR扩增产物和酶切后的载体连接(连接酶购自promega公司，货号M1804);按公司要求操作步骤转化DH5a(购自北京全式金公司，货号CD201)感受态大肠杆菌；菌液涂琼脂糖凝胶板，于37t:培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体LB培养基中培养，部分菌液送公司测序(invitrogen北京公司)；选取测序结果表明含有核苷酸序列如序列表中序列2所示的片段的载体，提取质粒备用，将该测序表明正确的质粒命名为pcDNA-GHgenomics。其中，序歹lj2有1590个碱基，自5'端第6位至1583位为GENBANK号为M17704的自5'端第240-1817位核苷酸序列。3、含不同其他内含子GH真核表达载体的构建(不同GH真核载体构建示意图谱见图3)如示意图(图4)中描述，将步骤1得到的pcDNA-GHcDNA载体用PfoI(购自Fermentas公司，货号ER1751)酶切，切得片段大小分别为3495bp(片段1)+2516bp(片段2);用NarI(购自NEB公司，货号R0191S)酶切，切得片段大小分别为4159bp(片段3)+1852bp(片段4);用TthlllI(购自NEB公司，货号R0185S)酶切，切得片段大小分别为4364bp(片段5)+1647bp(片段6)，酶切产物用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化(操作步骤见公司试剂盒)。将步骤2得到的pcDNA-GHgenomics载体用PfoI(购自Fermentas公司，货号ER1751)酶切，切得片段大小分别为3949bp(片段一)+2985bp(片段二)；用NarI(购自NEB公司，货号R0191S)酶切，切得片段大小分别为4400bp(片段三)+2534bp(片段四)；用Tthllll(购自NEB公司，货号R0185S)酶切，切得片段大小分别为5009bp(片段五)+1925bp(片段六)，酶切产物用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化(操作步骤见公司试剂盒)。将上述的片段1和片段二连接得到pcDNA-GH34(目的基因为含第3、第4内含子的生长激素基因)，片段2和片段一连接得到pcDNA-GH12(目的基因为含第1、第2内含子的生长激素基因)；片段4和片段三连接得到pcDNA-GH1(目的基因为含第1内含子的生长激素基因)；将上述的片段5和片段六连接得到pcDNA-GH4(目的基因为含第4内含子的生长激素基因)，片段6和片段五连接得到pcDNA-GH123(目的基因为含第1、第2和第3内含子的生长激素基因)；pcDNA-GH34Tthllll(购自NEB公司，货号R0185S)酶切，切得片段大小分别为4562bp(片段七)+1925bp(片段六)，片段七和片段6连接得到pcDNA-GH3(目的基因为含第3内含子的生长激素基因)；pcDNA-GH12NarI(购自NEB公司，货号R0191S)酶切，切得片段大小分别为4400bp(片段三)+2059bp(片段八)，片段八和片段3连接得到pcDNA-GH2(目的基因为含第2内含子的生长激素基因)。具体组合方式如表2所示。表2.不同其他内含子GH真核表达载体的构建<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>将上述连接产物(连接酶购自promega公司，货号M1804);按公司要求操作步骤转化DH5a(购自北京全式金公司，货号CD201)感受态大肠杆菌；菌液涂琼脂糖凝胶板，于37t:培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体LB培养基中培养，部分菌液送公司测序(invitrogen北京公司)；选取测序结果正确的载体，大量提取质粒备用。其中，pcDNA-GH12中存在一个DNA片段(GH12)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。序列表中序列3的自5'端第6-1108位为含第1和第2内含子的GH基因。实施例2、本发明的含不同内含子生长激素真核表达载体的细胞水平表达检验1、冻存细胞的复苏与培养pcDNA-GHcDNA、pcDNA-GHge體ics、pcDNA-GHl、pcDNA-GH2、pcDNA-GH3、pcDNA-GH4、pcDNA-GH12、pcDNA-GH34及pcDNA-GH123质粒用Seal大量酶切线性化后，QIAGEN纯化试剂盒胶回收线性化片段，产物终浓度为500ng/ul用于细胞转染。