用于使用纤维素进行同时糖化和发酵的表达纤维素酶的酵母的利记博彩app

专利名称：用于使用纤维素进行同时糖化和发酵的表达纤维素酶的酵母的利记博彩app
用于使用纤维素进行同时糖化和发酵的表达纤维素酶的酵母
背景技术：
木质纤维素生物质被广泛认为是用于生产可再生燃料和化学品的有前景的原材料来源。阻碍从生物质原料更广泛地产能的主要障碍是普遍缺乏用于克服这些材料抗拒被转化为有用的燃料的低成本技术。木质纤维素生物质含有可以被转化为乙醇的碳水化合物级份(例如，纤维素和半纤维素)。为了转化这些级份，纤维素和半纤维素必须最终被转化或水解为单糖；长期以来恰恰是该水解被证明存在问题。生物介导的过程对于能量转化、尤其是将木质纤维素生物质转化为燃料是有前景的。涉及酶促或微生物水解的生物质加工方案通常包括四个生物介导的转化(1)分解糖的酶类(纤维素酶和半纤维素酶)的产生；( 存在于预处理的生物质中的碳水化合物成分水解为糖；C3)己糖(例如葡萄糖、甘露糖和半乳糖)的发酵；和(4)戊糖(例如木糖和阿拉伯糖)的发酵。这四个转化发生于被称作联合生物加工(CBP)的工艺配置中的单一步骤中，联合生物加工与其它的整合度较低的配制的区别在于其不涉及用于生产纤维素和 /或半纤维素的专门的工艺步骤。CBP提供了比特征在于专门的纤维素酶生产的方法成本更低且效率更高的潜在可能。有益之处部分来源于避免了与生产纤维素酶相关的资金成本、底物和其它原材料和工具。此外，使用CBP，数个因素支持实现较高速率的水解，因此减小了反应器的体积和资金投入，包括酶-微生物协同作用，以及使用噬热生物体和/或复合的纤维素酶系统。此外，纤维素粘附性的分解纤维素的微生物可能相对于非粘附性的微生物(例如污染物)成功地竞争纤维素水解的产物，这会增加基于微生物纤维素利用的工业方法的稳定性。通过以下两个策略在开发能够进行CBP的微生物方面取得了进展对天然存在的分解纤维素的微生物进行工程化以改善与产物相关的特征，例如产率和效价；以及对表现出高产物产率和效价的不分解纤维素的生物进行工程化以表达异源纤维素酶和半纤维素酶系统以实现纤维素和半纤维素的利用。天然纤维素降解需要三种主要类型的酶活性第1种类型是内切葡聚糖酶(1， 4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶；EC 3.2.1.4)。内切葡聚糖酶在无定形纤维素的纤维素多糖链中随机切割，产生不同长度的寡糖，从而产生新的链末端。第2种类型是外切葡聚糖酶，包括纤维糊精酶(1，4-β -D-葡聚糖葡聚糖水解酶；EC 3. 2. 1. 74)和纤维二糖水解酶(1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶；EC 3.2.1.91)。外切葡聚糖酶以渐进的方式作用于纤维素多糖链的还原末端或非还原末端，释放葡萄糖(葡聚糖水解酶)或纤维二糖(纤维二糖水解酶)作为主要产物。外切葡聚糖酶还可以作用于微晶纤维素，推测为使纤维素链从微晶结构上脱落下来。第3种类型是葡萄糖苷酶(β_葡萄糖苷葡萄糖水解酶； EC3. 2. 1. 21)。β -葡萄糖苷酶将可溶性纤维糊精和纤维二糖水解为葡萄糖单元。面包酵母(酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae)仍然是生产乙醇的优选微生物Hahn-Hagerdal, B 等人，Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 73, 53-84 (2001)) 该微生
物的有益特性包括(i)接近于理论产率的高生产力(所使用的每克葡萄糖产生0.51克乙醇)，(ii)高耐渗性和耐酒精性质，(iii)工业过程中的天然鲁棒性(robustness)，和(iv) 由于其长期与制酒和制面包以及酿啤酒接触，所以一般被认为是安全的(GRAQ。此外，酿酒酵母显示出对于由于生物质预处理而产生的通常存在于水解物中的抑制剂的耐受性。酿酒酵母的一个主要缺点在于其不能利用复合的多糖，例如纤维素，或其分解产物，例如纤维二糖和纤维糊精。在尝试解决这个问题时，已经将来自细菌和真菌来源的数种异源纤维素酶转移进入酿酒酵母，使其能够降解纤维质的衍生物(Van Rensburg, P.，等人，Yeast 14，67-76 (1998))，或使其能够在纤维二糖上生长(Van Rooyen，R.，等人，J. Biotech. 120,284-295(2005)) ；McBride, J. E.，等人，Enzyme Microb. Techol. 37, 93-101 000 )。然而，目前在酵母中异源表达的纤维素酶的表达水平和比活性的水平仍然不足以使酵母能够在不外部添加酶的情况下有效地在纤维质底物上生长并产生乙醇。仍然显著需要改善纤维素酶活性的量以实现能够有效且成本划算地将纤维质底物转化为乙醇的联合生物加工(CBP)系统的目标。使用酿酒酵母的另一个主要缺点在于外部添加的纤维素酶的最适作用温度高于酿酒酵母的最适作用温度。因此，情况是要么在两个不同的温度通过两个步骤的过程进行该过程，要么选定一个温度，在该温度时，两个过程都在一定程度上发挥作用，但是至少其中一个过程不是在最佳效率进行。为了解决这些局限性，本发明提供了野生型和密码子优化的异源纤维素酶的组合在酵母中的异源表达，其允许有效地从纤维素来源产生乙醇。本发明还提供了此类异源纤维素酶在耐热的酵母中的表达以及使用此类转化的酵母来生产乙醇的方法。发明概述本发明涉及分解纤维素的宿主细胞。本发明的宿主细胞表达异源纤维素酶并且能够从纤维素生产乙醇。具体地，在一些实施方式中，本发明提供了包含含有编码纤维素酶的核酸的至少一个异源多核苷酸的耐热的酵母宿主细胞，其中，当使用纤维素作为碳源生长时，所述酵母宿主细胞能够产生乙醇。在另一个实施方式中，本发明提供了转化的耐热的酵母宿主细胞，其包含(a)至少一个包含编码内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸；(b)至少一个包含编码葡萄糖苷酶的核酸的异源多核苷酸；(c)至少一个包含编码第一纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸；和(d)至少一个包含编码第二纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸。在另一个实施方式中，本发明提供了转化的酵母宿主细胞，其包含(a)至少一个包含编码纤维素酶的核酸的异源多核苷酸，其中所述纤维素酶是内切葡聚糖酶；(b)至少一个包含编码纤维素酶的核酸的异源多核苷酸，其中所述纤维素酶是β -葡萄糖苷酶；(C) 至少一个包含编码纤维素酶的核酸的异源多核苷酸，其中所述纤维素酶是第一纤维二糖水解酶；和(d)至少一个包含编码纤维素酶的核酸的异源多核苷酸，其中所述纤维素酶是第二纤维二糖水解酶，其中所述纤维素酶中的至少两种被细胞分泌。在另一个实施方式中，本发明提供了包含至少六种异源多核苷酸的转化的酵母宿主细胞，其中每种异源多核苷酸包含编码纤维素酶的核酸。在另一个实施方式中，本发明提供了包含至少四种异源多核苷酸的转化的酵母宿主细胞，其中每种异源多核苷酸包含编码内切葡聚糖酶的核酸。
在另一个实施方式中，本发明提供了包含至少两种酵母宿主细胞的共培养物，其中(a)所述宿主细胞中的至少一种包含含有编码纤维素酶的核酸的第一异源多核苷酸， 其中所述纤维素酶是内切葡聚糖酶；(b)所述宿主细胞中的至少一种包含含有编码纤维素酶的核酸的第二异源多核苷酸，其中所述纤维素酶是β-葡萄糖苷酶；(c)所述宿主细胞中的至少一种包含含有编码纤维素酶的核酸的第三异源多核苷酸，其中所述纤维素酶是第一纤维二糖水解酶；(d)所述宿主细胞中的至少一种包含含有编码纤维素酶的核酸的第四异源多核苷酸，其中所述纤维素酶是第二纤维二糖水解酶；其中所述第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸和第四多核苷酸不在同一宿主细胞中；并且其中所述共培养物能够从纤维素产生乙醇。在本发明的一些具体实施方式
中，所述纤维素碳源是不可溶的纤维素，晶体纤维素，衍生自木质纤维素、硬木、磷酸膨胀纤维素或微晶纤维素的纤维素。在一些实施方式中，本发明的宿主细胞包含含有编码第一纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸，包含编码内切葡聚糖酶的核酸的多核苷酸，包含编码葡萄糖苷酶的核酸的多核苷酸，和/或包含编码第二纤维二糖水解酶的核酸的多核苷酸。在一些实施方式中，纤维素酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶或纤维二糖水解酶是灰腐质霉(H. grisea)、嗜热子囊菌(T. aurantiacus)、埃默森篮状菌(T. emersonii)、 里氏木霉(T. reesei)、澳洲乳白蚁(C. Iacteus)、台湾家白蚁(C. formosanus)、高山象白蚁(N. takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C. acinaciformis)、达尔文澳白蚁 (M. darwinensis)、N. walkeri、扣囊复膜酵母菌(S. fibuligera)、C. Iucknowense> 黄胸散白蚁(R. speratus)、嗜热放线菌(Thermobfidafusca)、热纤梭菌(Clostridum thermocellum)、解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridum josui)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilis)、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas f imi)、 Saccharophagusdegradans、 Piromyces equii、 Neocallimastix patricarum、 白曲霉(Aspergillus kawachii)、舌甘菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)、红褐肉座菌(H. jecorina)、Orpinomyces 属、白囊奉巴齿菌(Irpex lacteus)、 嗜热枝顶抱(Acremonium thermophilum)、费希新萨托菌(Neosartoryafischeri)、球毛壳菌 (Chaetomium globosum)、嗜热毛壳菌(Chaetomiumthermophilum)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、土曲霉(Aspergillusterreus)、粗糙脉孢菌(Neurospora Crassa)或拟南芥 (Arabidopsisthaliana)的纤维素酶、内切葡聚糖酶、β _葡萄糖苷酶或纤维二糖水解酶。在一些具体的实施方式中，纤维二糖水解酶是灰腐质霉(H. grisea) CBHl、嗜热子囊菌(T. aurantiacus) CBHl、埃默森篮状菌(T. emersonii) CBHl、里氏木霉(T. reesei) CBH1、埃默森篮状菌(T. emersonii)CBH2、C. Iucknowense CBH2 或里氏木霉(T. reesei) CBH2。在一些实施方式中，包含编码纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸编码包含纤维二糖水解酶和纤维素结合模块(CBM)的融合蛋白。在一些具体实施方式
中，所述CBM是里氏木霉(T. reesei) CBH2 的 CBM、里氏木霉(T. reesei) CBHl 的 CBM 或 C. Iucknowense CBH2b 的 CBM。在一些具体实施方式
中，所述CBM通过连接子序列与所述纤维二糖水解酶融合。在一些具体实施方式
中，宿主细胞表达第一和第二纤维二糖水解酶，其中所述第一纤维二糖水解酶是埃默森篮状菌CBHl和CBD融合物，并且所述第二纤维二糖水解酶是C. Iucknowense CBH2b。
