专利名称：一种快速诊断染色体数目异常的多重qf-pcr str检测体系的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种用于21、18、13和性染色体数目异常的QF-PCR快速诊断技术，特别是涉及三个用于检测21、18、13和性染色体特异STR的多重PCR扩增体系及其引物。
背景技术：
新生儿遗传性疾病尚没有有效的治疗方法，产前诊断是阻止先天缺陷新生儿出生 的最为有效的手段。染色体病是新生儿最多见的一类遗传性疾病，以唐氏综合症(21三体) 和Turner综合症(45，X)最为多见，其次为18三体，偶见13三体，Klinefelter综合症及 XYY综合症等。目前染色体病产前诊断中最主要的技术手段是染色体核型分析，但由于其操 作复杂，花费时间长(约14个工作日)，不仅会错过临床医生进行处理的最佳时机，还会给 孕妇带来沉重的精神负担。因此，建立一种快速、准确的产前诊断技术成为目前众多学者研 究的重点。上世纪90年代后期，短串联重复序列(small tandem repeats, STRs)被发现可作 为染色体特异性标记，随着DNA标记技术以及检测技术的发展，人们开始采用经荧光标记 的引物对染色体特异的STR进行PCR扩增，然后使用DNA自动序列分析仪进行片段分析，从 而检测这些染色体特异的微卫星重复序列。该技术自发明以来，已广泛应用于法医学鉴定、 亲子鉴定等方面。在欧美国家，该技术也已被应用于针对21、18、13及XY等染色体数目异 常的快速产前诊断方面。市面上也已有这方面的试剂盒出售。而在中国，这方面的技术还 相对落后。虽然目前欧美已有多个实验室将QF-PCR技术应用于染色体异常的常规检测中， 但他们的QF-PCRSTR体系还存有一定的缺点，如STR位点较少等，而且他们选用的STR位点 在中国人群中杂合率不高，因此不适用于中国人群的检测。已有学者尝试采用QF-PCR进行性染色体数目异常。他们要么使用某个常染色体 STR位点与一个X染色体的STR位点进行相对定量，但这种方法的可重复性较差；要么使用 尽量多的XY染色体STR位点来对性染色体的数目进行判定，但由于性染色体STR位点的杂 合率均较低，以致使用较多的位点也无法判定某些纯合个体。与传统的核型分析技术相比，QF-PCR在诊断染色体数目异常方面具有快速、准确、 费用低等优势。该技术还可用于母血污染的判定方面，为临床分子诊断提供质量保证。因 此，开发一套STR位点足够多，并且各STR在中国人群中的杂合率足够高的适用于中国人群 的QF-PCR STR检测体系，以及一套完善的性染色体异常QF-PCR STR检测体系，均具有重要 的意义。
发明内容
针对现有QF-PCR体系STR位点不足够，相对定量可重复性差，选用的STR位点在 中国人群中杂合率较低等缺点，本发明的目的是建立一套包含足够多的STR位点、并且各 STR在中国人群中杂合率均较高的诊断21、18、13染色体数目异常的多重QF-PCR STR快速 检测体系，以及结合相对定量和增加STR位点两个方法，建立一个较完善的检测性染色体数目异常的QF-PCR STR检测体系，即荧光定量PCR检测技术，其操作实施步骤为(1)、首先针对各目标染色体，选取在中国人群中杂合率较高的STR位点通过对已报道的中国人群各STR位点杂合率进行分析，或对感兴趣的STR位点进行实验检测，以挑 取在中国汉族人群中杂合率足够高的STR位点。(2)、对合适的STR位点设计引物，分组进行多重PCR，并调整反应参数等，以建立 三个完善的多重PCR体系。(3)、对PCR引物进行荧光标记，QF-PCR验证标记方案的可行性。(4)、QF-PCR进行大样本试验，以验证三个多重STR检测体系的适用性，包括各STR 位点的杂合率、片段分析结果是否正常(有无异常电泳行为)、各PCR产物大小分布会否相
互重叠等。本发明具体通过以下方案予以实现快速诊断染色体数目异常的多重QF-PCR STR 检测体系包含有A、B、C三组多重PCR体系，其中，A组为引物经荧光标记的8重PCR体系， 检测位点包含性别判断基因AMXY，6个21号染色体特异STR位点D21S1433、D21S1411、 D21S1414、D21S1412、D21S1445和一个位于21qll. 2的未命名的STR位点，及1个13号染 色体特异STR位点D13S258 ；B组为引物经荧光标记的8重PCR体系，检测位点包含性别 判断基因SRY，4个18号染色体特异STR位点D18S535、D18S391、D18S51和D18S386，及3 个13号染色体特异STR位点D13S742、D13S634和D13S303 ；C组为引物经荧光标记的9重 PCR体系，检测位点包含性别判断基因AMXY和SRY，5个X染色体特异STR位点DXS1187、 DXS8377、DXS6809、DXS981 和 DXS1053，1 个 13 号染色体特异 STR 位点D13S305，及 1 个 21 号染色体特异STR位点D21S11。本发明的技术方案还包括上述靶向21号染色体特异STR位点D21S1412、 D21S1445和D21S11，以及一个还未经命名的位于21 q 11. 2的新STR位点的PCR引物序列，靶 向18号染色体特异STR位点，靶向13号染色体特异STR位点D13S742、D13S634、D13S303和 D13S305 的 PCR 引物序列，靴向 X 染色体特异 STR 位点 DXS1187、DXS8377、DXS6809、DXS981 禾口 DXS1053的PCR引物序列。本发明的技术方案还包括所述A组的STR多态位点的PCR产物大小范围在大部 分个体不重叠，但D21S1433与21qll. 2的PCR产物等位基因峰在某些个体中可能出现重 叠，D13S258与D21S1411的PCR产物等位基因峰在某些个体中可能出现重叠，这两对位点 的不同标记可使PCR产物峰区分开。所述B组的STR多态位点的PCR产物大小范围在大部分个体不重叠，D18S386与 D13S742的PCR产物等位基因峰在某些个体中可能出现重叠，D13S634与D13S303的PCR 产物等位基因峰在某些个体中可能出现重叠，这两对位点的不同标记可使PCR产物峰区分 开。所述C组的STR多态位点的PCR产物大小范围在大部分个体不重叠，而非多态的 SRY及多态的DXS981与组内其他位点的不同标记可使结果分析更方便。进一步地，上述A 组的 PCR 体系各引物AMXY、D21S1433、D21S1411、D13S258、 D21S1414、D21S1412、D21S1445 和 21qll. 2，在 PCR 反应液中的终浓度分别为 0. 1,0. 2,0. 2、 0.3,0. 4,0. 4,0. 1和0. 35 μ Μ,该浓度组合使该组各位点的PCR产物荧光信号强度均在合适 范围。B 组的 PCR 体系各引物D18S535、D18S391、SRY、D18S51、D18S386、D13S742、D13S634和D13S303，在PCR反应液中的终浓度分别为0. 2、0. 2、0. 2、0. 1、0. 4、0. 5、0. 4和0. 4 μ M，该 浓度组合使该组各位点的PCR产物荧光信号强度均在合适范围。C组的PCR体系各引物 AMXY, DXSl 187、DXS8377、SRY、DXS6809、DXS981、DXS1053、D13S305 和 D21S11，在 PCR 反应 液中的终浓度分别为0. 1,0. 15,0. 15,0. 2,0. 2,0. 3,0. 2、0. 3和0. 5 μ Μ，该浓度组合使该组