从液氮中取出装有猪PK15细胞(购自中国科学院细胞库)的冻存小管，立即投入37-4(TC的温水中快速晃动，直至冻存液完全融解；在l-2min内完成复温；将细胞悬液移入无菌的离心管，加入5mL培养液，轻轻吹匀；将细胞悬液800-1000r/min离心5min，弃上清；向含有细胞沉淀的离心管加入lmLDMEM高糖培养基(购自GIBC0公司，货号12100-046)，轻轻吹匀，将细胞悬液转入细胞培养瓶，加入适量的完全培养基进行培养。2、细胞转染与筛选将猪PK15细胞系细胞(购自中国科学院细胞库)分为12组分别是正常饲养组、仅加脂质体lipefectaminTM-2000组、转pcDNA对照组(pcDNA3.1(+))、pcDNA-GHcDNA、pcDNA-GHge體ics、pcDNA-GHl、pcDNA-GH2、pcDNA-GH3、pcDNA-GH4、pcDNA-GH12、pcDNA-GH34及pcDNA_GH123质粒。每组3个重复。转染前1天，向每孔含10%胎牛血清(购自GIBC0公司，货号21640-079)的500iiLDMEM高糖培养基(购自GIBC0公司，货号12100-046)的24孔板中分别接种0.5-2X105个猪PK15细胞，使细胞在转染前达到90-95%的汇合；用50yL的不加血清的DMEM高糖培养基(购自GIBC0公司，货号12100-046)分别稀释0.8yg步骤1中的待转染各组DNA，并温和的混匀；使用前将脂质体温和摇匀，将2iiLlipefectaminTM-2000加入50iiL的无血清、无抗生素的DMEM培养基(购自GIBC0公司，货号12100-046)并轻轻混匀，于室温孵育5min;5min后，分别将50yL的各组DNA稀释液加入50yL的脂质体稀释液，轻轻混匀并于室温放置20min;将100yL的DNA脂质体混合物加入到准备好的孔内，轻轻来回晃动培养板，将其置于37°C、饱和湿度、5%C02的培养箱中培养，于4-6h后用含10%血清(购自GIBC0公司，货号21640-079)的DMEM高糖培养基继续培养，在后代培养中，于细胞培养液中加入1微克/毫升浓度G418(购自Gibco，货号11811-023)，筛选三周。各组细7胞分为三培养瓶，一瓶冻存、一瓶用于总RNA的提取，一瓶用于提取蛋白进行westernblot检测。3、各转染细胞组生长激素表达量鉴定1)细胞总RNA提取及cDNA的制备按照试剂盒(购自北京天跟公司，货号DP430)操作说明，提取上述各组细胞总RNA;按照T0Y0B0反转录试剂盒(购自T0Y0B0公司，货号FSK-IOO)，将提取的总RNA反转录成cDNA。2)荧光定量PCR检测以1)中制备的cDNA为模板，梯度稀释模板验证选定最佳模板浓度，以猪GAPDH基因为内参(引物为mGAPDH-Ll和mGAPDH-Rl)，进行实时荧光定量PCR测定GH(GH引物为表1所示的pGH-RTLl和pGH-RTRl)表达量，上样体系按照ABI定量试剂说明书上样，反应体系为20ii1，10iiL2XMixturer(TAKARA，货号DRR041A)、liiL20iiM上游引物、liiL20iiM下游引物、1微升cDNA，加超纯水至20iiL。PCR扩增程序95。C5min;94。C20s，退火温度56。C，72。Clm，循环40次，最后72。C延伸5min。荧光定量检测结果如图5所示，各测定组中，以转pcDNA质粒对照组为基准，正常饲养组细胞GH(图5中的2000)表达量是其0.804倍，仅加脂质体1ipefectaminTM-2000组(图5中的PK15)是其21.846倍，pcDNA-GHcDNA组(图5中的GH-CDNA)是其13780倍、pcDNA-GHgenomics组(图5中的GHgenomics)是其3845倍，pcDNA-GHl组(图5中的GH-1)是其5736倍、pcDNA-GH2组(图5中的GH-2)是其6721倍，pcDNA-GH3组(图5中的GH-3)是其3886倍、pcDNA-GH4组(图5中的GH-4)是其3178倍，pcDNA-GH12组(图5中的GH-12)是其16410倍，pcDNA-GH34组(图5中的GH-34)是其10240倍，pcDNA-GH123组(图5中的GH-123)是其4863倍，各组间相差极显著(p<0.01)。4、各转染细胞组GH蛋白差异1)各细胞组蛋白提取弃掉培养板中的细胞培养液，用冰预冷PBS(购自北京索莱宝公司，货号P8400)洗涤细胞一次，吸去PBS。每孔加入2mlPBS，用刮子将贴壁细胞从培养板底部刮起。收集离心，弃上清，每份细胞沉淀中加入200iU蛋白裂解液(购自RIPA公司，货号PP1901)，彻底混匀；冰上，细胞裂解15分钟；4°C，12000rpm离心10min。