在其它具体的实施方式中，所述β -葡萄糖苷酶是扣囊复膜酵母菌葡萄糖苷酶。在另一具体的实施方式中，所述内切葡聚糖酶是台湾家白蚁(C. formosanus)内切葡聚糖酶。在另一具体的实施方式中，所述内切葡聚糖酶是里氏木霉(T.reesei)内切葡聚糖酶，例如里氏木霉EG2。在本发明的一些实施方式中，纤维素酶中的至少一种或至少两种是附着的。在本发明的其他实施方式中，纤维素酶中的至少一种是分泌的。在另一个实施方式中，纤维素酶中的至少一种是附着的，并且纤维素酶中的至少一种是分泌的。在另一个实施方式中，所有的纤维素酶都是分泌的。在本发明的一些实施方式中，编码纤维素酶的核酸是密码子优化的。在一些实施方式中，宿主细胞可以是耐热的宿主细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、密西西比毕赤酵母(Pichia mississippiensis)、墨西哥毕赤酵母(Pichiamexicana)、粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)、仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)、葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)、墨西哥假丝酵母(Candida mexicana)、多形汉逊酵母 (Hansenulapolymorpha)或克鲁维酵母属(Kluveryomyces)宿主细胞。例如，在一些实施方式中，宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(K. Iactis)或马克斯克鲁维酵母(K. marxianus)的宿主细胞。在一些实施方式中，耐热的宿主细胞是酿酒酵母宿主细胞，并且其中酿酒酵母被选择为耐热的。在一些实施方式中，宿主细胞可以是油质的酵母细胞。在一些具体的实施方式中，油质的酵母细胞是布拉氏霉菌属(Blakeslea)、假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属 (Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属 (Mortierella)、白霉属(Mucor)、须霉属(Phycomces)、腐霉属(Pythium)、红冬孢酵母属 (Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、丝孢酵母属(Trichosporon)或耶罗威亚酵母属(Yarrowia)的细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是酿酒酵母细胞。在一些具体的实施方式中，宿主细胞能够在大约30°C、35°C、37°C、42°C、45°C或 500C以上的温度从纤维素产生乙醇。在另一个具体的实施方式中，宿主细胞能够以至少大约IOmg/小、时/升、至少大约30mg/小、时/升、至少大约40mg/小时/升、至少大约50mg/小时/升、至少大约60mg/ 小时/升、至少大约70mg/小时/升、至少大约80mg/小时/升、至少大约90mg/小时/升、至少大约IOOmg/小时/升、至少大约200mg/小时/升、至少大约300mg/小时/升、至少大约 400mg/小时/升、至少大约500mg/小时/升、至少大约600mg/小时/升、至少大约700mg/ 小时/升、至少大约800mg/小时/升、至少大约900mg/小时/升或至少大约Ig/小时/升的速度产生乙醇。本发明还提供了使用本发明的宿主细胞和共培养物的方法。例如，本发明还涉及水解纤维质底物的方法，包括将所述纤维质底物与本发明的宿主细胞或共培养物接触。本发明还涉及发酵纤维素的方法，包括在含有不可溶的纤维素的培养基中，在合适的条件下将本发明的宿主细胞或共培养物培养足以允许纤维素糖化和发酵的时间。在一些具体的实施方式中，该方法还包括将纤维质底物与外部产生的纤维素酶接触。
在本发明的一些具体方法中，纤维质底物是选自下列的木质纤维素生物质草、柳枝稷、大米草(cord grass)、黑麦草、草声(reedcanary grass)、芒草(miscanthus)、糖力口工残渣、甘蔗渣、农业废弃物、稻草、稻壳、大麦秸秆、玉米棒、谷物秸秆、小麦秸秆、芸苔秸秆、 燕麦秸秆、燕麦壳、玉米纤维、秣草、大豆秸秆、玉米秸秆、林业废弃物、再生木浆纤维、造纸淤泥、锯屑、硬木、软木、Agave、及其组合。在本发明的一些具体方法中，宿主细胞或共培养物产生乙醇。乙醇可以以下列速度产生至少大约IOmg/小、时/升、至少大约30mg/小时/升、至少大约40mg/小时/升、 至少大约50mg/小时/升、至少大约60mg/小时/升、至少大约70mg/小时/升、至少大约 80mg/小时/升、至少大约90mg/小时/升、至少大约IOOmg/小时/升、至少大约200mg/ 小时/升、至少大约300mg/小时/升、至少大约400mg/小时/升、至少大约500mg/小时/ 升、至少大约600mg/小时/升、至少大约700mg/小时/升、至少大约800mg/小时/升、至少大约900mg/小时/升或至少大约Ig/小时/升。在本发明的其它具体的方法中，宿主细胞或共培养物在至少大约37°C、至少大约 42°C、大约42°C至大约45°C，或大约42°C至大约50°C的温度与纤维质底物接触。


图1显示了用于检测经异源纤维素酶转化的乳酸克鲁维酵母(菌落编号1-8)和马克斯克鲁维酵母(菌落编号9-16)中的内切葡聚糖酶I活性的CMC平板检验的图。菌株8和16是未经转化的阴性对照。左侧的平板显示菌落生长，右侧的平板显示由清除区 (clearance zone)的存在指示的CMC酶活性。清除区在图中显示为白色斑点。图2显示了用于检测经异源纤维素酶转化的马克斯克鲁维酵母株中的CBHl活性的MU-Iac检验的结果。图3显示了由数种表达异源纤维素酶的马克斯克鲁维酵母株转化的Avicel的百分率。图4显示了由数种表达异源纤维素酶的马克斯克鲁维酵母株从Avicel产生/消耗的乙醇。图5显示了表达异源纤维素酶的酿酒酵母在细菌微晶纤维素(BMCC)上的生长。图6显示了由表达异源纤维素酶的酿酒酵母菌株从Avicel产生的乙醇。图7显示了由表达异源纤维素酶的酿酒酵母菌株从经过预处理的硬木(5%基于干重百分率)产生的乙醇。图8显示了在存在多个浓度的外部添加的纤维素酶的情况下，由表达异源纤维素酶的酿酒酵母从经过预处理的硬木(5%基于干重百分率)产生的乙醇。图9显示了在YP培养基和YNB培养基中，由M0288 (圆圈)和对照菌株(三角形) 从Avicel产生的乙醇。图10显示了使用补充了外部纤维素酶的酿酒酵母，通过小规模的同时糖化和发酵(SSF)过程从Avicel (15%基于干重百分率)产生的乙醇产率。将来自表达异源纤维素酶的酵母菌株(M(^88)的产率与来自对照菌株(M0M9)的产率在多个外部纤维素浓度下在 150小时的时间内进行比较(100%纤维素酶载量表示25mg/g总固体；最初的固体浓度是 15% )。
图11显示了使用补充了外部纤维素酶的酿酒酵母，通过同时糖化和发酵(SSF)过程产生了理论乙醇产率。将来自表达异源纤维素酶的酵母菌株(M(^88)的产率与来自对照菌株(M0M9)的产率进行比较。图12显示了基于168小时的同时糖化和发酵(SSF)过程的乙醇产率的预测的纤
维素酶节省。图13显示了如实施例9描述的Avicel转化测定中人工纤维素酶的活性。以CBHl 共有序列〃 CBHlcons"转化菌株；以空载体pMU451转化M0419菌株，作为阴性对照。 其它菌株的描述见实施例9的表8。图14显示了实施例10中描述的表达CBHl和CBH2酶的多种组合的酵母对于 Avicel的活性。图15显示了实施例10中描述的表达多种纤维素酶的酵母对于Avicel的活性。图16显示了由表达异源纤维素酶的五种酿酒酵母菌株的共培养物从Avicel产生的乙醇。图17显示了由表达异源纤维素酶的四种酿酒酵母菌株的共培养物从Avicel产生的乙醇，以及由菌株M(^88(其表达四种纤维素酶)产生的乙醇。图18显示了由表达异源纤维素酶的四种酿酒酵母菌株的共培养物联合外部添加的纤维素酶从Avicel产生的乙醇。图19显示了使用表达异源纤维素酶的四种酿酒酵母菌株的共培养物或M(^88的计算的酶的节省(相对于未经转化的酿酒酵母)。图20显示了 M0509冷冻贮液、YPX分离体和YPD分离体的木糖利用和乙醇产生。图21显示了在存在相同的培养基和8g/L乙酸盐的情况下在40°C时M1105(标记为"菌落C2")和M01046的生长。图22显示了由M1105(三角形)和M1088(方块)在18% TS MS419上产生的乙醇。以M1105进行的实验具有低10%的酶的剂量，接种的细胞密度为1/2，然而产生了较高的乙醇效价。以M01105进行的实验在40°C进行，以M1088进行的实验在35°C进行。图23显示了由M1105产生的乙醇，其中仅接种0. 15g/L DCW进行发酵，产生了一些糖的积累和^g/L的乙醇。图24显示了由M12M在标准的IFM(圆圈)和低铵的IFM(方块)的条件下产生的乙醇。图25显示了 在40°C在补充了合成的抑制剂混合物(其包括8g/L乙酸盐)的复合木糖培养基中，单一菌落与M12M和M1339的比生长速率的比较。按照与发生进化的相同的条件筛选单一菌落。菌落Cl被重命名为M1360。图26显示了 在40°C在补充了葡萄糖的工业相关的发酵培养基上，M1360的发酵性能。接种60mg/L干细胞重的M1360来进行发酵。图27显示了在35°C和40°C，在PHW(18%固体，未洗涤的MS149)上进行的SSF中由数种菌株产生的乙醇。所有的反应都载入細g/g "zoomerase" (Novozyme 22c)。图28显示了在含有0. 2%的CMC或地衣淀粉或大麦-β-葡聚糖的3(7-平板上点染的培养物。每个平板的最上面的两行是基于Υ294的培养物，最下面两行含有基于Μ0749 的菌株。数字标示出了每个菌株包含的质粒。PMU471包含C.f.EG，作为阳性对照。将平板在30°C温育M小时(左侧的照片)，然后洗掉菌落，并以0. 刚果红将平板染色，以 NaCl脱色(右侧的照片)。图四显示了产生Cel5纤维素酶的菌株的上清液的SDS-PAGE分析。包含不具有外来基因的质粒的菌株用作参考菌株(REF)。也包括了含有表达C. f. EG (其是之前发现的最成功的EG)的质粒pMU471的菌株。图30显示了表达EG的菌株在(A)PASCQ小时)和(B) avicel ( 小时)上的活性。 包含不具有外来基因的质粒的菌株用作参考菌株(REF)，也包括了表达C. f. EG(pMU471)的菌株作为阳性对照。图31显示了以TrEG2和另外的TeCBHlw/TrCBD转化的酵母的上清液转化avicel 的能力的分布。M1088转化显示为黑色的垂直线。侧接该线的虚线代表测量值的标准偏差。图32显示了 在HTP avicel测验(48小时的时间点)中，由表达纤维素酶的酵母菌株的上清液转化的Avicel。M0509是不表达纤维素酶的阴性对照。菌株1088是仅表达 CBHUCBH2和BGL的亲代菌株，而1179、1180和1181是1088的转化子，它们还表达TrEG2。图33显示了，分解纤维素的菌株M1403和不分解纤维素的背景菌株M12M与多种数量的商售酶补充物在造纸淤泥CBP/SSF中产生的乙醇。实验条件为30%固体进料批， IOg/1细胞接种，PH 5. 5，温度为40°C, Zoom = Novozymes 22C纤维素酶制剂，BGL = AB酶 EL2008044L BGL 制剂，Xyl = AB 酶 EL2007020L 木聚糖酶制剂。图34显示了由CBP酵母(M1179)和不表达纤维素酶的对照菌株M0509进行的两种类型的造纸淤泥的发酵。实验条件为18%固体，细胞载量为10g/l或lg/L，pH 5. 5，温度为 350C，载入 lmg/g BGL 和 lmg/g Xyl。BGL = AB 酶 EL2008044L BGL 制剂，Xyl = AB 酶 EL2007020L木聚糖酶制剂。图35显示了 在多种外部纤维素酶浓度下，分解纤维素的酵母菌株M0963和不分解纤维素的对照菌株M0509在经预处理的硬木(PHW) (MS149)的22%的未洗涤的固体上的性能。实验条件22%固体进料批，pH 5. 4，温度35°C，所有的酶蛋白(EP)都是 "zoomerase" (Novozymes 22C) 0图36显示了 在多种最初细胞载量下，分解纤维素的酵母菌株M1284在经洗涤的预处理的硬木的30%固体上的性能。实验条件30%固体进料批，pH 5. 0，温度35°C，^ig EP = 0. 25mg BGL+0. 25mg 木聚糖酶 +0. 25mg 果胶酶 +3. 25mg Zoomerase, 20mg EP = Img BGL+Img 木聚糖酶 +Img 果胶酶 +16. 7mg Zoomerase。Zoomerase = Novozymes 22C 纤维素酶制剂，BGL = AB酶EL2008044L BGL制剂，Xyl = AB酶EL2007020L木聚糖酶制剂，果胶酶 =Genencor Multifect 果胶酶 。图37显示了，分解纤维素的菌株M1284和不分解纤维素的背景菌株M0509与多种数量的商售酶补充物在洗涤的玉米秸秆CBP/SSF中产生的乙醇。实验条件为18%固体进料批，10g/l细胞接种，pH 5. 0，温度为35°C，每种情况下载入lmg/g BGL和lmg/g木聚糖酶。BGL = AB 酶 EL2008044L BGL 制剂，Xyl = AB 酶 EL2007020L 木聚糖酶制剂。图38显示了表达不同的CBHl基因的酵母培养物上清液在Avicel (A，B)或 MULac (C,D)上的活性，以及基于MULac估计的CBHl的浓度(mg/L，E，F)。宿主菌株是Y294 或M0749。CBHl基因是Te，埃默森篮状菌；Ct，嗜热毛壳菌；At，嗜热枝顶孢；Tr，里氏木霉； Hg，灰腐质霉；Ta，嗜热子囊菌。标明了质粒的名称。酵母在YPD中一式三份培养3天。数据为平均值士标准偏差。图39显示了酵母菌株M0509中修饰的基因。图40显示了用于构建M0509的酵母菌株和相关的遗传修饰。图41显示了酵母菌株M1105的系谱。图42显示了酵母菌株M12M的系谱。发明详述公开的方法和材料一般用于工程化的酵母的领域。定义“载体”例如“质粒”或“YAC”(酵母人工染色体)是指通常携带一个或多个基因的染色体外元件，其不是细胞的中心代谢的一部分，并且通常是环状双链DNA分子的形式。 