各位点的PCR产物荧光信号强度均在合适范围。
本发明最终选取的位点有21号染色体STR位点7个，18号染色体4个，13号染 色体5个，X染色体特异STR 5个，以及性别特异基因AMXY和Y染色体特异基因SRY。最终 建立的三个多重PCR体系(A、B、C组)的组分及引物序列等分别见表1、表2和表3。表1.A组多重PCR体系的STR位点、引物信息及引物用量 *该位点是位于21qll. 2的还未经命名的新STR位点。表2. B组多重PCR体系的STR位点、引物信息及引物用量 使用本发明STR检测体系扩增的PCR产物可用ABI3100、ABI3130等全自动序列分 析仪进行片段分析。各STR位点PCR产物的条带数目异常或峰面积比例异常反映了相应染 色体三体或三体嵌合的存在。A组和B组多重PCR体系结合使用即可快速有效地检测产前 诊断中最常见的21、18和13号常染色体数目异常。本发明中C组多重PCR体系的AMXY可 与D13S305、D21S11进行相对定量，结合SRY及其余5个XY染色体STR位点，单独使用就可 以进行Turner综合症等性染色体异常疾病的检测，可用于常规的产前诊断中，也可用于性 染色体异常疑似病例的临床检测中。目前已使用该发明进行了 2250例产前诊断标本以及27例成人Turner疑似病例 的检测，成功检出唐氏综合症48例，13三体18例，18三体11例，Turner综合症35例(产 前8例和27例成人)，69，XXX 1例，69，XXY2例，47，XXX 1例，47，XXY 1例，提示其他类型 性染色体异常3例。与常规核型分析结果比较，该QF-PCR快速诊断体系对21、18和13三体的阳性检出率为100%，与核型分析结果的一致率达100%。QF-PCR对性染色体异常核型的检出率为98%，与核型分析结果的一致率达98. 2%。整套STR检测体系对染色体数目 异常的假阳性率0%，假阴性率低于0. 2%。本发明已成功为临床产前地中海贫血分子诊断 提供母血污染鉴定122例，证实存在母血污染3例，为产前诊断提供了质量保证。本发明适 用于各种产前诊断标本的检测，包括羊水、绒毛、脐血等，完成一套检测只需60-180ng DNA。 该发明用于产前诊断不仅能大大缩短诊断时间，为临床医生及时处理争取了宝贵时间并减 轻了孕妇等待结果所承受的心理负担，还能降低成本，是一个经济实用并可靠的产前诊断 新方法。
图1为一正常男性的QF-PCR结果AMXY为1 1双峰，SRY有产物峰且X染色体 STR位点均为单峰，显示为男性；其余各STR位点为单峰或面积1 1的双峰，显示该样本正常。图2为一正常女性的QF-PCR结果AMXY为单峰(AMX)且SRY无产物峰，X染色体 STR位点为单峰或面积1 1的双峰，显示为女性；其余各STR位点为单峰或面积1 1的 双峰，显示该样本正常。图3为一 21三体的QF-PCR结果21号染色体的STR位点全为面积2 1或1 2 的双峰、或1 1 1三峰，其余染色体STR位点为正常峰型，显示该样本为21三体核型。图4为一 18三体的QF-PCR结果18号染色体的STR位点为单峰、面积2 1或 1 2的双峰、或1 1 1三峰，其余染色体STR位点为正常峰型，显示该样本为18三体核型。图5为一 13三体的QF-PCR结果13号染色体的STR位点为单峰、面积2 1或 1 2的双峰、或1 1 1三峰，其余染色体STR位点为正常峰型，显示该样本为13三体核型。图6为一 45，X的QF-PCR结果-X染色体的STR位点均为单峰，无AMY和SRY的检 测峰，且AMX的总面积是D21S11总面积的1/2。
具体实施例方式下面将结合具体实施例作进一步阐述，这些实施例仅为说明本发明而列举，并非 用于限制本发明的保护范围。实施例一本发明的检测方法产前诊断标本包括羊水、绒毛、胎血等。全血样本需要A⑶抗凝，羊水标本需 3000rpm离心收集细胞，绒毛浸泡于生理盐水中。各种标本于4°C保存，48小时内提取DNA。 DNA的提取使用试剂盒进行，例如QIAamp DNA Mini kit (QiaGen)，并严格按照说明书操作。 最后DNA产物用双蒸水溶解，N. D1000V3. 7 DNA测定仪上测定浓度和纯度，调整DNA浓度至 10-50ng/ μ L。0D260/280比值介于1. 6-2. 1之间为合格DNA样本。PCR 反应DNA 聚合酶使用 Takara Taq Hot Start Version, PCR 反应采用 25 μ L 体系，DNA模板量为15-70ng。每份DNA样本进行A、B、C三组反应(见表1、表2和表3)。 A 组 PCR 循环参数如下:95°C 5min, (95°C 30s, 57°C 40s, 72°C 60s) X 25cycles, 72°C IOmin ；B 组和 C 组 PCR 循环参数如下95°C 5min, (95 °C 30s, 60 °C 40s, 72 °C 60s) X25cycles, 72°C IOmin0 反应在 Biometra Tprofessional PCR 仪上进行。片段分析PCR产物各 1 μ L，加 0. 2 μ L Genescan 500HD [ROX] size standard 和 9 μ L变性剂HiDi，充分混勻。95°C变性2min，迅速放入冰水混合物中冷却3min。变性好的 待测PCR产物于ABI 3130x1序列分析仪上进行片段分析，主要参数设置为Run module HIDFragmentAnalysis36_P0P4,Dye set :G5。收集的荧光信号使用 GeneMapper 软件进行分 析。片段分析结果判定1.等位基因峰荧光信号强度应介于500-8000之间，低于或高于此范围均应重做 PCR反应。2.等位基因峰2个，且峰面积比小于1.4或者大于0.8(约为1 1)，为正常峰型；
