专利名称：烟草坏死病毒a作为外源基因的表达载体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域，具体地说，涉及一种来源于植物病毒的可以携带
外源基因在植物中高效表达的载体。
背景技术：
利用植物表达外源蛋白具有成本低，易规模化，安全性高等优点。在过去的20年中利用植物表达动物源性抗原(比如疫苗等)取得了长足的进步，显示出较大的吸引力[Hooper D.Plant Vaccines :An Immunological Perspective. In :Karasev AV， editor.Curr.Top.Microbiol. Immunol. Springer Berlin Heidelberg,2009 :332]。
相对于常规
的转基因植物稳定表达系统，基于植物病毒的瞬时表达系统因其快速，高效，操作方便显
不出了更大的优势[Lico， C. ， Chen， Q. and Santi， L Viral vectors for productionofrecombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 2008， 216 :366-377]。尽管已有利用植物病毒表达外源蛋白的先例，但是各植物病毒自身的特殊性决定了不同病毒载体的稳定性差异；此外，反复使用单一病毒载体生产外源蛋白，免疫动物后会产生针对病毒载体本身的抗性继而对疫苗的免疫效果产生影响。因此，我们通过基因工程的手段将烟草坏死病毒A中国大豆分离物(TNV_Ae)开发成可以稳定高效表达外源蛋白的载体。
现已证明，TNV_Ae是烟草坏死病毒A的一个新的株系，与TNV_A核酸水平上的同源性为86. 4%，最大的区别在于TNV-AG中不存在p7K编码框[Xi D， Li J， Han C， Li D，Yu J， Zhou X. Characterization of Tobacco necrosis virus A， an isolate infectedsoybean (Glycine max). Acta Phytopathologica Sinica 2007,37:595-603]。 TNV_AG是一种直径为28nm的球型病毒，外壳蛋白亚基为单一组分，分子量约为30kDa。基因组为一条含有3682核苷酸的单链正义RNA，编码5个开放阅读框。TNV_Ae寄主广泛，自然条件下下可侵染8科29种植物，如普通烟、西红柿、辣椒、大豆和葫芦等，但只在大豆(Glycinemax)和本生烟(N. benthamiana)上表现出系统侵染[Xi D， Li J， Han C， LiD， Yu J，Zhou X. Complete nucleotide sequence of a new strain of Tobacco necrosis virusAinfecting soybean in China and infectivity of its full—length cDNA clone. VirusGenes 2008,36 :259-266] 。 tnv-ag相对较小和稳定的基因组结构使得易对其进行分子水平
的改造。此外，大量的tnv-ac病毒粒子可以从侵染植物(如苋色藜和烟草)中纯化得到，
这为基于TNV-Ae的生物反应器的开发提供了便利。 目前没有将TNV_Ae开发成高效稳定表达外源蛋白载体的报道，本发明首次描述了将TNV-Ae基因组中的外壳蛋白编码区加以改造，使之能够携带外源基因并能在植物中高效表达目的蛋白；同时，外源小肽与TNV_Ae外壳蛋白融合后，可以被高效稳定表达在病毒粒子的表面，动物实验证明，重组病毒可以剌激小鼠产生特异性免疫反应。以上为基于TNV-f生物反应器的进一步开发和应用提供了基础。
发明内容
本发明目的是提供一种可以高效表达外源蛋白的植物病毒载体。本发明基于T7启动子控制下的TNV-AG全长侵染性cDNA克隆pMTC27，在对TNV_AC
基因组功能基因进行精确定位的基础上，对TNV-Ae基因组的不同区域进行缺失突变或者替
换突变[本发明以e-葡糖醛酸酶(GUS)基因替换TNV-Ae外壳蛋白基因为例]，在保证病
毒的侵染能能力和自身复制能力并不受到明显影响的前提下，减弱病毒的致病能力，在此
基础上构建出能够携带外源基因的病毒表达载体。 进一步通过感染寄主植物，测定了利用TNV-AM乍为外源基因表达载体的效果。
在本发明实施方案中，构建了 gus基因替换TNV_Ae的重组病毒载体pTGUS-II，将所述载体接种苋色藜，并进行症状观察和组织化学分析，观察到了症状的减轻，同时外源蛋白GUS获得了高效表达。 在本发明实施方案中，构建了 CaMV 35S启动子驱动下的TNV_Ae全长侵染性cDNA克隆pCXB-AC，转化农杆菌EHA105后，通过农杆菌浸润的方式接种大豆，可以实现TNV_AG在大豆中的系统侵染 本发明中所述的含有CaMV 35S启动子的质粒载体是指现有技术中已知的、能够
驱动外源基因在植物中进行表达的任何一种载体，如pRTL2， pBI121， pCass4-Rz等。 同时，本发明构建了融合有外源肽段的重组TNV_Ae表位肽展示载体。 在本发明实施方案中，将口蹄疫结构蛋白VP 1来源的不同肽段的分别融合在
TNV-Ae外壳蛋白的C末端，接种苋色藜后观察发现，重组病毒仍保持了和野生型病毒类似的
复制和侵染能力，并且通过病毒粒子的纯化以及免疫胶体金分析，发现重组病毒可以将外
源小肽高效展示在重组病毒粒体的表面，传代接种实验表明外源片段在重组病毒的复制增
值过程中保持稳定。进一步动物免疫实验表明重组病毒粒子可以剌激小鼠产生特异性体液
免疫反应和黏膜免疫反应。 本发明构建了具有能够携带外源基因、便于操作、感染效率极高等特点的基于TNV-f的病毒载体。利用本发明的方法，可以获得外源蛋白的高效表达，并且可以得到稳定高效展示外源表位肽的植物病毒重组疫苗，这为利用TNV_Ae生物反应器大规模生产药用蛋白或疫苗提供了可行性。
图1显示的是利用改造的TNV_Ae病毒载体表达GUS蛋白。A.上图表示T7启动子控制下的TNV-AG全长侵染性cDNA克隆；下图表示gus基因
替换TNV-Ae外壳蛋白后的重组病毒载体 B.电泳检测pMTC27 (泳道1)和pTGUS-II (泳道2)体外转录物 C.含有外源基因gus的重组病毒体外转录后接种苋色藜，接种后3天观察症状 D.普通视野下观察经组织化学染色后的接种叶片 E.显微镜下观察组织化学染色后的接种叶片(放大40倍) 图2显示的是TNV_Ae侵染性cDNA载体插入双元载体pCass4-Rz载体的构建以及载体的侵染性检测。 A.将TNV_AG全长侵染性cDNA克隆到双元载体pCass4-Rz中