此类元件可以是自我复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，来自任何来源的单链或双链DNA或RNA，可以是线性、环状或超螺旋的，其中一些核苷酸序列连接或重组进入独特的构建体，所述构建体能够将启动子片段和所选基因产物的DNA序列以及合适的3’非翻译序列导入细胞中。优选地，本发明的质粒或载体是稳定的并且是自我复制的。“表达载体”是能够指导与其可操作地连接的基因的表达的载体。本文使用的术语“异源的”是指源自内生来源之外的来源的载体、质粒或宿主细胞。因此，例如，异源序列可以是源自相同宿主的不同基因或质粒的序列，来自宿主细胞的不同菌株的序列，或来自不同分类组(例如不同的界、门、纲、目、科、属或种，或这些分类门类之一内的任意亚组)的生物的序列。术语“异源”在本文中与术语“外源”作为同义词使用。本文使用的术语“结构域”是指具有共同的物理或化学特征例如疏水性、极性、球状、螺旋状结构域或特征的分子或结构的一部分，例如DNA结合结构域或ATP结合结构域。 结构域可以通过其与保守性结构或功能基序的同源性来鉴别。纤维二糖水解酶(CBH)结构域的实例包括催化结构域(CD)和纤维素结合结构域(CBD)。“核酸”、“多核苷酸”或“核酸分子”是由共价连接的被称作核苷酸的亚基组成的聚合化合物。核酸包括多聚核糖核酸(RNA)和多聚脱氧核糖核酸(DNA)，二者都可以是单链或双链的。DNA包括cDNA、基因组DNA、合成的DNA和半合成的DNA。“分离的核酸分子”或“分离的核酸片段”是指核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷； “RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合物形式，或其任何磷酸酯类似物，例如硫代磷酸酯和硫酯，可以是单链形式或双链螺旋。可以是双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。术语核酸分子，尤其是DNA或RNA 分子仅仅是指分子的一级和二级结构，不将其限定为任何特定三级结构形式。因此，该术语尤其包括存在于线性或环状DNA分子(例如限制性片段)、质粒和染色体中的双链DNA。在讨论具体的双链DNA分子的结构时，在本文中可以根据通常的规则来描述序列仅给出5’ 至3’方向的DNA的非转录链的序列(即与mRNA具有序列同源性的链)。“基因”是指编码多肽的核苷酸的装配，并且包括cDNA和基因组DNA核酸。“基因” 还指表达特定蛋白的核酸片段，包括单个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)， 以及编码序列之前的调节序列(5’ -非编码序列)和之后的调节序列(3’ -非编码序列)。 “天然基因”是指存在于自然界中的具有其本身的调节序列的基因。
当单链形式的核酸分子可以在合适的温度和溶液离子强度条件下与其它核酸分子退火时，该核酸分子是与其它核酸分子例如cDNA、基因组DNA或RNA “可杂交的”。杂交和洗涤条件是熟知的并且在例如Sambrook，J.，Fritsch，Ε. F. and Maniatis， Τ. MOLECULARCLONING :A LABORATORY MANUAL,第二 版，Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(1989)尤其是其中的第 11 章和表 11. 1 (下称〃 Maniatis"，通过引用全文并入本文)中有举例说明。温度和离子强度的条件决定杂交的“严格性”。可以调节严格条件以筛选中等相似的片段，例如来自关系远的生物的同源序列；以及高度相似的片段，例如来自紧密相关的生物的复制功能酶的基因。杂交后的洗涤决定严格条件。一组条件使用如下洗涤步骤在室温以6X 35(，0.5%505洗涤15分钟；然后在451以2乂 SSC, 0. 5% SDS洗涤30分钟；然后在50°C以0. 2X SSC，0. 5% SDS洗涤30分钟，重复两次。更严格的条件是在较高的温度进行洗涤，其中洗涤与上述条件相同，只不过最后两次以0. 2X SSC, 0. 5% SDS洗涤30分钟的温度升高至60°C。另一组高度严格性的条件是最后在65°C 以0. 1XSSC，0. 1% SDS洗涤两次。另一组高度严格性的条件是在65°C在0. IX SSC, 0. 1% SDS 杂交，以 2X SSC,0. 1% SDS 洗涤，然后以 0. 1XSSC，0. 1% SDS 洗涤。杂交需要两个核酸包含互补序列，虽然可能会发生碱基之间的错配(取决于杂交的严格性)。核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互补程度，这是本领域熟知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有这些序列的核酸的杂交体的Tm 值越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)按以下顺序递减RNA :RNA、DNA :RNA、 DNA:DNA。对于长度在100个核苷酸以上的杂交体，已经得出了用于计算Tm的公式(参见， 例如Maniatis，9. 50-9. 51)。对于较短的核酸即寡核苷酸的杂交，错配的位置变得更加重要，并且寡核苷酸的长度决定其特异性(参见，例如Maniatis，11. 7-11. 8)。在一个实施方式中，可杂交的核酸的长度是至少大约10个核苷酸。优选地，可杂交的核酸的最小长度是至少大约15个核苷酸；更优选为至少大约20个核苷酸；最优选的长度是至少30个核苷酸。 此外，技术人员将认识到，可以根据诸如探针长度等因素根据需要来调整温度和洗涤溶液的盐浓度。如本领域所知的术语“百分率同一性”是两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，其是通过比较这些序列来确定的。在本领域，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性的程度，视情况而定，根据此类序列串之间的匹配来确定。如本领域所知，两个多肽之间的“相似性”通过将多肽的氨基酸序列及其保守性氨基酸替换与第二多肽的序列进行比较来确定。可以通过已知的方法容易地计算“同一性”和“相似性”，所述方法包括但不限于下列文献中描述的方法 Computational MolecularBiology(Lesk，A.M.，ed.)Oxford University Press,NY(1988) ；Biocomputing Informatics and Genome Projects(Smith, D. W.编)Academic Press, NY(1993) ；Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M.禾口 Griffin， H. G.编)Humana Press, NJ (1994) ；Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G.编)AcademicPress (1987) ；and Sequence Analysis Primer (Gribskov,M.和 Devereux，J.编)Stockton Press，NY (1991)。用于测定同一性的优选方法被设计为产生所测序列之间的最佳匹配。用于测定同一性和相似性的方法编撰于公众可获得的计算机程序中。可以使用LASERGENE生物信息学计算包(DNASTAR Inc., Madison, Wis.)的Megalign程序来进行序列比对和同一性百分率的计算。本文公开的多个序列比对是使用 Clustal 的比对方法(Higgins and Sharp (1989)CABI0S. 5 :151-153)， 使用缺省参数(空隙罚分=10，空隙长度罚分=10)进行的。使用Clustal方法的配对比对的缺省参数是KTUPLE 1，空隙罚分=3，窗口 = 5，DIAGONALS SAVED = 5。合适的核酸序列或其片段(本发明的分离的多核苷酸)编码与本文报道的氨基酸序列至少大约70%至75%同一的多肽，与本文报道的氨基酸序列至少大约80^^85% 或90%同一的多肽，或与本文报道的氨基酸序列至少大约95%、96%、97%、98%、99%或 100%同一的多肽。合适的核酸片段是与本文报道的核酸序列至少大约70%、75%或80% 同一的，与本文报道的核酸序列至少大约80^^85%或90%同一的，或与本文报道的核酸序列至少大约95% ,96^^97% ,98^^99%或100%同一的。合适的核酸片段不仅具有以上同一性/相似性，还通常编码具有至少50个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸， 至少200个氨基酸，或至少250个氨基酸的多肽。DNA或RNA “编码区”是指当被置于合适的调节序列控制之下时，在体外或在体内在细胞中被转录和/或翻译成多肽的DNA或RNA分子。“合适的调节区”是指位于编码区的上游(5’ -非编码序列)、之内、或下游(3’ -非编码序列)，并且影响相关的编码区的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核酸区域。调节区可以包括启动子、翻译引导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。编码区的边界是通过5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子来确定的。编码区可以包括但不限于，原核区域、来自 mRNA的cDNA、基因组DNA分子、合成的DNA分子，或RNA分子。如果编码区要在真核细胞中表达，则编码区的3’端通常会具有多聚腺苷化信号和转录终止序列。“同种型”是指与另一蛋白具有相同功能但是由不同的基因编码并且在序列上可以具有小的差异的蛋白。“旁系同源物”是由于基因组内复制而相关的基因所编码的蛋白。“直系同源物”是来自于从共同的祖先基因通过物种形成(speciation)而进化出的不同物种的基因。正常而言，直系同源物在进化过程中保留与祖先基因相同的功能。“开放阅读框”缩写为0RF，其意思是包含翻译起始信号或起始密码子(例如ATG或 AUG)和终止密码子并且可以潜在地被翻译成多肽序列的一定长度的核酸，其可以是DNA、 cDNA 或 RNA。“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA表达的DNA片段。一般而言，编码区位于启动子的3’位置。启动子可以完整地来源于天然基因，或者可以由源自天然存在的不同启动子的不同元件组成，甚至可以包含合成的DNA区段。本领域技术人员理解不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中的表达，或者在不同发育阶段的表达，或者响应于不同的环境或生理状况的表达。使基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。还认识到，由于在多数情况下尚未完全确定调节序列的准确边界，所以不同长度的DNA片段可以具有相同的启动子活性。启动子通常在其3’末端与转录起始位点分界，并且向上游(5’方向)延伸至包括启动高于背景的可检测水平的转录所需的最小数目的碱基或元件。在启动子之内可以存在转录起始位点(例如通过与核酸酶Sl 绘图而方便地确定)，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白结合结构域(共有序列)。