等位基因峰3个，或者等位基因峰2个并且峰面积比大于1.6或小于0.65(约为2 1或 1 2)，为异常峰型。3.发现异常峰型，应常规重复QF-PCR —次，以保证结果的可靠性。4.每一个染色体至少2个STR位点为异常峰型，才能诊断此样本为相应染色体异常。5.如发现等位基因峰面积比介于正常与异常之间，则建议对此STR进行单管PCR 反应。实施例二 一个健康男性的QF-PCR检测参照图1所示，应用实施例一的方法，对一个经核型分析证实为正常核型的健康 成年男性的外周血样本200 μ L提取DNA，共获得45 μ L浓度23. 5ng/ μ L的DNA，0D260/280 比值1. 82，为合格DNA样本。各取2 μ LDNA进行A、B、C三组PCR反应及片段分析。GeneMapper 软件对收集到的荧光数据分析结果见表4 表4GeneMapper软件对一名健康男性的QF-PCR荧光信号的数据分析结果 该样本的所有等位基因峰荧光信号强度均介于500-8000之间，荧光信号强度适 合进行核型判断；性别判定基因AMXY显示1 1(AMX AMY)双峰，男性特异基因SRY有 扩增峰，因此该样本有等量的X和Y染色体；所有21、18和13号染色体特异STR位点的等 位基因峰为单峰或1 1双峰，因此该样本的21、18和13号染色体为正常的二倍体；所有 X染色体特异STR位点为单峰，并且AMXY的峰面积总和与D21S11峰面积总和的比值约为 1 1，因此该样本含1个X和1个Y染色体；综合上述分析，该样本为21、18、13和性染色 体均为正常二倍体的男性。实施例三一个健康女性的QF-PCR检测
参照图2所示，应用实施例一的方法，对一个经核型分析证实为正常核型的健康 成年女性的外周血样本200 μ L提取DNA，共获得45 μ L浓度26ng/ μ L的DNA，0D260/280比 值1. 91，为合格DNA样本。各取2 μ L DNA进行A、B、C三组PCR反应及片段分析。GeneMapper 软件对收集到的荧光数据分析结果见表5 表SGeneMapper软件对一名健康女性的QF-PCR荧光信号的数据分析结果 *由于DXS1053位点PCR扩增片段中间有“CA”两碱基简单重复，导致PCR过程容 易出现滑移，因此产物双峰比值不严格接近1 1(<1.6)仍属正常。该样本的所有等位基因峰荧光信号强度均介于500-8000之间，荧光信号强度适 合进行核型判断；性别判定基因AMXY显示1个单峰(AMX)，男性特异基因SRY无扩增峰，因 此该样本只有X染色体；所有21、18和13号染色体特异STR位点的等位基因峰为单峰或 1 1双峰，因此该样本的21、18和13号染色体为正常的二倍体；所有X染色体特异STR位 点为单峰或1 1双峰，并且AMX的峰面积与D21S11峰面积总和的比值约为1 1，因此该 样本含2个X染色体；综合上述分析，该样本为21、18、13和性染色体均为正常二倍体的女性。实施例四一个唐氏高风险胎儿脐血标本的QF-PCR检测参照图3所示，应用实施例一的方法，对一个唐氏筛查高风险胎儿的脐血样本 200 μ L提取DNA，共获得100 μ L浓度18ng/ μ L的DNA，0D260/280比值1. 89，为合格DNA样 本。各取3μ L DNA进行A、B、C三组PCR反应及片段分析。GeneMapper软件对收集到的荧 光数据分析结果见表6:表eGeneMapper软件对一名唐氏高风险胎儿的QF-PCR荧光信号的数据分析结果 该样本的所有等位基因峰荧光信号强度均介于500-8000之间，荧光信号强度适 合进行核型判断；性别判定基因AMXY显示1 1(AMX AMY)双峰，男性特异基因SRY有 扩增峰，因此该样本有等量的X和Y染色体；所有21号染色体特异STR位点的等位基因峰 为单峰、异常的1 2或2 1的双峰、或异常的1 1 1三峰，异常峰超过2个，因此该 样本的21号染色体为3体；所有18和13号染色体特异STR位点的等位基因峰为单峰或 1 1双峰，因此该样本的18和13号染色体为正常的二倍体；所有X染色体特异STR位点 为单峰，并且AMXY的峰面积总和与D21S11峰面积总和2/3的比值约为1 1，因此该样本 含1个X和1个Y染色体；综合上述分析，该样本为男性21三体。实施例五一个产前筛查高风险胎儿羊水标本的QF-PCR检测参照图4所示，应用实施例一的方法，对一个唐氏筛查高风险胎儿的羊水样本 1. 2mL 提取 DNA，共获得 45 μ L 浓度 17. 5ng/ μ L 的 DNA，0D260/280 比值 1. 95，为合格 DNA 样 本。各取3μ L DNA进行A、B、C三组PCR反应及片段分析。GeneMapper软件对收集到的荧 光数据分析结果见表7 表7GeneMapper软件对一名健康女性的QF-PCR荧光信号的数据分析结果 该样本的所有等位基因峰荧光信号强度均介于500-8000之间，荧光信号强度适
合进行核型判断；性别判定基因AMXY显示1 1(AMX AMY)双峰，男性特异基因SRY有扩
增峰，因此该样本有等量的X和Y染色体；所有21和13号染色体特异STR位点的等位基因峰为单峰或1 1双峰，因此该样本的21和13号染色体为正常的二倍体；所有18号染色 体特异STR位点的等位基因峰为单峰、异常的1 2双峰或异常的1 1 1三峰，异常峰 有2个，因此该样本的18号染色体为3体；所有X染色体特异STR位点为单峰，并且AMXY 的峰面积总和与D21S11峰面积总和的比值约为1 1，因此该样本含1个X和1个Y染色 体；综合上述分析，该样本为男性18三体。实施例六一个产前筛查高风险胎儿绒毛标本的QF-PCR检测 参照图5所示，应用实施例一的方法，对一个唐氏筛查高风险胎儿的绒毛样本1根 提取DNA，共获得45 μ L浓度24ng/ μ L的DNA，0D260/280比值1. 83，为合格DNA样本。各 取2yL DNA进行A、B、C三组PCR反应及片段分析。GeneMapper软件对收集到的荧光数据 分析结果见表8:表SGeneMapper软件对一份高风险胎儿绒毛标本的QF-PCR荧光信号的数据分析