将离心后的上清分装转移倒0.5ml的离心管中，-2(TC冻存。蛋白浓度测定后备用。2)分别对GH及beta-actin基因进行westernblot分析(1)电泳配10%_12%分离胶，加入1￡1^0(购自sigma公司，货号R4054)后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，待胶面升到绿带中间线高度时加一层水；当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干；配4X的浓縮胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓縮胶然后将梳子插入浓縮胶中；电泳样品准备，使每个样品总蛋白上100ug计算各个样品所需取样量，并与5Xloadingbuffer混匀，沸水煮5min，放入冰盒中速冷；上样，开始电泳。浓縮胶电泳电压为80V，分离胶电泳电压为120V。待溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳。(2)转膜准备6张与胶同样大小的滤纸和1张PVDF膜，PVDF膜先在甲醇中浸湿，然后与滤纸一起放入转膜缓冲液中，至完全浸透；按照3张滤纸，膜，胶，另3张滤纸的顺序依次放好，要求中间没有气泡；盖上仪器，接通电源，转膜约45-90min;转膜完毕后，将膜取出放入TBS-T中洗1次，时间5min。(3)封闭用TBST溶液配制5%脱脂奶粉，将膜浸入后，室温放置1小时。(4)—抗孵育用封闭液将一抗(生长激素抗体购自ABR公司，货号PAl-85521;beta-actin抗体购自santacruz公司，货号SC-47778)按照一定比例稀释，将膜与一抗一起孵育，4度过夜。孵育结束，TBS-T洗3次，每次5min。(5)二抗孵育用封闭液稀释HRP标记的二抗(购自santacruz公司，货号SC-2005)，稀释比例1:3000，将稀释后的二抗与膜共同孵育2-3小时。孵育结束，TBS-T洗3次，每次5min。(6)化学发光使用ECL化学发光显色液(购自尚柏生物公司，货号PCEOIO)进行化学发光。压上胶片曝光2-5分钟，胶片显影定影(购自柯达公司，货号KD-90)。(7)数据分析将显色后的膜或底片照相(见图6)，并用LabWorks软件对图像进行GH及内参beta-actin进行灰度分析，目的基因和内参的比值大小反应目的蛋白表达高低。各测定组中，正常对照组(转pcDNA空载体组)比值是0.016，pcDNA-GHcDNA组比值为0.248、pcDNA-GHgenomics组比值为0.082，pcDNA-GHl组比值为0.117、pcDNA-GH2组比值为0.074，pcDNA-GH3组比值为0.147、pcDNA-GH4组比值为0.135，pcDNA-GH12组比值为0.278，pcDNA-GH34组比值为0.217，pcDNA-GH123组比值为0.096。各组GH表达水平如图7所示。序列表〈110〉中国农业科学院北京畜牧兽医研究所〈120〉一种生产猪生长激素的方法及其专用DNA片段〈160>3〈210>1〈211>657〈212>DNA〈213〉猪(Susscrofa)〈400〉1ccaccatggctgcaggccctcggacctccgtgctcctggctttcgccctgctctgcctgc60cctggactcagg郷tgggcgccttcccagccatgcccttgtccagcctetttgccaacg120ccgtgctccgggcccagcacctgcaccaactggctgccgacacctecaaggagtttgagc180gcgcctecatCCCgg郷g3cagaggtectccatccagaacgcccaggctgccttctgct240tctcggagaccatcccggcccccacgggcaCC3gC3g3g3tcggacgtgg300agctgctgcgcttctcgctgctgctcatccagtcgtggctcgggcccgtgcagttcctca360gcagggtcttC3CC皿C3gCctggtgtttggcacctcagaccgcgtctecgag皿gctga4203gg3CCtgg3gg郷gratccaggccctgatgcgggagctgg郷atggcagcccccggg■cctcaagcaaacctecgacaaatttgacacaaacttgcgc540cgctgctteag皿ctecgggctgctctcctggacctgcac皿ggctgaga600catecctgcgggtratg皿gtgtcgccgcttcgtgg卿gcagctgtgccttctegt657〈210>2〈