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当RNA聚合酶将编码区转录成mRNA时，编码区处于细胞中的转录和翻译控制元件 “控制之下”，然后mRNA进行反式RNA剪接(如果编码区含有内含子)并被翻译成编码区所编码的蛋白。“转录和翻译控制区”是DNA调节区，例如启动子、增强子、终止子等，其提供编码区在宿主细胞中的表达。在真核细胞中，多聚腺苷化信号是控制区。术语“可操作地结合”是指核酸序列在单一核酸片段上的结合，从而一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码区的表达时(即编码区处于启动子的转录控制之下)，该启动子与该编码区为可操作地结合。编码区可以按照正义或反义反向与调节区可操作地结合。本文使用的术语“表达”是指源自本发明的核酸片段的正义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达还可以指mRNA翻译成多肽。 表达异源纤维素酶的宿主细胞为了解决以前的系统的局限性问题，本发明提供了表达异源纤维素酶的宿主细胞，它们可有效且有效率地从纤维素产生乙醇。在一些实施方式中，宿主细胞可以是酵母。根据本发明，酵母宿主细胞可以是，例如，来自下列属酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Kloeckera)、许旺酵母属(ktiwanniomyces)和耶罗威亚酵母属(Yarrowia)。作为宿主细胞的酵母的种可以包括，例如，酿酒酵母(S. cerevisiae)、S.bulderi、S.barnetti、少孢酵母(S. exiguus)、葡萄汁酵母(S. uvarum)、糖化酵母(S. diastaticus)、乳酸克鲁维酵母(K. Iactis)、马克斯克鲁维酵母(K. marxianus)或脆壁克鲁维酵母(K. fragilis)。在一些实施方式中，酵母选自酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizzosaccharomycespombe)、 白假丝酵母菌(Candida albicans)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、树干毕赤酵母 (Pichia stipitis)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、 Arxulaadeninivorans、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、多形德巴利酵母 (Debaryomyces polymorphus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)禾口西方i午日王酵母(ktiwanniomycesoccidentalis)。在一个具体的实施方式中，酵母是酿酒酵母。在另一个实施方式中，酵母是耐热的酿酒酵母。合适的宿主的选择被认为是本领域技术人员根据本文的教导的能力范围内。在本发明的一些实施方式中，宿主细胞是油质的细胞。根据本发明，油质的宿主细胞可以是油质的酵母细胞。例如，油质的酵母宿主细胞可以来自下列属布拉氏霉菌属(Blakeslea)、假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、小克银汉霉属 (Curminghamelia)、油月旨酵母属(Lipomyces)、被抱霄属(Mortierella) > S^M (Mucor)、 须霉属(Phycomyces)、腐霉属(Pythium)、红冬孢酵母属(Rhodosporidum)、红酵母属 (Iihodotorula)、丝孢酵母属(Trichosporon)或耶罗威亚酵母属(Yarrowia)。根据本发明， 油质宿主细胞可以是油质微藻类宿主细胞。例如，油质微藻类宿主细胞可以来自破囊壶菌属(Thraustochytrium)或裂殖壶菌属(khizochytrium)。然后，可以使用常规的脂质酯基转移方法通过油质生物从甘油三酸酯产生生物柴油。在一些具体实施方式
中，可以诱导油质宿主细胞以分泌合成的脂质。使用油质宿主细胞的实施方式是有利的，因为它们可以从木质纤维素原料产生生物柴油(木质纤维素原料相对于含油种子底物而言较为便宜)，可以更密集地生长，显示出较低的生命循环二氧化碳排放，并且可以在贫瘠的土地上培养。在本发明的一些实施方式中，宿主细胞是耐热的宿主细胞。耐热的宿主细胞在同时糖化和发酵过程中是特别有用的其允许外部产生的纤维素酶和产生乙醇的宿主细胞在相似的温度范围内实现最佳的性能。本发明的耐热的宿主细胞可以包括，例如，东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、密西西比毕赤酵母(Pichiamississippiensis)、墨西哥毕赤酵母(Pichia mexicana)、粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)、仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)、 葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)、墨西哥假丝酵母(Candidamexicana)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的宿主细胞。在一些实施方式中，耐热的细胞是酿酒酵母菌株，或其它酵母菌株，它们已经经过改造以在高温下生长，例如，通过在细胞恒稳器中在高温下选择它们的生长。在本发明的一些具体的实施方式中，宿主细胞是克鲁维酵母属的宿主细胞。例如，克鲁维酵母属的宿主细胞可以是乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、K. blattae、 K. phaffii、亚罗克鲁维酵母(K. yarrowii)、Κ· aestuarii、K. dobzhanskii、K. wickerhamii、 耐热克鲁维酵母(K. thermotolerans)或K.waltii的宿主细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是乳酸克鲁维酵母或马克斯克鲁维酵母宿主细胞。在另一个实施方式中，宿主细胞是马克斯克鲁维酵母宿主细胞。在本发明的一些实施方式中，耐热的宿主细胞可以在高于大约30°C、大约31°C、 大约32 °C、大约33 °C、大约34°C、大约35 °C、大约36 °C、大约37 °C、大约38 °C、大约39 °C、大约40°C、大约41°C或大约42°C的温度生长。在本发明的一些实施方式中，耐热的宿主细胞可以在高于大约30°C、大约31°C、大约32°C、大约33°C、大约；34°C、大约35°C、大约36°C、大约37°C、大约38°C、大约39°C、大约40°C、大约41°C、大约42°C或大约43°C或大约44°C或大约45°C或大约50°C的温度从纤维素产生乙醇。在本发明的一些实施方式中，耐热的宿主细胞可以在大约30°C至60°C，大约30°C 至55°C，大约30°C至50°C，大约40°C至60°C，大约40°C至55°C，或大约40 V至50 V的温度生长。在本发明的一些实施方式中，耐热的宿主细胞可以在大约30°C至60°C，大约30°C至 55°C，大约30°C至50°C，大约40°C至60°C，大约40°C至55°C，或大约40 V至50 V的温度从
纤维素产生乙醇。在本发明的一些实施方式中，宿主细胞具有代谢木糖的能力。关于开发利用木糖的技术的详细信息，可以见下列公开物Kuyper M等人FEMS Yeast Res. 4 :655-64 (2004)， Kuyper M 等人 FEMS YeastRes. 5 :399-409 0005)，和 Kuyper M 等人 FEMS Yeast Res. 5 925-3M2005)，通过引用方式全文并入本文。例如，可以通过异源表达木糖异构酶基因 XylA(例如，来自厌氧真菌Piromyces属E》、过表达五种参与木酮糖转化为分解糖的中间体的酿酒酵母酶类(木酮糖激酶、核糖5-磷酸异构酶、核糖5-磷酸差向异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶)和删除编码醛糖还原酶的GRE3基因以使木糖醇的产生最小化，从而在酿酒酵母中实现木糖的利用。根据本文描述的方法，宿主细胞可以包含抗生素标志物或可以不包含抗生素标志物。使用本发明的编码纤维素酶的多核苷酸对宿主细胞进行遗传工程化(转导或转化或转染)，更详细的描述见下文。可以在本发明的载体中将编码纤维素酶的多核苷酸导入宿主细胞，所述载体可以是例如包含编码异源纤维素酶的序列的克隆载体或表达载体。宿主细胞可以包含作为整合拷贝或质粒拷贝的本发明的多核苷酸。在一些方面，本发明涉及包含如下文描述的多核苷酸构建体的宿主细胞。本发明的宿主细胞可以表达一种或多种异源纤维素酶多肽。在一些实施方式中，宿主细胞包含编码异源纤维素酶或其片段、变体或衍生物的多核苷酸的组合。宿主细胞可以包含例如多个拷贝的相同的核酸序列，例如，为了增强表达水平，或者，宿主细胞可以包含独特的多核苷酸的组合。在其它实施方式中，宿主细胞包含编码异源纤维素酶或其片段、变体或衍生物的单一的多核苷酸。特别地，此类表达单一的异源纤维素酶的宿主细胞可用于与本发明的包含编码至少一种其它异源纤维素酶或其片段、变体或衍生物的多核苷酸的其它宿主细胞共培养。可以通过本领域已知的方法将编码异源纤维素酶的多核苷酸导入宿主细胞中。 可以通过醋酸锂转化、原生质球转化或通过电穿孔转化将编码异源纤维素酶的多核苷酸导入例如酵母宿主细胞中，转化方法如Current Protocols in Molecular Biology, 13. 7. 1-13. 7. 10所描述。可以通过磷酸钙转染、DEAE-Dextran介导的转染或电穿孔将构建体导入其它宿主细胞中(Davis, L.等人，Basic Methods in MolecularBiology, (1986))。可以检查如上所述的经转化的宿主细胞或细胞培养物的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和/或葡萄糖苷酶蛋白含量。对于使用分泌的异源纤维素酶，可以通过分析宿主(例如酵母)细胞上清液来测定蛋白含量。在一些实施方式中，可以通过丙酮沉淀法或通过使用即抛型去离子药筒缓冲样品而从酵母细胞上清液中回收高分子量的物质。也可以通过方法从重组酵母细胞培养物中回收并纯化蛋白，包括附着的异源纤维素酶，所述方法包括例如原生质球制备和裂解、使用玻璃珠破碎细胞，和使用液氮破碎细胞。另外的蛋白纯化方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱、凝胶过滤和血凝素色谱。在完成成熟蛋白的构型时，如果需要，可以使用蛋白重折叠步骤。最后，可以使用高效液相色谱(HPLC)进行最后的纯化步骤。蛋白分析方法包括例如传统的Lowry法或根据BioRad生产商的说明书进行的蛋白测定法。使用这些方法，可以估计糖分解性酶的蛋白含量。另外，为了精确测定蛋白浓度， 可以使异源纤维素酶与标签一起表达，例如His-标签或HA-标签，并通过标准方法纯化，使用例如针对标签的抗体、标准镍树脂纯化技术或类似方法。可以就纤维素的水解(例如通过糖测定法)、就特定类型的纤维素酶活性(例如通过测定单独的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或β -葡萄糖苷酶活性)，或者就总的纤维素酶活性，进一步分析如上文所述的转化的宿主细胞或细胞培养物。可以通过例如测定内切葡聚糖酶特异性CMC底物的还原末端的增加来测定内切葡聚糖酶活性。可以通过例如使用不溶性纤维素底物(例如，无定形底物磷酸膨胀纤维素(PASC)或微晶纤维素(Avicel))并测定底物水解的程度来测定纤维二糖水解酶的活性。可以通过多种测定法例如使用纤维二糖来测定葡萄糖苷酶活性。
总纤维素酶活性，包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和葡萄糖苷酶的活性， 可以协同水解晶体纤维素。因此，可以使用不溶性底物测定总纤维素酶活性，所述底物包括纯的纤维质底物，例如Whatman 1号滤纸、棉绒、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类的纤维素和含有纤维素的底物例如染色的纤维素、α纤维素或预处理的木质纤维素。还可以通过本领域普通技术人员已知的方法检测纤维素酶的比活性，例如，通过Avicel测定法(如上文描述)，其中将就针对样品所测的蛋白(纤维素酶)浓度进行校正。因此，本发明的一个方面涉及有效率地生产纤维素酶，以辅助纤维素的消化和乙醇的产生。纤维素酶可以是任何参与纤维素消化、代谢和/或水解的酶，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶在另外的实施方式中，测定转化的宿主细胞或细胞培养物的乙醇产生情况。可以通过本领域普通技术人员已知的技术测定乙醇的产生，例如通过标准的HPLC折射率法。异源纤维素酶根据本发明，异源纤维素酶在宿主细胞中的表达可有利地用于从纤维质来源产生乙醇。可以异源地表达来自多种来源的纤维素酶以成功地增加乙醇生产效率。例如， 纤维素酶可以来自真菌、细菌、植物、原生动物或白蚁来源。在一些实施方式中，纤维素酶是灰腐质霉(H. grisea)、嗜热子囊菌(T. aurantiacus)、埃默森篮状菌(T. emersonii)、 里氏木霉(Τ. reesei)、澳洲乳白蚁(C. Iacteus)、台湾家白蚁(C. formosanus)、 高山象白蚁(N. takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C. acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M. darwinensis), N. walkeri,扣囊复膜酵母菌(S. fibuligera)、 C. Iucknowense、黄胸散白蚁(R. speratus)、嗜热放线菌(Thermobfida fusca)、热纤梭菌(Clostridumthermocellum)> 角军纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridum josui)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、粪碱纤维单胞菌 (Cellulomonas fimi)、Saccharophagus degradans、Piromycesequii、Neocallimastix patricarum、白曲霉(Aspergillus kawachii)、舌甘菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)、 红褐肉座菌(H. jecorina)、Orpinomyces属、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、嗜热枝顶抱(Acremoniumthermophilum)、费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)、球毛壳菌 (Chaetomium globosum)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、粗糙脉孢菌(Neurospora Crassa)或拟南芥 (Arabidopsis thaliana)白勺 千会|! B|。