结果 该样本的所有等位基因峰荧光信号强度均介于500-8000之间，荧光信号强度适 合进行核型判断；性别判定基因AMXY显示1个单峰(AMX)，男性特异基因SRY无扩增峰，因 此该样本只有X染色体；所有21和18号染色体特异STR位点的等位基因峰为单峰或1 1 双峰，因此该样本的21和18号染色体为正常的二倍体；所有13号染色体特异STR位点的 等位基因峰为单峰、异常的1 2或2 1的双峰、或异常的1 1 1三峰，异常峰超过 2个，因此该样本的13号染色体为3体；所有X染色体特异STR位点为单峰或1 1双峰， 并且AMX的峰面积与D21S11峰面积总和的比值约为1 1，因此该样本含2个X染色体； 综合上述分析，该样本为女性13三体。实施例七一个产前筛查高风险胎儿羊水标本的QF-PCR检测参照图6所示，应用实施例一的方法，对一个唐氏筛查高风险胎儿的羊水样本 1. 2mL提取DNA，共获得45 μ L浓度16ng/ μ L的DNA，0D260/280比值1. 79，为合格DNA样 本。各取3 μ L DNA进行A、B、C三组PCR反应及片段分析。GeneMapper软件对收集到的荧 光数据分析结果见表7 表9GeneMapper软件对一名健康女性的QF-PCR荧光信号的数据分析结果 该样本的所有等位基因峰荧光信号强度均介于500-8000之间，荧光信号强度适 合进行核型判断；性别判定基因AMXY显示1个单峰(AMX)，男性特异基因SRY无扩增峰，因 此该样本只有X染色体；所有21、18和13号染色体特异STR位点的等位基因峰为单峰或 1 1双峰，因此该样本的21、18和13号染色体为正常的二倍体；所有X染色体特异STR位 点均为单峰，并且AMX的峰面积只有D21S11峰面积总和的1/2，因此该样本只含1个X染色 体；综合上述分析，该样本为45，X Turner综合症核型。SEQUENCE LISTING<110>广州市妇女儿童医疗中心
<120> 一个快速诊断染色体数目异常的多重QF-PCR STR检测体系<160>22<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>106<212>DNA<213> 人(Homo sapiens)<220><221>non-polymorphism<222>(1). . (106)<223>X-linked, used for sex determination<400>1ccctgggctc tgtaaagaat agtgtgttga ttctttatcc cagatgtttc tcaagtggtc 60ctgattttac agttcctacc accagcttcc cagtttaagc tctgat106<210>2<211>112<212>DNA<213> 人(Homo sapiens)<220><22l>non-polymorphism<222>(1). . (112)<223>Y-linked, used for sex determination<400>2ccctgggctc tgtaaagaat agtgggtgga ttcttcatcc caaataaagt ggtttctcaa 60gtggtcccaa ttttacagtt cctaccatca gcttcccagt ttaagctctg at112<210>3<211>155<212>DNA<213> 人(Homo sapiens)<220><221>polymorphism<222>(22). . (84)<223>short tandem repeat (STR) on chromosome 22, polymorphic, with’ gata' as a repeat unit.<400>3caccccttta tacttggctg tgatagatag atagatagat agatagatag atagatagat 60agatgataga tagatagata gatagacaga cagatagata gagggataga tggatggtag 120agtactatta taaggaattg gctcatgtga ttctg155<210>4
<211>205<212>DNA<213> 人(Homo sapiens)<220><221>polymorphism<222>(32). . (177)<223>short tandem repeat (STR) on chromosome 22, polymorphic, with，gaaa，as a repeat unit.<400>4ggagctgaag aacctgccta gaaaaataag agaaagaaag agagaaagag agagagagaa 60gaaagcaaga agaagaaaga aaaaggaaag aaaaagaaag aaagaaagaa agaaagaaag 120aaagaaagaa agaaagaaag aaagaaagaa aagaaaagaa aagaaaagag tagaaaggag 180ggcaggaagg aagaggggag gagac205<210>5<211>271<212>DNA<213> 人(Homo sapiens)<220><221>polymorphism<222>(94). . (151)<223>short tandem repeat (STR) on chromosome 13, polymorphic, with，agat，as a repeat unit.<400>5acctgccaaa ttttaccagg aggagaggga ctacccagac agagcaagca attcagtaaa 60tacacggagt cattcttaaa atagacagat agaagataga tgatagatga tgatagatag 120atagagagat gatagatgat gatagataga tagagagatg atagatggat ggatagatag 180atagatagat agatagatag atagatagat agatagatga tagatagaga tagatataga 240atatcttatt ggtttattcc ctctctctgt c271<210>6<211>298<212>DNA<213> 人(Homo sapiens)<220><22l>polymorphism<222>(146). . (238)<223>short tandem repeat (STR) on chromosome22, polymorphic, with，taga，as a repeat unit.<400>6atgatgaatg catagatgga tgggtggatg gatggatgga tggatggatg gatggatgga 60
tggatgaatg gatacataga tgaatggatg gatagatagt atataaatgg atggatggat 120agatacacag taggtaggta ggtagtagat agatagatag atagatagat agatagatag 180atagatagat aaacaggata gatagataga tagatagata gatagataga tagatagata 240aacaggatga atatttagaa ggctgggagt gggcagaaag cctggaagga eacacatt298<210>7