B. pCXB-AC酶切鉴定。泳道M : A/Hind III+EcoR I，泳道l:Xba I/BamH I，泳道 2 :XhoI C. pCXB-AC转化农杆菌EHA105后，通过农杆菌浸润的方式接种大豆后，7天后对接 种叶进行观察(图板1) ， 14天后对系统感染叶片观察(图板2)，箭头所指为坏死斑。
D. Western印迹分析通过农杆菌浸润的方式接种的大豆系统发病叶片。M: Prestained molecular weight marker，泳道l :大豆系统发病口十片，泳道2 :接禾中TNV—A^病 毒的大豆系统发病叶(阳性对照)，泳道3 :Mock(阴性对照) 图3显示的是口蹄疫结构蛋白VP1来源的表位肽段与TNV-Ae外壳蛋白融合的重 组病毒载体的构建。 A.融合有口蹄疫结构蛋白VP1 B细胞表位的重组病毒载体pTNV-FB的构建
B.融合有口蹄疫结构蛋白VP1来源的表位肽段的重组病毒载体的基因组结构。表 位肽段通过3个氨基酸的linker (Gly-Ser-Pro)融合在TNV_Ae外壳蛋白的C末端。
图4显示的是含有不同口蹄疫表位肽段的重组病毒的侵染活性分析。
A.融合外源表位肽段的重组病毒载体接种枯斑寄主苋色藜后症状观察和免疫印 迹分析。上图表示分别含有外源肽段T8和B的重组病毒接种苋色藜3天后症状表型，下图 表示Western印迹分析外源表位肽段在接种叶片中的表达 B.融合外源表位肽段的重组病毒载体接种系统寄主本生烟后症状观察和免疫印 迹分析。上图表示分别含有外源肽段T8和B的重组病毒接种本生烟14天后症状表型，下 图表示RT-PCR和Western印迹分析外源表位肽段在系统侵染叶片中的表达
图5显示的是重组病毒的自我包装检测。 A. SDS-PAGE检测提取纯化的重组病毒T8和B，进一步分别利用不同的抗血清对纯 化的病毒粒子进行Western印迹分析。 B.电镜观察提取纯化的重组病毒粒子(放大倍数为60， 000倍)
图6显示的是外源口蹄疫表位肽段可以被高效展示在重组病毒粒子的表面。图板 A和图板B分别表示利用TNV_Ae兔抗血清和口蹄疫VP1兔抗血清作为一抗进行相应的免疫 胶体金分析(放大倍数为200， 000倍)。 图7显示的是重组病毒载体接种寄主植物后，外源肽段在重组病毒复制增值过程 中可以稳定存在于病毒基因组中。 A. RT-PCR(左图)和Western印迹(右图)分析重组病毒粒子在苋色藜上传代过 程中外源片段的稳定性 B. RT-PCR(左图)和Western印迹(右图)分析重组病毒粒子在本生烟上传代过 程中外源片段的稳定性 图8显示的是重组病毒T8和B通过肌肉免疫(图板A)和滴鼻免疫(图板B)的 途径能够剌激小鼠产生特异性体液免疫和黏膜免疫反应。 A.重组病毒肌肉免疫小鼠后，IgG及其亚型IgGl和IgG2a滴度检测。组l: TNV-Ae(阴性对照)，组2 :T8和B混合免疫，组3 :B单独免疫，组4 :T8单独免疫
B.重组病毒滴鼻免疫小鼠后，血清IgG和IgA抗体滴度、粪便IgA和阴道洗液IgA 检测。MouseNo. 1-5 :重组病毒B免疫小鼠，MouseNo. 6-10 :TNV_Ae免疫小鼠(阴性对照)
具体实施例方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 实施例1.利用TNV_Ae载体可在植物中表达13 _葡糖醛酸酶(GUS) 首先构建含有gus基因的重组TNV_Ae侵染性cDNA克隆，该克隆的特点是GUS基因 替换TNV-Ae CP编码框，但TNV-Ae的CP基因保留5'端18nt (6个氨基酸)(图1A，下图)。 具体过程为以含有gus基因的质粒pBGUS[Cao， Y. ， Yuan, X. ， Wang， X. ， Guo， L. ， Cai， Z.， Han， C. ， Li， D. ， and Yu， J. Effect of Beet black scorch virus coat protein onviral pathogenicity. Prog. Biochem. Biophys. ，2006,33 :127-134]为模板，利用引物对AGUS-4/ AGUS-7，在Pfu DNA高保真聚合酶作用下扩增得到约1， 800bp的平末端PCR产物，该片段为 gus基因；同时以TNV-Ae的侵染性cDNA克隆pMTC27(图1A，上图)为模板，分别用两对引 物TN132/AGUS-8， AGUS-3/TN64在Pfu DNA聚合酶作用下扩增得到大小分别为约300bp和 200bp的平末端PCR产物；最后将上述三段PCR产物经凝胶试剂盒(Axygen)回收后，通过 重叠PCR的方法，用引物对TN132/TN64在Pfu DNA聚合酶作用下扩增得到大小约2， 200bp 的平末端PCR产物；该PCR产物经DraIII和EcoRI双酶切后，回收约2， 200bp的片段；所 回收获得的该片段与经DraIII和EcoRI双酶切回收后的pMTC27大片段在T4DNA连接酶 (Takara)的作用下连接；然后将连接产物转化到用CaCl2法处理的大肠杆菌DH10b感受态 细胞中，在含有氨苄青霉素钠(终浓度100iig/ml)的LB固体培养基上培养过夜，挑菌划线 后，菌落PCR筛选获得gus基因替换TNV-AG的cp基因的侵染性cDNA克隆pTGUS-II (图1A， 下图)。 克隆过程中所使用的引物序列 TN64 :5 ' -CGGAATTCCGCCCGGGGTGGGGCAAAAGCC C_3 '， 与SEQ ID No. 1的 3665-3682反向互补，划线部分为引入的EcoRI位点TN132:5' -GGGCTAGGAGTAGTGAGGGTAAG-3'，与SEQ ID No. 1的2267-2289同源
对应 AGUS-3 :5 ' -CAAACAATAGTTCTTGTACTGTAACTCGACC-3 '，与SEQ ID No. 1的 3443-3563同源对应 AGUS-4 :5 ' -GTACAAGAACTATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3 '，与pBGUS中的gus基因 1791-1812反向互补 AGUS-7 :5 ' -GAAGAACATGTTACGTCCTGTAGAAACCCC-3 '，与pBGUS中的gus基因 1-23同源对应 AGUS-8:5' -GTAACATGTTCTTCTTTCCTGCCATGTC-3'，与SEQ ID No. 1的2609-2629 反向互补 接下来，对pMTC27和pTGUS-I I分别进行Smal线性化，而后按照Yuan等人的 方法[Yuan, X. ， Cao， Y. ， Xi， D. ， Guo， L ， Han， C. ， Li， D. ， Zhai， Y. ， and Yu， J. Analysis of thesubgenomic RNAs and the small open reading frames of Beet black scorch virus. J. Gen. Virol. ， 2006， 87 :3077-3086]，分别将线性化的pMTC27和pTGUS-II进行体外转录，电泳检测体外转录产物(图IB)。 