在本发明的一些实施方式中，在同一种宿主细胞中共表达来自单一生物的多种纤维素酶。在本发明的一些实施方式中，在同一宿主细胞中共表达来自不同生物的多种纤维素酶。特别地，可以在同一宿主细胞中共表达来自2、3、4、5、6、7、8、9或更多种生物的纤维素酶。类似地，本发明可以包括酵母菌株的共培养物，其中所述酵母菌株表达不同的纤维素酶。共培养物可以包括表达来自同一生物或来自不同生物的异源纤维素酶的酵母菌株。共培养物可以包括表达来自2、3、4、5、6、7、8、9或更多种生物的纤维素酶的酵母菌株。本发明的纤维素酶包括内切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶。纤维素酶可以是例如内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶或纤维二糖水解酶。在本发明的一些实施方式中，内切葡聚糖酶可以是内切葡聚糖酶I或内切葡聚糖酶II同种型、旁系同源物或直系同源物。在一些实施方式中，由本发明的宿主细胞表达的内切葡聚糖酶可以是重组的内_1，4-β-葡聚糖酶。在具体的实施方式中，内切葡聚糖酶是里氏木霉(T.reesei)、澳洲乳白蚁(C. Iacteus)、台湾家白蚁(C. formosanus)、 高山象白蚁(N. takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C. acinaciformis)、达尔文澳白虫义(M. darwinensis)、N. walkeri> H 月匈白虫义(R. speratus)、白 ffi (Aspergillus kawachii)、舌甘胃 Ifi _ & (Heterodera schachtii) > tl Ii 1 ^ (H. jecorina)、 Orpinomyces 属、白囊奉巴齿菌(Irpex lacteus)、C. lucknowense、球毛壳菌(C. gIobosum)、 土曲霉(Aspergillus terreus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、粗糙脉孢菌 (Neurospora crassa)或嗜热枝顶孢(Acremonium thermophilum)内切葡聚糖酶。在一个具体的实施方式中，内切葡聚糖酶包含选自SEQ ID NO :30-39或52-56的氨基酸序列，如下面的表1所示。在一些其它的实施方式中，内切葡聚糖酶包含与选自SEQ ID NO :30-39或 52-56的氨基酸序列至少大约70 %、大约80 %、大约90 %、大约95 %、大约96 %、大约97 %、 大约98%、大约99%或100%同一的氨基酸序列。在实际中，可以使用已知的计算机程序常规地确定任意多肽是否与本发明的多肽至少 70%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 同一。用于测定同一性百分率的方法(如下文就多核苷酸同一性更详细地讨论)也与评价多肽序列同一性相关。在一个具体的实施方式中，内切葡聚糖酶是来自里氏木霉的内切葡聚糖酶 I(〃 egl")。在一些实施方式中，内切葡聚糖酶包含与SEQ IDNO :39至少大约70%、大约 80 %、大约90 %、大约95 %、大约96 %、大约97 %、大约98 %、大约99 %或100 %同一的氨基酸序列。在另一个具体实施方式
中，内切葡聚糖酶是来自台湾家白蚁的内切葡聚糖酶。在一些实施方式中，内切葡聚糖酶包含与SEQ ID NO :31至少大约70%、大约80%、大约90%、 大约95 %、大约96 %、大约97 %、大约98 %、大约99 %或100 %同一的氨基酸序列。在另一个具体实施方式
中，内切葡聚糖酶是来自红褐肉座菌的内切葡聚糖酶。在一些实施方式中，内切葡聚糖酶包含与SEQ ID NO力4至少大约70%、大约80%、大约90%、 大约95 %、大约96 %、大约97 %、大约98 %、大约99 %或100 %同一的氨基酸序列。在一些实施方式中，葡萄糖苷酶是葡萄糖苷酶I或葡萄糖苷酶II同种型、旁系同源物或直系同源物。在本发明的一些实施方式中，葡萄糖苷酶源自扣囊复膜酵母菌。在具体的实施方式中，β -葡萄糖苷酶包含与SEQ ID NO :40至少大约70%、大约80%、大约90%、大约95%、大约96%、大约97%、大约98%、大约99%或100%同一的氨基酸序列。在本发明的一些实施方式中，纤维二糖水解酶可以是纤维二糖水解酶I和/或纤维二糖水解酶II同种型、旁系同源物或直系同源物。在一个具体实施方式
中，纤维二糖水解酶包含选自SEQ ID NO :21- 或46的氨基酸序列，如下面的表1所示。在本发明的具体实施方式
中，纤维二糖水解酶是来自里氏木霉的纤维二糖水解酶I或II。在另一个实施方式中，纤维二糖水解酶包含与SEQ ID N0:27或SEQ ID NO 至少大约70%、大约80%、大约90 %、大约95 %、大约96 %、大约97 %、大约98 %、大约99 %或100 %同一的序列。在本发明的其它具体实施方式
中，纤维二糖水解酶是来自埃默森篮状菌的纤维二糖水解酶I或II。在另一个实施方式中，纤维二糖水解酶包含与SEQ ID N0:23或SEQ ID NO 24至少大约70 %、大约80 %、大约90 %、大约95 %、大约96 %、大约97 %、大约98 %、大约99%或100%同一的序列。在另一个实施方式中，本发明的纤维二糖水解酶是C. Iucknowense纤维二糖水解酶。在具体的实施方式中，纤维二糖水解酶是C. lucknowense纤维二糖水解酶Cbh2b。在一个实施方式中，纤维二糖水解酶包含与SEQ ID NO: 25至少大约70%、大约80%、大约90%、 大约95 %、大约96 %、大约97 %、大约98 %、大约99 %或100 %同一的序列。在本发明的一些实施方式中，纤维素酶包含选自下面的表1中的序列的序列。本发明的纤维素酶还包括包含与表1的序列至少大约70%、大约80%、大约90%、大约95%、 大约96 %、大约97 %、大约98 %、大约99 %或100 %同一的序列的纤维素酶。本发明的一些实施方式包括包含SEQ ID NO :21_40、46或52_56任意项的至少10、 20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500或更多个连续氨基酸的多肽或其结构域、片段、变体或衍生物。
3权利要求
1.转化的耐热的酵母宿主细胞，其包含至少一个含有编码纤维素酶的核酸的异源多核苷酸，其中，当使用纤维素作为碳源生长时，所述酵母宿主细胞能够产生乙醇。
2.权利要求1的宿主细胞，其中所述纤维素是不可溶的纤维素。
3.权利要求2的宿主细胞，其中所述纤维素是晶体纤维素。
4.权利要求1的宿主细胞，其中所述纤维素源自木质纤维素。
5.权利要求4的宿主细胞，其中所述木质纤维素是经过预处理的硬木。
6.权利要求1的宿主细胞，其中所述纤维素是磷酸膨胀纤维素。
7.权利要求1的宿主细胞，其中所述纤维素是微晶纤维素。
8.权利要求1的宿主细胞，其中所述纤维素是造纸淤泥。
9.权利要求1的宿主细胞，其中所述纤维素是玉米秸秆。
10.权利要求1-9任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含含有编码第一纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸。
11.权利要求10的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含含有编码第二纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸。
12.权利要求1-11任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含含有编码β-葡萄糖苷酶的核酸的异源多核苷酸。
13.权利要求1-12任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含含有编码内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸。
14.权利要求1-9任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含(a)至少一个包含编码内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸；(b)至少一个包含编码β-葡萄糖苷酶的核酸的异源多核苷酸；(c)至少一个包含编码第一纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸；和(d)至少一个包含编码第二纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸。
15.权利要求1-14任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是利用木糖的宿主细胞。
16.权利要求15的宿主细胞，其中所述利用木糖的宿主细胞异源表达I^riomyces属E2 XylA、过表达木酮糖激酶、核糖5-磷酸异构酶、核糖5-磷酸差向异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶，并且不表达编码醛糖还原酶的GRE3基因。
17.转化的耐热的酵母宿主细胞，其包含(a)至少一个包含编码内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸；(b)至少一个包含编码β-葡萄糖苷酶的核酸的异源多核苷酸；(c)至少一个包含编码第一纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸；和(d)至少一个包含编码第二纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸。
18.权利要求1-17任一项的宿主细胞，其中所述耐热的宿主细胞能够在大约30°C以上的温度从纤维素产生乙醇。
19.权利要求1-18任一项的宿主细胞，其中所述耐热的宿主细胞能够在大约35°C以上的温度从纤维素产生乙醇。
20.权利要求1-19任一项的宿主细胞，其中所述耐热的宿主细胞能够在大约40°C以上的温度从纤维素产生乙醇。
21.权利要求1-20任一项的宿主细胞，其中所述耐热的宿主细胞能够在大约45°C以上的温度从纤维素产生乙醇。
22.权利要求1-21任一项的宿主细胞，其中所述耐热的宿主细胞能够在大约50°C的温度从纤维素产生乙醇。
23.权利要求1-22任一项的宿主细胞，其中所述耐热的宿主细胞是就耐热性进行选择的东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、密西西比毕赤酵母(Pichiamississippiensis)、墨西哥毕赤酵母(Pichiamexicana)、粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)、仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)、葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)、墨西哥假丝酵母(Candida mexicana)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)或克鲁维酵母属(Kluveryomyces)宿主细胞或酿酒酵母 (S. cerevisiae)宿主细胞。
24.权利要求23的宿主细胞，其中所述宿主细胞是克鲁维酵母属的宿主细胞。
25.权利要求对的宿主细胞，其中所述克鲁维酵母属的宿主细胞是乳酸克鲁维酵母 (K. Iactis)或马克斯克鲁维酵母(K. marxianus)宿主细胞。
26.权利要求17-25任一项的宿主细胞，其中，当使用纤维素作为碳源生长时，所述宿主细胞能够产生乙醇。
27.权利要求沈的宿主细胞，其中所述纤维素是不可溶的纤维素。