<211>346<212>DNA〈213〉人(Homo sapiens)〈220〉<221>polymorphism〈222〉(185) · . (322)<223>short tandem repeat (STR) on chromosome 22, polymorphic, with，gata/gaca' as a repeat unit.<400>7aaattagtgt ctggcaccca gtaaaaaatt actagccata aacactgaga agggagaaac 60actgtaaggt tttatataat gtatgaagtg gtatgatata acttgaaatt aaactgtgat 120atattaaaga tgttgtatta gtcaatgttc tccagagaca gactaatagg aggtagatag 180actggataga tagacgatag atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag 240atatggatag atagatgata gatagataga tatagataga tagacagaca gacagacaga 300
cagacagata gatagataga tagaaggcaa ttcacttggg gaattg346
<210>8<211>479<212>DNA〈213〉人(Homo sapiens)〈220〉<221>polymorphism〈222〉(174) · . (436)<223>short tandem repeat (STR) on chromosome 22, polymorphic, with， tatc， as a repeat unit，not perfect repeat.<400>8cggacgctgg ctaagcccca tcgccttatc tttattttgt gagaagcaaa ctgtggggtt 60tggttgcaag agaagatctt actagggacc agttgcaggg tgtattaatc aggggtttcc 120agagaaacag aactaatagg atctatctgc ctgtcatctc tctctctctc tcctatctat 180ctatctatct atctatcatc tatctatcta tcatctatct atctatctat ctatctatct 240atctatcatc taatctatca tctatctatc tattcatcat ctatttatca actatcatct 300ctcatctatc aactatttgt ttgccatcta ttatctatct atcatctatt tatctattaa 360tcatctattt attaactatc aatctatcat ctgtcatcca tcaactattt atctgtctat 420ccattctcta tctatctgtc tctctgtctg tcaatcagtc agtcaatcca tcgccagaa 479<210>9
<211>133
<212>DNA<213> 人(Homo sapiens)<220><221>polymorphism<222>(38). . (110)<223>short tandem repeat (STR) on chromosome 18, polymorphic, with，taga' as a repeat unit.<400>9tcatgtgaca aaagccacac ccataacttt tttcctctag atagacagat agatgataga 60tagatagata gatagataga tagatagata gatagataga tagatataga ttctctttct 120ctgcattctc ate133<210>10<211>182<212>DNA<213> 人(Homo sapiens)<220><221>polymorphism<222>(92). . (131)<223>short tandem repeat (STR) on chromosome 18, polymorphic, with’ taga' as a repeat unit.<400>10ctggttttcg tcttgagaag tcatgaggtg gacttaccac aggcaatgtg acttgaggaa 60gagagaaata gagagataga gatgatatac atagatagat agatagatag atagatagat 120agatagatag ataatgataa atcaggaatt taattagctg agtgactcag atgggaatag 180tg 182<210>11<211>306<212>DNA<213> 人(Homo sapiens)<220><221>polymorphism<222>(58). . (163)<223>short tandem repeat (STR) on chromosome 18, polymorphic, with’ gaaa' as a repeat unit.<400>11gagccatgtt catgccactg cacttcactc tgagtgacaa attgagacct tgtctcagaa 60agaaagaaag aaagaaagaa agaaagaaag aaagaaagaa agaaagaaag aaagaaagaa 120agaaagaaaa agagagagga aagaaagaga aaaagaaaag aaatagtagc aactgttatt 180
gtaagacatc tccacacacc agagaagtta attttaattt taacatgtta agaacagaga 240gaagccaaca tgtccacctt aggctgacgg tttgtttatt tgtgttgttg ctggtagtcg 300