体外转录完成后，将体外专利物与等体积的2 X GKP buffer(50mM glycine, 30mMK2HP04， 1% bentonite， 1% celite， pH 9. 2)混匀，立即摩擦接种苋色藜。接种3天后 观察发病症状，相对于pMTC27(wild type)接种后的苋色藜叶片，接种pTGUS-II的叶片表 现出减弱的致病症状。 进一步对接种后的叶片进行组织化学染色分析，以检测GUS蛋白是否被改 造的TNV-Ae载体表达。GUS基因活性的组织化学染色分析方法依据Bradford等人 [Bradford H. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram qimntitiesof protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. ， 1976,72 :248-254]。将接种的苋色藜叶片与含底物X-Gluc (X-Gluc染液组成 1. 0mg/ii 1X-Gluc ;50mM磷酸缓冲液，pH 7. 0 ;10mM EDTA，pH 8. 0 ;0. 05mM铁氰化钾；0. 05mM 亚铁氰化钾；甲醇，终浓度20%;0. 1% TritonX-100)的染色反应液于37。C保温6 8hrs， 进行组织化学染色观察，叶片等绿色组织用95%乙醇脱色后观察。结果发现，与对照接种叶 片(TNV-Ae和Mock)相比，接种pTGUS-II的叶片出现蓝色斑点(图ID)，进一步将组织化学 染色处理后的叶片放在显微镜下观察，同样只有接种pTGUS-II的苋色藜叶片呈现出蓝色 斑点(图IE)。以上结果说明GUS蛋白可以被改造的TNV-Ae载体高效表达。
实施例2. 35S启动子控制下的TNV_AG侵染性cDNA克隆可以通过农杆菌浸润的接 种方式系统侵染大豆 由于体外转录具有相对较高的成本和操作的不方便性，而通过农杆菌浸润的方式 接种植物简便易行，因此，构建了 35S启动子控制下的TNV-AM曼染性eDNA克隆(图2A)。 首先，将双元载体pCass4-Rz载体经Xbal/BamHI双酶切后，Klenow补平、自连后得到去除 Xbal和BamHI位点的pCass4 A XB-Rz，方便后续的分子操作。同时以pMTC27为模板，利用弓| 物对TN328/TN329，在Pfu DNA高保真聚合酶作用下扩增得到3682bp的平末端PCR产物，而 后将PCR产物经凝胶试剂盒回收(Axygen)， T4poly皿cleotide kinase (Takara)磷酸化处 理后，与经Stul单酶切的pCass4 AXB-Rz载体在T4DNAligase (Takara)的作用下连接，然 后将连接产物转化入E. coli感受态细胞DH 10b中，菌落PCR筛选得到35S启动子控制下 的TNV-AG侵染性cDNA克隆pCXB-AC(图2A)，按照碱裂解法[Sambrook， J. ， and Russell， D. W. 2001〃 MolecularCloning :A Laboratory Manual." 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, p27_29]提取质粒后，经限制性内切酶酶切鉴定正确(图 2B)。 克隆过程中所使用的引物序列 TN328 :AGTATTCATA CCAAGAATACCGG，与SEQ ID No. 1的l-23nt对应TN329 : GGGGTGGGGC AAAAGCCCCTCA，与SEQ ID No. 1的3661-3682nt反向互补
为了检测质粒的侵染性，利用冻融法将pCXB-AC转入根癌农杆菌EHA105 ，转 化方法参照Hofen等[HofenR， R， Willmitzer L. Storage of competent cells for Agrobacteriumtransformation. Nucleic Acids Res. ， 1988， 16 :9877]。而后参照English 等人的方法[English, J. ， Davenport, G. ， Elmayan， T. ， Vaucheret， H. ， and Baulcombe， D. Requirement ofsense transcription for homology—dependent virus resistance and trans-inactivation. ThePlant J. ， 1997， 12 :597-603]，将转化有pCXB-AC的农杆菌EHA105用无针头的注射器浸润入大豆叶片中，大豆注射接种转化有pCXB-AC农杆菌7天后， 浸润叶片呈现出与接种TNV-Ae(阳性对照)的大豆叶片相同的坏死症状浪种14天后，同 样观察到了与TNV-Ae(阳性对照)相同的系统坏死症状(图2C)。进一步采集系统发病的 大豆叶片，根据实施例4中所述的方法利用TNV-Ae特异性抗血清对发病叶片进行Western 印迹分析，同样检测到了与TNV-A、阳性对照)同样大小的目的蛋白(图2D)。以上结果说 明通过农杆菌浸润的方式，可以实现TNV-Ae侵染性cDNA在寄主植物中的复制表达和系统 侵染。 实施例3. 口蹄疫结构蛋白VP1来源的表位肽融合在TNV-Ae CP 3'末端
经过改造的TNV-Ae病毒载体可以在植物中高效表达外源蛋白(如GUS)，但只局限 于接种部位，不能系统表达目的蛋白，因此我们尝试了将外源小肽与TNV_Ae CP融合，以期 实现外源肽段在植物中的系统表达。 首先构建了融合有口蹄疫来源的表位肽段的重组病毒。以pMTC27为模板，利用引 物对TN49/TN64，在Pfu高保真DNA聚合酶(Takara)作用下扩增得到1376bp的PCR产物，该 片段对应SEQ ID No. l的2307-3682nt，将PCR产物经凝胶回收后连入pMD19-T，进一步筛选 测序后得到中间载体pTCPM-2 。利用引物对AcFB-l/AcFB-2，在高保真DNA聚合酶(Takara) 作用下反向PCR扩增得到一大的片段，将此片段经乙醇沉淀后，DpnI处理除去PCR模板，再 经凝胶回收，T4 DNApolymerase (Takara)切平，T4 polynucleotide kinase (Takara)磷酸 化处理后，在T4 DNAligase (Takara)的作用下自连，连接产物转化入E. coli感受态细胞， 经菌落PCR筛选和测序验证后得到pTCP-FB。将提取的质粒pTCP-FB经EcoRI/EcoRV双酶 切后，回收约520bp的片段，将此小片段替换经相同双酶切的pMTC27中的相应区域，得到具 有侵染性的融合有B细胞表位的重组病毒pTNV-FB (图3A)。构建重组病毒pTNV_FT8采取 的策略同上所述。 载体构建过程中所使用的引物TN49 :5' -ATTGACTGGCGTAAAGC-3'，与SEQ ID No. 1的2307-2323对应TN64 :5 ' -CGGAATTCCGCCCGGGGTGGGGCAAAAGCCC-3 '， 与SEQ ID No. 1的