28.权利要求1-27任一项的宿主细胞，其中纤维素酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶或纤维二糖水解酶是灰腐质霉(H. grisea)、嗜热子囊菌(T. aurantiacus)、 埃默森篮状菌(T. emersonii)、里氏木霉(T. reesei)、澳洲乳白蚁(C. Iacteus)、 台湾家白蚁(C. formosanus)、高山象白蚁(N. takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C. acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M. darwinensis)、N. walkeri、扣囊复膜酵母菌(S. fibuligera)、C. Iucknowense,黄胸散白蚁(R. speratus)、嗜热放线菌 (Thermobfida fusca)、热纤梭菌(Clostridumthermocellum)、角军纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridumjosui)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、 1 M^rF^Ifi 1 (Cellulomonas fimi)> Saccharophagus degradans> Piromycesequii> Neocallimastix patricarum、白曲霉(Aspergillus kawachii)> 舌甘菜胞囊线虫 (Heterodera schachtii)、红揭肉座菌(H. jecorina)、Orpinomyces 属、白囊奉巴齿菌 (Irpex lacteus)、嗜热枝顶抱(Acremoniumthermophilum)、费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、 烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、 土曲霉(Aspergillus terreus)、粗糙脉孢菌 (Neurospora Crassa)、北美散白虫义(R. flavipes)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)的纤维素酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶或纤维二糖水解酶。
29.权利要求1018任一项的宿主细胞，其中所述第一或第二纤维二糖水解酶选自灰腐质霉(H. grisea)CBHl、嗜热子囊菌(T. aurantiacus)CBHl、埃默森篮状菌(T. emersonii) CBH1、里氏木霉(T. reesei)CBHl、埃默森篮状菌(T. emersonii)CBH2、C. lucknowenseCBH2 和里氏木霉(T. reesei) CBH2。
30.权利要求10- 任一项的宿主细胞，其中所述包含编码第一纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸编码包含纤维二糖水解酶和纤维素结合模块(CBM)的融合蛋白。
31.权利要求30的宿主细胞，其中所述CBM是里氏木霉(T.reesei) Cbh2的纤维素结合模块(CBM)。
32.权利要求30的宿主细胞，其中所述CBM是里氏木霉(Lreesei)Cbhl或灰腐质霉 (H. grisea)Cbhl的纤维素结合模块(CBM)。
33.权利要求30-32任一项的宿主细胞，其中所述CBM通过连接子序列与所述纤维二糖水解酶融合。
34.权利要求11-33任一项的宿主细胞，其中所述第一纤维二糖水解酶和第二纤维二糖水解酶是纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II。
35.权利要求11-34任一项的宿主细胞，其中所述第一纤维二糖水解酶和第二纤维二糖水解酶是C. Iucknowense纤维二糖水解酶和埃默森篮状菌纤维二糖水解酶。
36.权利要求34或权利要求35的宿主细胞，其中所述第一纤维二糖水解酶和第二纤维二糖水解酶是C. Iucknowense纤维二糖水解酶II和埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I。
37.权利要求36的宿主细胞，其中所述C.Iucknowense纤维二糖水解酶II是 C. Iucknowense CBH2b，并且所述埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I包括埃默森篮状菌CBHl 和CBD融合蛋白。
38.权利要求37的宿主细胞，其中所述第一纤维二糖水解酶包含SEQID NO :25的氨基酸序列，并且所述第二纤维二糖水解酶包含SEQ ID NO :26的氨基酸序列。
39.权利要求10-27或30-33任一项的宿主细胞，其中所述第一纤维二糖水解酶包含与 SEQ ID NO :43的氨基酸序列至少85%同一的氨基酸序列。
40.权利要求12-39任一项的宿主细胞，其中所述β-葡萄糖苷酶是扣囊复膜酵母菌 (S. fibuligera) β -葡萄糖苷酶。
41.权利要求40的宿主细胞，其中所述β-葡萄糖苷酶是扣囊复膜酵母菌 (S. fibuligera) β -葡萄糖苷酶 I。
42.权利要求41的宿主细胞，其中所述β-葡萄糖苷酶包含SEQIDNO :40的氨基酸序列。
43.权利要求13-42任一项的宿主细胞，其中所述内切葡聚糖酶是里氏木霉(T. reesei)、澳洲乳白蚁(C. Iacteus)、台湾家白蚁(C. formosanus)、高山象白蚁(N. takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C. acinaciformis)、达尔文澳白虫义(M. darwinensis) > N. walkeri> H 月匈 1 白虫义(R. speratus) > Sffi^ (Aspergillus kawachii)、舌甘胃 Ifi ■ _ & (Heterodera schachtii) > tl Ii 1 ^ (H. jecorina)、 Orpinomyces属或白囊耙齿菌(Irpex lacteus)内切葡聚糖酶。
44.权利要求43的宿主细胞，其中所述内切葡聚糖酶是台湾家白蚁(C.formosanus)内切葡聚糖酶。
45.权利要求44的宿主细胞，其中所述内切葡聚糖酶包含SEQIDNO :31的氨基酸序列。
46.权利要求43的宿主细胞，其中所述内切葡聚糖酶是红褐肉座菌(H.jecorina)内切葡聚糖酶。
47.权利要求46的宿主细胞，其中所述内切葡聚糖酶包含SEQIDNO力4的氨基酸序列。
48.权利要求11-38或40-45任一项的宿主细胞，其中(a)所述内切葡聚糖酶是台湾家白蚁(C.formosanus)内切葡聚糖酶I ；(b)所述β-葡萄糖苷酶是扣囊复膜酵母菌(S. fibuligera) β -葡萄糖苷酶I ；(C)所述第一纤维二糖水解酶是埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I ；并且 (d)所述第二纤维二糖水解酶是C. Iucknowense纤维二糖水解酶lib。
49.权利要求11-38、40-43或46-47任一项的宿主细胞，其中(a)所述内切葡聚糖酶是红褐肉座菌(H.jecorina)内切葡聚糖酶2 ；(b)所述β-葡萄糖苷酶是扣囊复膜酵母菌(S. fibuligera) β -葡萄糖苷酶I ；(c)所述第一纤维二糖水解酶是埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I；并且(d)所述第二纤维二糖水解酶是C.Iucknowense纤维二糖水解酶lib。
50.权利要求48或49的宿主细胞，其中所述第一纤维二糖水解酶包含埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I和CBD融合蛋白。
51.权利要求48-50任一项的宿主细胞，其中台湾家白蚁(C.formosanus)内切葡聚糖酶I、扣囊复膜酵母菌(S. fibuligera) β -葡萄糖苷酶I、埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I 和C. Iucknowense纤维二糖水解酶IIb被分泌。
52.权利要求13-51任一项的宿主细胞，还包含含有编码第二内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸。
53.权利要求52的宿主细胞，还包含含有编码第三内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸。
54.权利要求53的宿主细胞，还包含含有编码第四内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸。
55.权利要求M的宿主细胞，还包含含有编码第五内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸。
56.权利要求55的宿主细胞，还包含含有编码第六内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸。
57.权利要求56的宿主细胞，还包含含有编码第七内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸。
58.权利要求57的宿主细胞，还包含含有编码第八内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸。
59.权利要求58的宿主细胞，其中所述第一、第二、第三、第四、第五、第六、 第七和第八内切葡聚糖酶是里氏木霉(T. reesei)、澳洲乳白蚁(C. Iacteus)、台湾家白蚁(C. formosanus)、高山象白蚁(N. takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C. acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M. darwinensis)、N. walkeri、黄胸散白蚁 (R. speratus)、白曲霉(Aspergillus kawachii)、舌甘菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)、 红褐肉座菌(H. jecorina)、Orpinomyces属或白囊耙齿菌(Irpexlacteus)内切葡聚糖酶。
60.权利要求59的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含里氏木霉(T.reesei)内切葡聚糖酶、澳洲乳白蚁(C. Iacteus)内切葡聚糖酶、台湾家白蚁(C. formosanus)内切葡聚糖酶、高山象白蚁(N. takasagoensis)内切葡聚糖酶、澳大利亚矛颚家白蚁(C. acinaciformis)内切葡聚糖酶、达尔文澳白蚁(M. darwinensis)内切葡聚糖酶、N. walkeri内切葡聚糖酶和黄胸散白蚁(R. speratus)内切葡聚糖酶。
61.权利要求59或权利要求60的宿主细胞，其中所述里氏木霉(T.reesei)内切葡聚糖酶包含SEQ ID N0:39的氨基酸序列；所述澳洲乳白蚁(C. Iacteus)内切葡聚糖酶包含SEQ ID N0:30的氨基酸序列；所述台湾家白蚁(C. formosanus)内切葡聚糖酶包含SEQ ID NO 31的氨基酸序列；所述高山象白蚁(N. takasagoensis)内切葡聚糖酶包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列；所述澳大利亚矛颚家白蚁(C. acinaciformis)内切葡聚糖酶包含SEQ ID NO 33的氨基酸序列；所述达尔文澳白蚁(M. darwinensis)内切葡聚糖酶包含SEQ ID NO ；34的氨基酸序列；所述N.walkeri内切葡聚糖酶包含SEQ ID NO :35的氨基酸序列；或者所述黄胸散白蚁(R. speratus)内切葡聚糖酶包含SEQ ID NO 36的氨基酸序列。
62.权利要求1-50或52-61任一项的宿主细胞，其中纤维素酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶或纤维二糖水解酶中的至少一项是附着的。
63.权利要求1-50或52-62任一项的宿主细胞，其中纤维素酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶或纤维二糖水解酶中的至少一项是分泌的。
64.权利要求11-50和52-63任一项的宿主细胞，其中纤维素酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶或纤维二糖水解酶中的至少一项是附着的，并且纤维素酶、内切葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶或纤维二糖水解酶中的至少一项是分泌的。
65.权利要求1-64任一项的宿主细胞，其中所述编码纤维素酶的核酸、所述编码内切葡聚糖酶的核酸、所述编码β-葡萄糖苷酶的核酸或所述编码纤维二糖水解酶的核酸是密码子优化的。
66.权利要求1-65任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够以至少大约IOmg/小时/升的速度产生乙醇。