ggtttg306<210>12<211>365<212>DNA<213> 人(Homo sapiens)<220><221>polymorphism<222>(57). . (215)<223>short tandem repeat (STR) on chromosome 18, polymorphic, with，aaag，as a repeat unit, not perfect repeat.<400>12tcaggagaat cacttggaac ccccagcctg ggcaacagag tgagatttca tctgtaaaag 60aaagaaagca agcaaaagaa agagaaagag agagaggaaa gaaggaagga aggaagg aag 120caaggaagga gaaagagaga gcgagagaaa gaaagaaaaa agaaagaaag aaaagaaaga 180aagaaagaga gagagaaaga aagaatgaaa aaagaaaaaa gaaagaaaga aagaagaaag 240aaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaaa 300gaaagaaaga aaaagaaaaa aaatcagagg gtgcgtagat tctacctgct tagctacttc 360atgga365<210>13<211>401<212>DNA<213> 人(Homo sapiens)<220><221>polymorphism<222>(264). . (356)<223>short tandem repeat (STR) on chromosome 13, polymorphic, with，gaaa as a repeat unit.<400>13agctactcag gaggccaatg caggaggatt acttcagctc aggagtttga gtccagcctg 60gtcaacacag agagacctag tctcttaaaa aataaaaatt aagaacaaat aaaataaaaa 120tcttattcca gataactggg ctaggaatgg aaataggttg tacacccatt gtcttttaaa 180aaagagaaag aaagaaagag aaagagagaa agaaagagag aaagagagag agggaaagag 240agaaagagaa agagagagaa agagaaagaa agaaaggaaa gaaagaaaga aagaaagaaa 300gaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaag gaaagagaaa gagaaatgaa 360tgcaaattct ctggccccag cccagtcctc ctgaattggg a401<210>14<211>428
<212>DNA<213> 人(Homo sapiens)<220><221>polymorphism<222>(114). . (294)<223>short tandem repeat (STR) on chromosome 13,polymorphic, with，gaaa，as a repeat unit.<400>14ccattgccct atctttaagt ttgctaattc tttattatat ctattcaaat ctcctttgaa 60tcctatatta tgattcttca gataggcaga ttcaatagga taaatagaca gatgaaagaa 120agaaagagag agagagaaag agagagagag aaagagagag aaagagagag aaagaaagag 180aaagaaagag agaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaaggaa gaaaggaaga 240aagaaaagaa agaaagagaa aggaaggaag gaaagaagga aggaaggaaa gaaagatgac 300agatgactaa ataggggaat tggctcatat gattacagag gttgagaact ctcacaatag 360tctgcaaact ggagaaccag gaaagccagt agtgtggcaa cattcaaatc caaaaagcct 420cagcacca428<210>15<211>451<212>DNA<213> 人(Homo sapiens)<220><221>polymorphism<222>(105). . (374)<223>short tandem repeat (STR) on chromosome 13, polymorphic, with，gaaa，as a repeat unit, not perfect repeat.<400>15acggcactcc agattgggtg acagagtgac atcgctcctt accccatctt ctccaaaaaa 60aaaagaaaga aagaaggaag gaaggaaggg agggagggaa ggaggaagga aagaaaggaa 120ggaaggagga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaga gagagagaaa gaaagaaagt 180aaagaaagaa agaaggaaag aaagaaagag aaagaagaaa aaagaaagaa agaaaaagag 240gaaggaagga aggaagaaaa gagaaagaga aagaaagaaa caaggaaagg aggaaagaaa 300gaaaaagaaa gaaagagaaa gaaaaaaaga aagagaagaa agaaagaaag aaagaaagaa 360agaaagaaaa gaaagaatac ataaacatag tgaggagaat ggtggttagc aaaggctggg 420aaggataaca gaaaggggga gacaaagtgg g451<210>16<211>155<212>DNA<213> 人(Homo sapiens)<220>
<221>polymorphism<222>(39). . (113)