3665-3682反向互补，下划线为引入的EcoR I位点 AcFB-l:5' -CACTTGAAGGTCACCTCTCACGTTGTTAGTaggggatccCACGTTCATTGTTGGGTTG -3'，划线部分与FMDV VPl氨基酸序列f"-V^反向互补，小写字母为linker序列，其余部 分与SEQ ID No. 1的3421-3439nt反向互补。 AcFB-2 :5 ' -TTAGCTCAGAAGGCAGAAAGAACTCTGCCTTAGTTCTTGTACTGTAACTC-3 '，划 线部分与FMDV VP1氨基酸序列L151-P16°对应，其余部分与SEQ ID No. 1的3440_3459nt对应。 口蹄疫来源的表位肽融合在TNV_Ae CP的3'末端(图3B)，在每种表位肽段的N 端引入了 3个氨基酸的linker(Gly-Ser-Pro)，目的是有利于肽段空间结构的灵活性以减 少外源肽段对TNV-Ae外壳蛋白结构上可能造成的影响。
实施例4.重组病毒侵染植物后能够高效表达口蹄疫表位肽 将含有口蹄疫VP1不同肽段的重组病毒pTNV-FB(B)和pTNV-FT8 (T8)按照实施 例1中同样的方法分别进行Smal线性化，而后进行体外转录，体外转录物与等体积2X GKP buffer混匀后，立即摩擦接种苋色藜和本生烟(图4)。
8
接种苋色藜3天后，重组病毒T8和B所致的枯斑症状与TNV_Ae接种的叶片 (阳性对照)没有明显的区别(图4A，上图)，进一步采集苋色藜接种叶片提取总蛋白进 行检测，具体步骤为液氮研磨充分，与2倍体积(v/w)的蛋白提取缓冲液(lOOmMTrizma base (p朋.8) ， 20 % glycerol, 4% SDS，200mM P -mercaptoethanol， 0. 2 % Bromphenol blue)混匀，剧烈震荡混匀，沸水浴煮沸10min，冰上放置10min，将样品置于4。C低温冷冻离 心机中12， 000rpm离心10min，取上清5 y 1进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，而后将 蛋白利用电转移装置(Bio-Rad)将蛋白转印至HyboncTM-C硝酸纤维素膜(GE Healthcare) 上，并进行后续的一抗(TNV-AG兔抗血清)、二抗(AP-A标记羊抗兔IgG， Sigma)免疫反应和 底物显色反应，结果显示，重组病毒T8和B目的条带相对于对照TNV-Ae(wild-type)均滞 后(图4A，下图)，说明伴随重组病毒高效侵染苋色藜，融合的外源口蹄疫VP1肽段能够被 高效表达。 接种本生烟2周后，表型观察显示重组病毒T8和B能够系统侵染本生烟，症状和 TNV-A^对照(wild-type)相比没有明显的区别(图4B，上图)。初步说明，含有外源肽段 的重组病毒能够自主包装成病毒粒体，从而具备系统侵染本生烟的能力。采集本生烟系统 发病叶片( 0.2g)进行RT-PCR检测。首先提取本生烟系统发病叶片总RNA，具体为液 氮研磨叶片后将粉末转入液氮预冷1. 5ml离心管，迅速加入600 Pl苯酚/氯仿/异戊醇 (25 : 24 : 1)和600 iil RNA提取缓冲液(20mM Trizma base (pH 8. 0) ， 200mM NaCl，5mM EDTA， 1.0% SDS)，剧烈混匀后，置于冰上(或室温)静置5min ;4"条件下，12， 000rpm离心 20min ;取上清500iil(可用酚/仿再抽提一遍)，加入800ia的4M LiCl，混匀后4。C放置 16hrs或-20°C 2hrs沉淀RNA ;4。C条件下，12， OOOrpm离心20min ;沉淀用70%和100%乙 醇各洗涤一次，真空抽干(勿加热)或超净台中吹干(推荐)，而后溶于适量DEPC处理的水 (无RNase)中。接下来取1 P g总RNA进行逆转录(RT)反应，反应体系1 y g total RNA， 5 ill DEPC-treated water, 1 ii lprimer (1. 0 ii g/ii 1) 。 65 °C ， 5min处理变性RNA，而后立 即置冰上5min。补加RT反应体系剩余的成分4 ii 1 10mM dNTP，6ii1 5X M-MLV Buffer, 0. 5 ii 1 M-MLV reversetranscriptase (Promega) ， 0. 5 ii 1 RNasin， DEPC处理水补足至 30 iil 。而后进行RT反应37。C :5min (primer与template复性)，42 。C :90min(逆转录反 应)，70°C: 10min (失活逆转录酶)。取RT产物5 yl作为模板进行PCR，反应体系其它成分 TN137/TN219 :0.5ii 1/0. 5 ii 1，10mM dNTP :4ii I，IOX Taq reaction buffer :5ii 1， TaqDNA polymerase :0. 5ii 1，(1朋20补足至50 ii 1反应体系，进行PCR扩增。94。C变性30s， 52。C复性 40s，72。C延伸30s，30个循环。配制2%琼脂糖凝胶，取5 yl RT-PCR反应产物进行电泳检 测。结果显示重组病毒T8和B目的电泳条带相对于TNV-Ae对照(wild-type)均滞后(图 4B，下图)，表明外源肽段在重组病毒系统移动过程中仍稳定存在于病毒基因组中。同样提 取了本生烟系统发病叶片总蛋白进行Western印迹分析(图4B，下图)，结果显示重组病毒 T8和B目的条带相对于TNV-Ae对照(wild-type)均滞后，说明外源口蹄疫肽段在本生烟中 得到系统表达。 融合有口蹄疫VP1肽段的重组病毒接种苋色藜和本生烟后，症状观察和分子检测 初步表明，重组病毒能够自我包装形成有活性的病毒粒体，外源肽段在重组病毒高效复制 和侵染的驱动下可以被大量表达。