67.权利要求66的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够以至少大约50mg/小时/升的速度产生乙醇。
68.权利要求67的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够产生至少大约500mg/小时/升。
69.权利要求1-68任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是利用木糖的宿主细胞。
70.权利要求69的宿主细胞，其中所述利用木糖的宿主细胞异源表达I^riomyces属E2 XylA、过表达木酮糖激酶、核糖5-磷酸异构酶、核糖5-磷酸差向异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶，并且不表达编码醛糖还原酶的GRE3基因。
71.转化的酵母宿主细胞，其包含(a)至少一个包含编码纤维素酶的核酸的异源多核苷酸，其中所述纤维素酶是内切葡聚糖酶；(b)至少一个包含编码纤维素酶的核酸的异源多核苷酸，其中所述纤维素酶是葡萄糖苷酶；(c)至少一个包含编码纤维素酶的核酸的异源多核苷酸，其中所述纤维素酶是第一纤维二糖水解酶；和(d)至少一个包含编码纤维素酶的核酸的异源多核苷酸，其中所述纤维素酶是第二纤维二糖水解酶，其中所述纤维素酶中的至少两种被细胞分泌。
72.权利要求71的宿主细胞，其中所述纤维素酶中的至少三种被细胞分泌。
73.权利要求72的宿主细胞，其中所述纤维素酶中的四种被细胞分泌。
74.转化的酵母宿主细胞，其包含至少六种异源多核苷酸，其中每种异源多核苷酸包含编码纤维素酶的核酸。
75.权利要求74的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含(a)至少一个包含编码内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸；(b)至少一个包含编码β-葡萄糖苷酶的核酸的异源多核苷酸；(c)至少一个包含编码第一纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸；和(d)至少一个包含编码第二纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸。
76.转化的酵母宿主细胞，其包含至少四种异源多核苷酸，其中每种异源多核苷酸包含编码内切葡聚糖酶的核酸。
77.权利要求76的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含含有编码β-葡萄糖苷酶的核酸的至少一种异源多核苷酸。
78.权利要求76或77的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含含有编码第一纤维二糖水解酶的核酸的至少一种异源多核苷酸。
79.权利要求78的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含含有编码第二纤维二糖水解酶的核酸的至少一种异源多核苷酸。
80.权利要求71-79任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酿酒酵母细胞。
81.权利要求71-79任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是油质的酵母细胞。
82.权利要求81的宿主细胞，其中所述油质的酵母细胞是布拉氏霉菌属(Blakeslea)、 假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、白霉属(Mucor)、须霉属(Phycomces)、腐霉属(Pythium)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、丝孢酵母属 (Trichosporon)或耶罗威亚酵母属(Yarrowia)的细胞。
83.权利要求71-79任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是耐热的宿主细胞。
84.权利要求83的宿主细胞，其中所述耐热的宿主细胞能够在大约30°C以上的温度从纤维素产生乙醇。
85.权利要求84的宿主细胞，其中所述耐热的宿主细胞能够在大约37°C以上的温度从纤维素产生乙醇。
86.权利要求85的宿主细胞，其中所述耐热的宿主细胞能够在大约40°C以上的温度从纤维素产生乙醇。
87.权利要求86的宿主细胞，其中所述耐热的宿主细胞能够在大约45°C以上的温度从纤维素产生乙醇。
88.权利要求83-87任一项的宿主细胞，其中所述耐热的宿主细胞是东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、密西西比毕赤酵母(Pichia mississippiensis)、墨西哥毕赤酵母(Pichia mexicana)、粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)、仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)、葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)、墨西哥假丝酵母(Candidamexicana)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)或克鲁维酵母属 (Kluveryomyces)的宿主细胞。
89.权利要求83-88任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是克鲁维酵母属的宿主细胞。
90.权利要求89的宿主细胞，其中所述克鲁维酵母属的宿主细胞是乳酸克鲁维酵母或马克斯克鲁维酵母的宿主细胞。
91.权利要求71-90任一项的宿主细胞，其中，当使用纤维素作为碳源生长时，所述宿主细胞能够产生乙醇。
92.权利要求91的宿主细胞，其中所述纤维素是不可溶的纤维素。
93.权利要求71-90任一项的宿主细胞，其中纤维素酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶或纤维二糖水解酶是灰腐质霉(H.grisea)、嗜热子囊菌(T. aurantiacus)、 埃默森篮状菌(T. emersonii)、里氏木霉(T. reesei)、澳洲乳白蚁(C. Iacteus)、 台湾家白蚁(C. formosanus)、高山象白蚁(N. takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C. acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M. darwinensis)、N. walkeri、扣囊复膜酵母菌(S. fibuligera)、C. Iucknowense,黄胸散白蚁(R. speratus)、嗜热放线菌 (Thermobfida fusca)、热纤梭菌(Clostridumthermocellum)、角军纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridum josui)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、 1 M^rF^Ifi 1 (Cellulomonas fimi)> Saccharophagus degradans> Piromycesequii> Neocallimastix patricarum、白曲霉(Aspergillus kawachii)> 舌甘菜胞囊线虫 (Heterodera schachtii)、红揭肉座菌(H. jecorina)、Orpinomyces 属、白囊奉巴齿菌 (Irpex lacteus)、嗜热枝顶抱(Acremoniumthermophilum)、费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、 粗糙脉孢菌(Neurospora Crassa)、北美散白蚁(R. flavipes)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)的纤维素酶、内切葡聚糖酶、β _葡萄糖苷酶或纤维二糖水解酶。
94.权利要求71-73、75或78-93任一项的宿主细胞，其中所述第一或第二纤维二糖水解酶选自灰腐质霉(H. grisea)CBHl、嗜热子囊菌(T. aurantiacus)CBH1、埃默森篮状菌(T. emersonii)CBH1、里氏木霉(T. reesei)CBH1、埃默森篮状菌(T. emersonii)CBH2、 C. Iucknowense CBH2 和里氏木霉(T. reesei) CBH2。
95.权利要求71-73、75或78-94任一项的宿主细胞，其中所述包含编码第一纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸编码包含纤维二糖水解酶和纤维素结合模块(CBM)的融合蛋白。
96.权利要求95的宿主细胞，其中所述CBM是里氏木霉(T.reesei) Cbh2的纤维素结合模块(CBM)。
97.权利要求95的宿主细胞，其中所述CBM是里氏木霉(T.reesei) Cbhl或灰腐质霉 (H. grisea)Cbhl的纤维素结合模块(CBM)。
98.权利要求95的宿主细胞，其中所述CBM是C.lucknowenseCbh2b的纤维素结合模块 (CBM)。
99.权利要求95-98任一项的宿主细胞，其中所述CBM通过连接子序列与所述纤维二糖水解酶融合。
100.权利要求71-73、75或79-99任一项的宿主细胞，其中所述第一纤维二糖水解酶和第二纤维二糖水解酶是纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II。
101.权利要求71-73、75或79-99任一项的宿主细胞，其中所述第一纤维二糖水解酶和第二纤维二糖水解酶是C. Iucknowense纤维二糖水解酶和埃默森篮状菌纤维二糖水解酶。
102.权利要求100或权利要求101的宿主细胞，其中所述第一纤维二糖水解酶和第二纤维二糖水解酶是c. Iucknowense纤维二糖水解酶II和埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I。
103.权利要求102的宿主细胞，其中所述C.Iucknowense纤维二糖水解酶II是 C. Iucknowense CBH2b，并且所述埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I包括埃默森篮状菌CBHl 和CBD融合蛋白。
104.权利要求103的宿主细胞，其中所述第一纤维二糖水解酶包含SEQID NO 25的氨基酸序列，并且所述第二纤维二糖水解酶包含SEQ ID NO :26的氨基酸序列。
105.权利要求71-73、75、78-92或95-99的宿主细胞，其中所述第一纤维二糖水解酶包含与SEQ ID NO 43的氨基酸序列至少85%同一的氨基酸序列。
106.权利要求71-73、75或77-105任一项的宿主细胞，其中所述β-葡萄糖苷酶是扣囊复膜酵母菌葡萄糖苷酶。
107.权利要求106的宿主细胞，其中所述β-葡萄糖苷酶是扣囊复膜酵母菌葡萄糖苷酶I。
108.权利要求107的宿主细胞，其中所述β-葡萄糖苷酶包含SEQID NO 40的氨基酸序列。
109.权利要求71-73或75-108任一项的宿主细胞，其中所述内切葡聚糖酶是里氏木霉(T. reesei)、澳洲乳白蚁(C. Iacteus)、台湾家白蚁(C. formosanus)、高山象白蚁(N. takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C. acinaciformis)、达尔文澳白虫义(M. darwinensis) > N. walkeri> H 月匈 1 白虫义(R. speratus) > Sffi^ (Aspergillus kawachii)、舌甘胃 Ifi ■ _ & (Heterodera schachtii) > tl Ii 1 ^ (H. jecorina)、 Orpinomyces属或白囊耙齿菌(Irpex lacteus)内切葡聚糖酶。
110.权利要求109的宿主细胞，其中所述内切葡聚糖酶是台湾家白蚁(C.formosanus) 内切葡聚糖酶。
111.权利要求110的宿主细胞，其中所述内切葡聚糖酶包含SEQIDNO :31的氨基酸序列。
112.权利要求109的宿主细胞，其中所述内切葡聚糖酶是红褐肉座菌(H.jecorina)内切葡聚糖酶。
113.权利要求112的宿主细胞，其中所述内切葡聚糖酶包含SEQIDNO M的氨基酸序列。
114.权利要求71-73、75、80-104或106-111任一项的宿主细胞，其中(a)所述内切葡聚糖酶是台湾家白蚁(C.formosanus)内切葡聚糖酶I ；(b)所述β-葡萄糖苷酶是扣囊复膜酵母菌(S. fibuligera) β -葡萄糖苷酶I ；(c)所述第一纤维二糖水解酶是埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I；并且(d)所述第二纤维二糖水解酶是C.Iucknowense纤维二糖水解酶lib。