<223>X_linked short tandem repeat (STR), polymorphic, with' tatc，as arepeat unit.<400>16tggagaaagt cactgaacag aggagttgca acccagaata tctatctatc tatctattta 60tctatctatc tatctatcta tctatctatc tatctatcta tcatctatct atcgattgag 120agagatggct tttcattgag tagctgaaag gtgcc155<210>17<211>225<212>DNA<213> 人(Homo sapiens)<220><221>polymorphism<222>(30). . (203)<223>X_linked short tandem repeat (STR), polymorphic, with' gaa，as arepeat unit.<400>17ccacttcatg gcttaccaca gagagaggag aagaaggaga aggaggagaa ggagaagaag 60aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag 120aagaagaaga agaagaagaa gaggaagagg aagaggaaga ggaagaggaa gaggaagaag 180aagaggaaga agaagaagaa gaagacaggg aacgaaggag caaaa225<210>18<211>248<212>DNA<213> 人(Homo sapiens)<220><22l>non-polymorphism<222>(1). . (248)<223>Y_linked, used for male sex determination<400>18agtaaaggca acgtccagga tagagtgaag cgacccatga acgcattcat cgtgtggtct 60cgcgatcaga ggcgcaagat ggctctagag aatcccagaa tgcgaaactc agagatcagc 120aagcagctgg gataccagtg gaaaatgctt actgaagccg aaaaatggcc attcttccag 180gaggcacaga aattacaggc catgcacaga gagaaatacc cgaattataa gtatcgacct 240cgtcggaa248<210>19<211>279<212>DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<220><221>polymorphism<222>(80). . (232)<223>X_linked short tandem repeat (STR), polymorphic, with' gata，as arepeat unit.<220><221>polymorphism<222>(99). . (233)<223>polymorphic, with，atag，as a repeat unit.<400>19ggaggaccat gtttcactgg aatataaaat gtctggagaa tccaattttg ctttaggctg 60atgtgaggaa gagatagagg atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag 120atagatagat agatgataga taatagatag atagatagat agatgataga tagataatag 180atgatagata gatagatata gatagataga tagatagata gatagataga tagcccaaat 240tcctacataa tctagtcatg ccctcagtat tcctgagct279<210>20<211>321<212>DNA<213> 人(Homo sapiens)<220><221>polymorphism<222>(175). . (229)<223>X_linked short tandem repeat (STR), polymorphic, with' tatc，as arepeat unit.<400>20catggttctc cttgtggcct tccttaaatg gaaaaacaag gtaacaaagg ggaaacctct 60ggttccagag gaaaagaagt agacatactt ctcgtttcct cctgcaaaat acagctaaaa 120acttggaatg atatacatct atatctgtat agagaactat ctatttatct tttatatcta 180tctatctatc tatctatcta tctatctatc tatctatcta tcatctatct gactctgaaa 240agtggagaga agaaggcaga ccagctaaga aacacaggac tcaaggaaca atatggtggt 300gacttccttg ggtgctggag a321<210>21<211>396<212>DNA<213> 人(Homo sapiens)<220><221>polymorphism<222>(99). . (314)
<223>short tandem repeat (STR) on chromosome 13, polymorphic, with，tttc，as a repeat unit，not perfect repeat.<400>21gccacctcga aatcctaggc ttgagtaatc ctcccacctc agcctcccaa gtagttgaga 60ttacaagcat gcaacaccat gcatgtgtgc tctttcgctt tctttctttc tttctttctt 120
tctttctttc tttctttctt tctttctttc tttctttctt tctctttctt tttctttctt 180tctttttctt tccttctttc tttctttctc tttctttttc tttctttctt tcttt ttctt 240tccttccttc tttctttttc ttccttcctt cctttcttcc ttctttcctt cctttctttt 300tctttctttc tttccttcct tccttccttc catccttctt tccttccttc ctccctccct 360ctgtcccttc cttccttcca ttcattcgta acgaca396<210>22<211>485<212>DNA〈213〉人(Homo sapiens)〈220〉<221>polymorphism〈222〉(167) · . (313)<223>short tandem repeat (STR) on chromosome 22, polymorphic, with' tcta as a repeat unit.