RT-PCR反应中所用的引物
TNI37 :5 ' -CAAAATAGACATCACCAAGCTGGACAAGCC-3 '， 与SEQ ID No. 1的 3235-3255nt对应 TN219:5' -CTGCCGTAGGCATTGGTCGAG-3'，与SEQ ID No. 1的3457-3477nt反向 互补 实施例5重组病毒自我包装的分子检测和形态学观察 进一步通过超速离心提取病毒粒子的方法对重组病毒的自我包装进一步验 证。首先分别将TNV-f、 T8和B的体外转录物接种苋色藜，待发病后，研磨发病叶片取 其汁液再次大规模摩擦接种苋色藜来扩繁病毒。待接种叶片发病充分后，取30g发病 叶片后经液氮研磨，将粉末倒入烧杯，加入60 100ml的0. 2M PB(pH 7.0，现加0.2% |3 -merc即toethanol)，用小勺或搅拌子冰浴中充分搅拌溶解，双层纱布过滤，而后5(TC水 浴锅中加热滤液10min，初步去除杂蛋白(TNV-Ae因耐受温度较高不会受到影响)，而后 Sorvall SS-34(Biofuge Primo R，Heraeus，Germany)离心机中8， 000rpm，4。C离心30min ; 取上清，缓慢滴加三氯甲烷至滤液体积的15 25% (不可太多)，磁力搅拌器上冰浴中 充分搅拌30min lhr，而后10， OOOrpm， 4°C ，离心30min，取上清(交界面处液体勿吸，此 步上清可4。C冰箱中放置过夜)；而后将样品转移至超离管(Beckman)中，而后小心加入 5ml 20% (w/v)蔗糖垫，4。C， 38， 000rpm超速离心lhr(Beckman Type 70Ti rotor)，沉淀用 10 20ml 0. 02M PB (含0. 1 % P -merc即toethanol和0. 1 % Triton X-100)悬浮，磁力 搅拌器上冰浴中充分搅拌使病毒溶解出来(可以4t:冰箱中过夜存放溶液)，8， OOOrpm低 速离心，而后取上清进行第二次超速离心(同上)，沉淀用500 1ml (1朋20充分溶解， 用Nanodrop ND_1000spectrophotometer(Nanodrop Technologies, Rockland, Delaware,
USA)测得0D，，根据消光参数,2^: =5.6[田波，裴美云。植物病毒研究方法。1987，北
京科学出版社]，计算纯化后病毒粒子的浓度。 取5 ill提取的病毒粒子进行SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色结果显示重组病毒 T8和B均能被纯化，病毒的积累量和TNC-Ae对照(wild-type)相当，并且目的电泳条带相 对于对照均滞后，这从分子水平上说明融合有外源肽段的重组病毒可以进行有效的自我包 装。进一步利用Western印迹对提取纯化的重组病毒作进一步的分析。采用TNV-Ae兔抗血 清检测提纯的病毒，结果显示与预期相符，包括TNV-Ae对照在内纯化产物均可以被检测到， 并且重组病毒分子量大于TNV-Ae对照，说明外源肽段被重组病毒高效表达。当采用FMDV VPl兔抗血清和牛血清分别对纯化产物进行检测时，TNV-Ae对照(wild-type)由于不含有 外源口蹄疫VP1肽段，无阳性信号，而融合有外源肽段的重组病毒可以被检测到(图5A)。 以上结果说明重组病毒可以高效特异性表达外源口蹄疫VPl肽段。 进一步为了直观的反应重组病毒的自我包装，对纯化的病毒进行了电子显微镜观 察。具体步骤为将铜网悬浮在纯化的病毒粒子液滴上2min，约20滴ddH20冲洗，而后用 2% (w/v)uranyl acetate染色lmin，约20滴ddH20冲洗后，电子显微镜(JEM-1230, JEOL Co. Ltd, Japan)60，000X下观察，图像在iTEM platform(MoradaTEM digital camera, Soft Imaging Systems, Munster， Germany)上进行记录和分析。结果显示，T8和B形成了与 TNV-f对照(wild-type)类似的病毒粒体(图5B)，再次说明重组病毒正常的自组装使其 保持了和TNV-Ae类似的侵染活性，这使得融合的外源肽段可以被高效表达。
实施例6外源口蹄疫肽段可以展示在重组病毒粒子的表面
10
利用植物病毒表达动物病原性肽段，外源肽段需位于重组病毒粒子的表面，以保 证免疫动物后可以被机体所识别和加工，从而剌激动物体产生特异性免疫反应。本发明中 得到了高效表达口蹄疫VP1肽段的重组TNV-Ae病毒，进一步为了检验重组病毒是否可以作 为口蹄疫疫苗，首先利用免疫胶体金技术证实外源口蹄疫肽段位于重组病毒粒子的表面。
将纯化的病毒粒子分别与等体积的TNV-Ae兔抗血清和FMDV VP1兔抗血清混合，而 后将铜网悬浮在混合的液滴上约10min， PBS冲洗，随后将铜网悬浮在稀释的(1，000X)5nm 金颗粒标记的羊抗兔IgG (Sigma)上，PBS冲洗，而后按照实施例5中所述方法进行负染和电 镜观察(200，000X)，金颗粒由于密度较高，电子不能穿透，故在视野中形成黑色的斑点。结 果显示当用TNV-Ae兔抗血清作为一抗时，无论TNV-Ae对照(wild-type)还是重组病毒(T8 和B)都可以被金颗粒所修饰(图6A);当用FMDV VP1兔抗血清作为一抗时，只有重组病毒 (T8和B)可以被金颗粒所修饰，TNV-Ae对照(wild-type)由于不含有口蹄疫来源的肽段， 视野中观察不到被金颗粒修饰的现象(图6B)。以上结果说明外源表位肽段可以被高效展 示在重组病毒粒子的表面，这为后续免疫动物实验提供了可行性。 实施例7外源口蹄疫肽段在重组病毒增殖过程中仍稳定存在于病毒基因组中
通过基因工程的手段将外源基因与病毒基因组融合后，重组病毒在复制增殖过程 中往往会发生突变，包括外源片段点突变所导致的氨基酸改变甚至外源片段的丢失，这不 利于持续大量获得完整的目的重组病毒，因此，重组植物病毒疫苗的稳定性是决定其有无 实际应用前景的重要因素。本发明中对外源肽段在重组病毒复制增殖过程中的稳定性进行 了跟踪检测，结果表明重组TNV_Ae在侵染苋色藜和本生烟过程中都具有很高的稳定性。