211>1590〈212>DNA〈213〉猪(Susscrofa)〈400>2ccaccatggctgcaggc皿gtgccccteaaatcccagtggcttggtgtgttctg皿gggt60gacgtgggggccatgcagatggatggggraccaaccttgggctttggggtttccgaatgt120atctectcctccaagtttteaatgtccctggggg郷ggg180織gggctggtggagcc郷cctcttgtctctgggatccctctctcacgg240gccctcctggtctcteggccctcggacctccgcgctcctggctttcgccctgctctgcct300gccctggactcggg郷tgggcgccttcccagccatgcccttgtccagcctetttgccaa360cgccgtgctccgggcccagcacctgcaccaactggctgctgacaccteca420aagctccccaggg郷gtgctgg郷ggggtggtgg卿ggggtg皿ttcgtccctctct■gcctegtgggggggttctggcc皿ccg皿gatgctetcag540gtgagtgt皿3Ctg皿ggggattcccaagaggag皿ccgcgccccagtgt600agacctggatggctgtcccctctcccaggagcgcgcctecatcccggagggacagaggte660ctccatccag皿CgCCC3ggctgccttctgcttctcggagaccatcccggcccccacggg720c皿ggacgaggCCC3gC3g3gatcggtgagtggccacctgccacctgccagccggggagc780aggggcctccctcttccteag皿ggctgccccatctctcatcatcagggccttgggcggc840cttctccccg3gCtggtgggggtgatggtggc卿gggcggggtggtgagggggacgccc■紅ggcggaggcagcgccccccatccacgcatctgcccgcgctgctgcgc960ttctcgctgctgctcatccagtcgtggctcgggcccgtgcagttcctcagcagggtcttc10203CC皿C3gCCtggtgtttggcacctcagaccgcgtctecgag皿gctg皿ggacctggag1080gagggcatccaggccctgatgcgggtgggg郷cgcgctcgggtcccgcacactggggcc1140catgccggctctctcccggctgagcggagcggtggggggacgracgtgggctggggg卿1200gggtcccgatgctctctctgtagcagttcactctcgaccctttcctcatt1260tccccctgcggagtcttccctctttgtccttctcc皿gcatggaggggagggtgg皿gac1320gg郷gg織gg卿gcgccgctgccaaggactcggcctctgtctctctctcccttttgc1380ggatggragcccccgggcaggacagatccttecgaca^t1440cttgcgcagtgatgacgcgctgcttaagaactecgggctgctctcctgct1500tc皿g皿ggacctgcacaaggctgagacatacctgcgggtcatg皿gtgtcgccgcttcg1560tggagagcagctgtgccttctagttgctgg1590〈210>3〈211>1109〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉〈400>3ccaccatggctgcaggcaagtgccccteaaatcccagtggcttggtgtgttctgaagggt60g3Cgtgggggccatgcagatgg3tggggC3ccaaccttgggctttggggtttccgaatgt120g￡lgC￡ltgg￡ltatctectcctccaagtttteaatgtccctggggg郷ggg1803gg卿3ggg織gggctggtggagcc郷cctcttgtctctgggatccctctctcacgg240gccctcctggtctcteggccctcggacctccgcgctcctggctttcgccctgctctgcct300gccctggactCgggElggtgggcgccttcccagccatg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