<400>22tggcctcaaa ctgaaggtta cactatcagc ttccgttgtt ctaagggctt cagacttgga 60cagccacact gccagcttcc ctgattcttc agcttgtaga tggtctgtta tgggactttt 120ctcagtctcc ataaatatgt gagtcaattc cccaagtgaa ttgccttcta tctatctatc 180tatctgtctg tctgtctgtc tgtctgtcta tctatctata tctatctatc tatcatctat 240ctatccatat ctatctatct atctatctat ctatctatct atctatctat ctatcgtcta 300tctatccagt ctatctacct cctattagtc tgtctctgga gaacattgac taatacaaca 360tctttaatat atcacagttt aatttcaagt tatatcatac cacttcatac attatataaa 420accttacagt gtttctccct tctcagtgtt tatggctagt aattttttac tgggtgccag 480acact48权利要求
一种快速诊断染色体数目异常的多重QF-PCR STR检测体系，其特征在于包含A、B、C三组多重PCR体系，A组为引物经荧光标记的8重PCR体系，检测位点包含性别判断基因AMXY，6个21号染色体特异STR位点D21S1433、D21S1411、D21S1414、D21S1412、D21S1445和一个位于21q11.2的未命名的STR位点，及1个13号染色体特异STR位点D13S258；B组为引物经荧光标记的8重PCR体系，检测位点包含性别判断基因SRY，4个18号染色体特异STR位点D18S535、D18S391、D18S51和D18S386，及3个13号染色体特异STR位点D13S742、D13S634和D13S303；C组为引物经荧光标记的9重PCR体系，检测位点包含性别判断基因AMXY和SRY，5个X染色体特异STR位点DXS1187、DXS8377、DXS6809、DXS981和DXS1053，1个13号染色体特异STR位点D13S305，及1个21号染色体特异STR位点D21S11。
2.根据权利要求1所述的一种快速诊断染色体数目异常的多重QF-PCRSTR检测体系， 其特征在于靶向21号染色体特异STR位点D21S1412、D21S1445和D21S11，以及一个还未 经命名的位于21qll. 2的新STR位点的PCR引物序列，靶向18号染色体特异STR位点，靶 向13号染色体特异STR位点D13S742、D13S634、D13S303和D13S305的PCR引物序列，靶向 X 染色体特异 STR 位点 DXS1187、DXS8377、DXS6809、DXS981 和 DXS1053 的 PCR 引物序列。
3.根据权利要求1所述的一种快速诊断染色体数目异常的多重QF-PCRSTR检测 体系，其特征在于所述A组的STR多态位点的PCR产物大小范围在大部分个体不重叠， 但D21S1433与21qll. 2的PCR产物等位基因峰在某些个体中可能出现重叠，D13S258与 D21S1411的PCR产物等位基因峰在某些个体中可能出现重叠，这两对位点的不同标记可使 PCR产物峰区分开。
4.根据权利要求1所述的一种快速诊断染色体数目异常的多重QF-PCRSTR检测体系， 其特征在于所述B组的STR多态位点的PCR产物大小范围在大部分个体不重叠，D18S386 与D13S742的PCR产物等位基因峰在某些个体中可能出现重叠，D13S634与D13S303的PCR 产物等位基因峰在某些个体中可能出现重叠，这两对位点的不同标记可使PCR产物峰区分 开。
5.根据权利要求1所述的一种快速诊断染色体数目异常的多重QF-PCRSTR检测体系， 其特征在于所述C组的STR多态位点的PCR产物大小范围在大部分个体不重叠，而非多态 的SRY及多态的DXS981与组内其他位点的不同标记可使结果分析更方便。
6.根据权利要求1所述的一种快速诊断染色体数目异常的多重QF-PCRSTR检测体系， 其特征在于所述 A 组的 PCR 体系各引物AMXY、D21S1433、D21S1411、D13S258、D21S1414、 D21S1412、D21S1445 和 21qll. 2，在 PCR 反应液中的终浓度分别为 0. 1,0. 2,0. 2,0. 3,0. 4、 0. 4,0. 1 和 0. 35 μ M0
7.根据权利要求1所述的一种快速诊断染色体数目异常的多重QF-PCRSTR检测体 系，其特征在于所述B组的PCR体系各引物D18S535、D18S391、SRY、D18S51、D18S386、 D13S742、D13S634和 D13S303，在PCR反应液中的终浓度分别为 0. 2,0. 2,0. 2,0. 1,0. 4,0. 5、 0.4 禾Π 0.4 μ Μ。
8.根据权利要求1所述的一种快速诊断染色体数目异常的多重QF-PCRSTR检测体系， 其特征在于所述 C 组的 PCR 体系各引物AMXY、DXSl 187、DXS8377、SRY、DXS6809、DXS981、 DXS1053、D13S305 和 D21S11，在 PCR 反应液中的终浓度分别为 0. 1,0. 15,0. 15,0. 2,0. 2、`0. 3、0·2、0· 3 和 0· 5 μ Μ。
全文摘要
本发明提供一种快速诊断染色体数目异常的多重QF-PCR STR检测体系，其包含A、B、C三组PCR体系，A组检测位点包含AMXY、D21S1433、D21S1411、D13S258、D21S1414、D21S1412、D21S1445和21q11.2；B组检测位点包含D18S535、D18S391、SRY、D18S51、D18S386、D13S742、D13S634和D13S303，C组检测位点包含AMXY、DXS1187、DXS8377、SRY、DXS6809、DXS981、DXS1053、D13S305和D21S11，通过此套STR位点足够多、STR位点杂合率高的快速检测体系，用在产前诊断可大为缩短诊断时间，为临床医生及时处理争取宝贵时间，是一个实用性极高的产前诊断方法。
文档编号C12Q1/68GK101838689SQ201010019380
公开日2010年9月22日 申请日期2010年1月14日 优先权日2010年1月14日
发明者廖灿, 杨昕, 梁巧仪, 黄以宁 申请人:广州市妇女儿童医疗中心