对于接种体外转录物的苋色藜叶片，记作PO，后续取苋色藜接种叶片( 0. lg)液 氮研磨后，加入100ii 1 ddH20(含0. 4mg/ml RNase A) ， 37。C处理2hrs，而后12， OOOrpm离 心5min，取上清摩擦接种苋色藜记作Pl。按照上述同样的处理方法，将样品连续接种苋色 藜依次记作P2 P6。如果重组病毒发生突变导致病毒基因组RNA的暴露，环境中的RNase A会迅速将RNA降解，从而导致重组病毒失去致病力；相反，如果重组病毒较稳定，那么病毒 基因组仍能被外壳蛋白保护而不会被外界的RNaseA降解，病毒的致病力则不会受到影响。 症状观察表明重组病毒T8和B在侵染苋色藜过程中，致病力和TNV-Ae对照(wild-type)相 同，均没有发生明显的变化，进一步按照实施例4中所述的方法，采集传代过程中苋色藜接 种叶，提取叶片总RNA和总蛋白分别进行RT-PCR和Western blotting检测，结果表明，直 到P6时，重组病毒相应的RT-PCR产物目的电泳条带相对于TNV-Ae对照(wild-type)仍表 现滞后，说明外源片段在重组病毒复制侵染过程中持续稳定存在(图7A，左图)，将RT-PCR 产物分别经凝胶回收后测序，结果显示外源片段没有发生突变。Western印迹分析结果与 RT-PCR检测结果一致(图7A，右图)。 在本生烟上同样对重组病毒的稳定性进行了检测，不同之处在于采集的样品为系 统发病叶片，并且不经RNase A处理。症状观察显示重组病毒在本生烟上传至P3过程中， 致病力和TNV-AC对照(wild-type)相同，均没有发生明显的变化，RT-PCR检测和Western 印迹结果显示重组病毒系统移动过程中，外源口蹄疫肽段仍持续稳定存在(图7B)，这与苋 色藜中的检测结果一致。 重组病毒在苋色藜和本生烟上侵染结果表明，外源口蹄疫肽段融合在TNV-AeCP 3'末端对重组病毒的侵染活性和系统移动能力没有造成明显的影响，外源片段在重组病毒复制侵染过程中没有发生突变或缺失，这为大规模获得含有完整外源片段的重组病毒提 供了可能。 实施例8表面展示有外源口蹄疫肽段的重组病毒可以剌激小鼠产生体液免疫反 应和粘膜免疫反应 表面展示口蹄疫肽段和重组病毒的稳定性为后续免疫动物实验提供了基础。为了 检验重组TNV-Ae 口蹄疫疫苗剌激动物产生免疫反应的能力，将提纯的重组病毒通过肌肉免 疫和滴鼻免疫途经分别接种小鼠，ELISA检测抗体滴度。 对于肌肉免疫重组病毒粒子，从军事医学科学院购买了 24只6 8周龄Balb/c雌 性小鼠，分成4组(6只/组)，在第0天时，分别将TNV-AC (阴性对照，组1) 、T8&B (混合病毒， 组2)、B(组3)和T8(组4)与等体积弗氏完全佐剂混匀并充分乳化，肌肉注射小鼠(0. 2mg/ 只)；第14天和第21天将重组病毒抗原与等体积弗氏不完全佐剂混匀并充分乳化，免疫接 种相应组的小鼠。第28天，小鼠眼框采血，收集血清进行后续的ELISA检测。具体过程为将 96孔酶标板(Corning)分别包被TNV_Ae病毒粒子(0. 2 y g/孔)和FMDV VP1蛋白(1 y g/ 孔)，而后分别与2倍连续梯度稀释的免疫小鼠血清进行反应，每组血清三个重复。二抗分 别用HRP丰示记的羊抗鼠IgG、 IgGl禾口 IgG2a (Southern Biotechnology Associates)，纟5底 物显色后，GENios酶标仪(TECAN)中读取0D450/620，定义免疫重组病毒的小鼠血清0D值 比阴性对照血清0D值大2倍时的最高稀释倍数即为该血清的滴度。肌肉免疫结果显示，所 有免疫组均可特异性与TNV-Ae病毒反应产生高滴度的IgG ;相反，只有免疫重组病毒(T8或 者B)的小鼠血清可与FMDVVP1蛋白反应，分别产生高滴度的IgG、 IgGl和IgG2a，并且IgG 亚类中IgG2a占优势(图8A)。 黏膜免疫反应对于防御诸如FMDV、霍乱、流感和HIV等通过黏膜传播的动物病 毒有重要作用。有报道显示植物病毒疫苗可以剌激机体产生粘膜免疫反应[Bre皿an， F. R. ， Bellaby， T. ， Helliwell， S. M. ， Jones， T. D. ， Kamstrup， S. ， Dalsgaard， K. ， Flock， J.I.andHamilton， W. D.0. Chimeric plant virus particles administered nasally or orally inducesystemic and mucosal immune responses in mice. 1999， J. Virol. 73 : 930-938]。为了提高重组TNV-Ae 口蹄疫疫苗接种的方便性，对其通过滴鼻接种方式进行了 实验。将10只Balb/C雌性小鼠分成两组(5只/组)，不加佐剂，在第0、7、14、21和28天 分别对小鼠进行5次滴鼻接种重组病毒B (Mouse No. 1 5)禾P TNV-Ae(MouseNo. 6 10)， 100iig/只。第35天，眼眶采血收集血清，并用100 ill PBS(含0.5XBSA)冲洗小鼠阴道， 收集阴道洗液；同时采集小鼠粪便，用预冷的PBS(含25mM EDTA，pH 7.4)溶解粪便，经剧烈 震荡和低温离心后，加入PMSF和甘油超低温保存。ELISA反应同上所述，分别测得TNV-Ae病 毒粒子和FMDV VP1特异性血清IgG和IgA滴度及粪便IgA和阴道洗液IgA 0D45。，结果显示 无论TNV-Ae还是重组病毒B免疫的小鼠均可以产生TNV-Ae病毒粒子特异性抗体反应(图 8B);而只有重组病毒B免疫的小鼠才可以产生FMDVVP1特异性IgG和IgA ;并且在系统性 黏膜免疫反应中，3只小鼠的FMDV VPl特异性粪便IgA 0D45。值以及4只小鼠的FMDV VPl 特异性阴道洗液IgAOD，值要高于相应的TNV-AG对照组(图8B)。以上结果说明，在不加 佐剂的情况下，重组病毒通过滴鼻接种的方式可以诱导小鼠产生系统性黏膜免疫反应。
重组病毒通过肌肉免疫和滴鼻免疫可以剌激小鼠产生口蹄疫特异性体液免疫反 应和黏膜免疫反应，说明TNV_Ae可以作为动物病毒表面抗原的有效载体，并且使得免疫接种过程变得更加简便和安全。 序列表 〈110〉中国农业大学 〈120〉烟草坏死病毒A作为外源基因的表达载体 〈130〉bases 1 to 3682 〈160>14 〈170>PatentIn version 3. 3 〈210>1 〈211>3682 〈212>DNA 〈213>Tobacco necrosis virus A 〈220〉 〈221>5， UTR 〈222〉 (1) (59) 〈220〉 〈221>RdRp 〈222>(60). (2234) 〈220〉 〈221>P7〈222〉 (2218) (2436) 〈220〉 〈221>P5 〈222〉 (2439) (2609) 〈220〉 〈221>CP 〈222〉 (2612) (3442) 〈220〉 〈221>3， UTR 〈222〉 (3443) . (3682) 〈400>1 agtettcate cc朋g朋tec cggateggtg cg朋gcctte ctcagcc朋3 gagtcte朋3 60 tggagttecc aaaccaacac aagcaaacag ccgccgaggg ttttgtttct ttccteaact 120 ggctetgcaa tccatggcgc cgacaacgte cagtcaacgc tgccgttgcg ttccaagccg 180 acctggccct cattgaggac acagagcatc ttgatgacat caatgagtgc tttgaggagt 240 cggctggggc tcaatcgcag cgcacteagg ttgtggcaga aggagcatet gcgcccgcte 300 aatccaateg aacccgccgg gtccgteagc agaaaaagca caagttcgtt aaatetcttg 360 tgaacgaggc ccgagccgag tttgggttgc cteaaccaac tgaggcaaac agactcatgg 420 ttcaacattt cctgctcagg gtgtgteagg attggggtgt ggtcacagcc cacgtecacg 480 gcaacgttgc acttgcattg cctctggtgt ttettccaac ggaagacgat ctgctgtcaa 540
gagcattgatg皿cacgtecgctec皿ggg ccgctgtecg gggcatggag C3caccc3gg600g卿ggggtggtgg皿c皿t郷ttgggga ttgg郷cra ggttggactg gccttccggt660cca朋teggggtgccttgaagtccgtttcg cgtggggaac720atcctgatctggtggtrateccatcagggcgccctgagaa acagcgtcag ttgttecgct780ategtggtet3ggcggccatttetteatcg gcatccacaa caactctctttccaacttec840gteggggtttgatgg皿3g3gtettttecg tcgaggggccttcgggtctccaagatgccc■cteagcccgt咖gggagcgttccgaacccttgateagttccgcgatctc960ategttggcgtcatecccctgteactegtg agc皿ttcct皿tg皿ttectcgggcagga1020tteccgag皿gcagttgate gtttgtcgca tcaaccgctt agctccagag1080atgcg皿gttgtteaggccg aaaaacttea tctttcteag aagcctgacc1140ctgcccccagggtcatccaacctegatcgcctcggtecaacgtttgtttgggcaggtecc1200tccgacattetgaacatcatgcgctc皿皿ccattgcteaatgctttgggg3朋tC3Cgg1260tcttcaaggggtttectctcgagc皿c皿ggcggtcc皿gtgg朋te朋t1320atgtteatcccgtcgcggtcgg3CtCg3tgccagtcggtttgaccaacacgtgtctgttg1380gtecgagcatgaattttetttgagagattecccteatgat3朋C3gCtg31440aatggttgctctgtgcaacateggcacggcatttgctegtgatggcatc31500g皿gg皿ggtgtgggg織tg皿cactegtttgggcaatt1560gcatectcatgtgcg咖tggtctecggtcccteggaatcaaattgtcgt1620cggggatgactgcgtcattgtctgtgag皿agcggatttetc朋3gttga1680Cg3gC3gC3tcgaaccgtetttcaagcaatttggattcaa皿tgg郷tgg3g朋3CCCg1740tggacatettgaattttgcc皿3CCC3gCCtgtgttcgatggteaccagt1800ac3teatggtgcga皿gccttccgttgteacttccaaagatgtcactegtcteateccct1860ggcac皿tetgcag皿tggctgcaagctgt郷tgagtgtggcatgagca1920t咖tggtggaatccctgtttcteccaaatgcttcaaactggcgteagcc1980C3CC皿g3CCggcgagttcc郷cg皿tggcttggggtetcactctegat2040tcatg皿tegagtggcccggagtccttcgcccgaaacccgtttgtccttttecctegctt2100ttggtetcacaccagacctcC3gg皿gC3Ctggagatcttctetgateccacgaagctgg21603gCtgg3Cg3tgttgtcccaactgatecataccaagtetcttgatcaatg2220ctgatgtcagtgaggac皿tgtgcaagttcgcggtcgggctegg3gtegt2280g郷gte卿ttcgggattgactggcgteaagcgtcacgcggtg3gtg朋2340acatctcaga郷tectggc皿cgg皿c皿tgaccaacat3gCCg朋g3g2400cagaccatteccgtgacatecaacttteacttttegttetggcgtettgtcgctgttgtg2460atecttcacc3ggtettecattettcccctactttgcaattctcatcctcatettegc朋2520tecttgttgttggcactccaatcatcattctcctegtecttecgagtete2580catttcgatcgc皿皿tegaC3tggC3gg33C朋C朋tgg2640tcagtecattgtectgcgtectccagagca3C3ggtgg皿attgaccagcgtgatgcacg2700C3ggCtggC3Cg3ggCCgC3g3ggC3gCC3gttcagcgct3C3tC朋Cg32760gratgggctec皿皿tgggttgtcagggcg郷tggttecgtcgtcgctcccgcatctgg2820tggggtggtgactcgacccatcgteccaaagttttcteac卿ggtgactcgactettgt2880gagatccteaattegccgcagctggcgcgttcaacactec2940
ctgattgcagcggcaccatcatggttggctggaatttctgatttetecag3000
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ttgccccacccc3682 tcgcaatacc caattccgca teaatetega tggatctgtt gcagttatca agcgtacttg caagctggac gctggaccag agcagccaca caacccaaca cacacgtgtg cccctaccga gtatgtgcgc tgaggggctt 〈210>2 〈211>31 〈212>DNA 〈213〉Artificial 〈220〉 〈223〉与TNV-AC基因组的的3665-3682反向互补，引入的EcoRI位点 〈400>2 cggaattccg cccggggtgg ggcaaaagcc c 〈210>3 〈211>23 〈212>DNA 〈213〉Artificial 〈220〉 〈223〉与TNV-AC基因组的2267-2289同源对应 〈400>3 gggctaggag tagtgagggt aag 〈210>4 〈211>31 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>4 caaacaatag ttcttgtact gtaactcgac c 〈210>5 〈211>31 〈212>DNA
31
23
31
15
〈213〉人工序列〈400>5gtacaagaac tattgtttgc ctccctgctg c〈210>6〈211>30〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6g朋g朋c3tg ttecgtcctg tega朋cccc〈210>7〈211>28〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>7gtaacatgtt cttctttcct gccatgtc〈210>8〈211>23〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉与TNV-AC基因组的1_23 nt同源对应〈400>8agtettcate cc朋g朋tec egg 23〈210>9〈211>22〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉与TNV-AC基因组的3661-3682 nt反向互补〈400>9ggggtggggc aaaagcccct ca〈210>10〈211>17〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉与TNV-AC基因组的2307-2323同源对应〈400>10attgactggc gte朋gc
〈210〉 11 〈211>58 〈212〉DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 11 cacttgaagg tcacctctca cgttgttagt aggggatccc acgttcattg ttgggttg 58 〈210>12 〈211 〉50 〈212〉DNA 〈213〉人工序列 〈400>12 ttagctcaga aggcagaaag aactctgcct tagttcttgt actgtaactc 50 〈210〉 13 〈211〉30 〈212>DNA <213>Artificial 〈220〉 〈223〉与TNV-AC基因组的的3235-3255 nt同源对应 〈400>13 caaaatagac atcaccaagc tggacaagcc 30 <210>14 〈211>21 〈212〉DNA 〈213>Artificial <220> <223>与TNV-AC基因组的3457-3477 nt反向互补 〈400>14 ctgccgtagg cattggtcga g 2权利要求
一种分离出的cDNA分子，其特征在于，它包括与SEQ ID No.1中从核苷酸1-3682同源性高达70％的核苷酸序列。
2. 含有权利要求l所述的cDNA分子，来源于烟草坏死病毒中国大豆分离物(Tobacconecrosis virus A Chinese isolate,简称为TNV_AC)的RNA基因组序列。
3. —种质粒载体，它含有SEQ ID No. 1核苷酸序列和位于其上游的T7启动子，其特征在于，通过T7启动子的作用，可以使TNV-Ae的cDNA在病毒体外得到转录，重新产生具有侵染活性的TNV-Ae基因组RNA。
4. 一种如权利要求3所述的质粒载体，其特征在于利用DNA重组技术，将外源基因插入到完整的或者经突变改造的TNV-Ae基因组中，并随着TNV-Ae基因组的表达而得到表达；而且TNV-Ae在携带其他外来基因的同时，自身的复制能力并不受到明显影响。
5.—种质粒载体，它含有SEQ ID No. 1核苷酸序列和位于其上游的CaMV 35S启动子。其特征在于通过35S启动子的作用，可以使TNV-Ae的cDNA在植物体内得到转录，重新产生具有侵染活性的TNV-Ae基因组RNA。
6. 如权利要求5所述的质粒载体，其特征在于利用DNA重组技术，将外源基因插入到CaMV 35S启动子控制下的完整的或者经突变改造的TNV_Ae基因组中，并随着TNV_Ae基因组的表达而得到表达；而且TNV-Ae在携带其他外源基因的同时，自身的复制能力并不受到明显影响。
7. 将权利要求5或权利要求6所述的任意一种载体转入植物的方法，使外源基因可以在所获得的转基因植物中稳定表达。
全文摘要
本发明提供了利用烟草坏死病毒A(Tobacco necrosis virus A，TNV-A)作为外源基因的表达载体，通过基因替换或融合的方式将外源基因整合入TNV-A基因组中，外源蛋白可以伴随TNV-A在植物中的高效侵染和复制而得到高效表达。以替换β-葡糖醛酸酶基因(gus)为例，表明TNV-A可以作为外源蛋白高效表达载体；选择口蹄疫(foot-and-mouth disease virus，FMDV)结构蛋白VP1上的不同肽段融合入TNV-A外壳蛋白(coat protein，CP)中，表明TNV-A可以作为高效的外源表位肽展示载体，并且重组病毒(chimaeric virus)可以通过肌肉免疫和滴鼻免疫途径刺激动物产生特异性体液免疫反应和黏膜免疫反应。
文档编号C12N15/63GK101748135SQ20101003372
公开日2010年6月23日 申请日期2010年1月5日 优先权日2010年1月5日
发明者于嘉林, 张晓峰, 张永亮, 李大伟, 李江, 蒲恒, 陈明宽, 靳津, 韩成贵 申请人:中国农业大学