115.权利要求71-73、75、80-104、106-109或112-113任一项的宿主细胞，其中(a)所述内切葡聚糖酶是红褐肉座菌(H.jecorina)内切葡聚糖酶2 ；(b)所述β-葡萄糖苷酶是扣囊复膜酵母菌(S. fibuligera) β -葡萄糖苷酶I ；(c)所述第一纤维二糖水解酶是埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I；并且(d)所述第二纤维二糖水解酶是C.Iucknowense纤维二糖水解酶lib。
116.权利要求114或115的宿主细胞，其中所述第一纤维二糖水解酶是埃默森篮状菌纤维二糖水解酶ICBD融合蛋白。
117.权利要求114-116任一项的宿主细胞，其中内切葡聚糖酶、扣囊复膜酵母菌 (S. fibuligera) β -葡萄糖苷酶I、埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I和C. Iucknowense纤维二糖水解酶nb被分泌。
118.权利要求71-73、75或80-117任一项的宿主细胞，还包含含有编码第二内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸。
119.权利要求118的宿主细胞，还包含含有编码第三内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸。
120.权利要求119的宿主细胞，还包含含有编码第四内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸。
121.权利要求120的宿主细胞，还包含含有编码第五内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸。
122.权利要求121的宿主细胞，还包含含有编码第六内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸。
123.权利要求122的宿主细胞，还包含含有编码第七内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸。
124.权利要求123的宿主细胞，还包含含有编码第八内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸。
125.权利要求124的宿主细胞，其中所述第一、第二、第三、第四、第五、第六、 第七和第八内切葡聚糖酶是里氏木霉(T. reesei)、澳洲乳白蚁(C. Iacteus)、台湾家白蚁(C. formosanus)、高山象白蚁(N. takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C. acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M. darwinensis)、N. walkeri、黄胸散白蚁 (R. speratus)、白曲霉(Aspergillus kawachii)、舌甘菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)、 红褐肉座菌(H. jecorina)、Orpinomyces属或白囊耙齿菌(Irpexlacteus)内切葡聚糖酶。
126.权利要求125的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含里氏木霉(T.reesei)内切葡聚糖酶、澳洲乳白蚁(C. Iacteus)内切葡聚糖酶、台湾家白蚁(C. formosanus)内切葡聚糖酶、 高山象白蚁(N. takasagoensis)内切葡聚糖酶、澳大利亚矛颚家白蚁(C. acinaciformis) 内切葡聚糖酶、达尔文澳白蚁(M. darwinensis)内切葡聚糖酶、N. walkeri内切葡聚糖酶和黄胸散白蚁(R. speratus)内切葡聚糖酶。
127.权利要求1 的宿主细胞，其中所述里氏木霉(T.reesei)内切葡聚糖酶包含SEQ ID NO 39的氨基酸序列；所述澳洲乳白蚁(C. Iacteus)内切葡聚糖酶包含SEQ ID NO 30 的氨基酸序列；所述台湾家白蚁(C. formosanus)内切葡聚糖酶包含SEQ ID NO 31的氨基酸序列；所述高山象白蚁(N. takasagoensis)内切葡聚糖酶包含SEQ IDNO 32的氨基酸序列；所述澳大利亚矛颚家白蚁(C. acinaciformis)内切葡聚糖酶包含SEQ ID N0:33的氨基酸序列；所述达尔文澳白蚁(M. darwinensis)内切葡聚糖酶包含SEQ ID N0:34的氨基酸序列；所述N. walkeri内切葡聚糖酶包含SEQ ID NO :35的氨基酸序列；或者所述黄胸散白蚁 (R. speratus)内切葡聚糖酶包含SEQ ID NO 36的氨基酸序列。
128.权利要求71-72、74-116或118-127任一项的宿主细胞，其中纤维素酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶或纤维二糖水解酶中的至少一项是附着的。
129.权利要求74-116或118-1 任一项的宿主细胞，其中纤维素酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶或纤维二糖水解酶中的至少一项是分泌的。
130.权利要求71-72、74-116或118-1 任一项的宿主细胞，其中纤维素酶、内切葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶或纤维二糖水解酶中的至少一项是附着的，并且纤维素酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶或纤维二糖水解酶中的至少一项是分泌的。
131.权利要求71-130任一项的宿主细胞，其中所述编码纤维素酶的核酸、所述编码内切葡聚糖酶的核酸、所述编码β -葡萄糖苷酶的核酸或所述编码纤维二糖水解酶的核酸是密码子优化的。
132.权利要求71-131任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够以至少大约IOmg/小时/升的速度产生乙醇。
133.权利要求132的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够以至少大约50mg/小时/升的速度产生乙醇。
134.权利要求133的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够产生至少大约500mg/小时/升。
135.权利要求71-133任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是利用木糖的宿主细胞。
136.权利要求135的宿主细胞，其中所述利用木糖的宿主细胞异源表达I^riomyces属 E2 XylA、过表达木酮糖激酶、核糖5-磷酸异构酶、核糖5-磷酸差向异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶，并且不表达编码醛糖还原酶的GRE3基因。
137.包含至少两种酵母宿主细胞的共培养物，其中(a)所述宿主细胞中的至少一种包含含有编码纤维素酶的核酸的第一异源多核苷酸， 其中所述纤维素酶是内切葡聚糖酶；(b)所述宿主细胞中的至少一种包含含有编码纤维素酶的核酸的第二异源多核苷酸， 其中所述纤维素酶是β-葡萄糖苷酶；(c)所述宿主细胞中的至少一种包含含有编码纤维素酶的核酸的第三异源多核苷酸， 其中所述纤维素酶是第一纤维二糖水解酶；(d)所述宿主细胞中的至少一种包含含有编码纤维素酶的核酸的第四异源多核苷酸， 其中所述纤维素酶是第二纤维二糖水解酶，其中所述第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸和第四多核苷酸不在同一个宿主细胞中；并且其中所述共培养物从纤维素产生乙醇。
138.权利要求137的共培养物，其中，所述宿主细胞中的任意种在不存在至少一种其它宿主细胞的情况下培养时都不能从纤维素产生乙醇。
139.权利要求137或138的共培养物，其中至少一种纤维素酶是附着的。
140.权利要求139的共培养物，其中所述附着的纤维素酶是葡萄糖苷酶或内切葡聚糖酶。
141.权利要求140或141的共培养物，其中至少两种纤维素酶是附着的。
142.权利要求142的共培养物，其中一种附着的纤维素酶是β-葡萄糖苷酶，并且一种附着的纤维素酶是内切葡聚糖酶。
143.权利要求137或138的共培养物，其中所有的纤维素酶都是分泌的。
144.权利要求137-143任一项的共培养物，其中所述纤维素是不可溶的纤维素。
145.权利要求144的共培养物，其中所述纤维素是晶体纤维素。
146.权利要求137的共培养物，其中所述纤维素源自木质纤维素。
147.权利要求146的共培养物，其中所述木质纤维素是硬木。
148.权利要求137的共培养物，其中所述纤维素是磷酸膨胀纤维素。
149.权利要求137的共培养物，其中所述纤维素是微晶纤维素。
150.权利要求137-149任一项的共培养物，其中所述宿主细胞中的至少一种是酿酒酵母细胞。
151.权利要求137-150任一项的共培养物，其中所述宿主细胞中的至少一种是耐热的宿主细胞。
152.权利要求137-151任一项的共培养物，其中所述共培养物能够在大约30°C以上的温度从纤维素产生乙醇。
153.权利要求137-152任一项的共培养物，其中所述共培养物能够在大约37°C以上的温度从纤维素产生乙醇。
154.权利要求137-153任一项的共培养物，其中所述共培养物能够在大约40°C以上的温度从纤维素产生乙醇。
155.权利要求137-1M任一项的共培养物，其中所述共培养物能够在大约45°C以上的温度从纤维素产生乙醇。
156.权利要求151-155任一项的共培养物，其中所述耐热的宿主细胞是东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、密西西比毕赤酵母(Pichia mississippiensis)、 墨西哥毕赤酵母(Pichia mexicana)、粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)、仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)、葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)、墨西哥假丝酵母(Candidamexicana)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)或克鲁维酵母属 (Kluveryomyces)宿主细胞。
157.权利要求156的共培养物，其中所述耐热的宿主细胞是克鲁维酵母属的宿主细胞。
158.权利要求157的共培养物，其中所述克鲁维酵母属的宿主细胞是乳酸克鲁维酵母 (K. Iactis)或马克斯克鲁维酵母(K. marxianus)的宿主细胞。
159.权利137-158任一项的共培养物，其中所述第一或第二纤维二糖水解酶选自灰腐质霉(H. grisea)CBHl、嗜热子囊菌(T. aurantiacus) CBHl、埃默森篮状菌(T. emersonii) CBH1、里氏木霉(T. reesei)CBHl、埃默森篮状菌(T. emersonii)CBH2、C. lucknowenseCBH2 和里氏木霉(T. reesei)CBH2。
160.权利要求137-158任一项的共培养物，其中所述包含编码第一或第二纤维二糖水解酶的核酸的多核苷酸编码包含纤维二糖水解酶和纤维素结合模块(CBM)的融合蛋白。
161.权利要求160的共培养物，其中所述CBM是里氏木霉(T.reeSei)Cbh2的纤维素结合模块(CBM)。
162.权利要求160的共培养物，其中所述CBM是里氏木霉(T.reesei) Cbhl或灰腐质霉 (H. grisea)Cbhl的纤维素结合模块(CBM)。
163.权利要求160的共培养物，其中所述CBM是C.lucknowenseCbh2b的纤维素结合模块(CBM)。
164.权利要求160-163任一项的共培养物，其中所述CBM通过连接子序列与所述纤维二糖水解酶融合。
165.权利要求137-164任一项的共培养物，其中所述第一纤维二糖水解酶和第二纤维二糖水解酶是纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II。
166.权利要求137-165任一项的共培养物，其中所述第一纤维二糖水解酶和第二纤维二糖水解酶是C. Iucknowense纤维二糖水解酶和埃默森篮状菌纤维二糖水解酶。
167.权利要求165或权利要求166的共培养物，其中所述第一纤维二糖水解酶和第二纤维二糖水解酶是C. Iucknowense纤维二糖水解酶II和埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I。
168.权利要求167的共培养物，其中C.Iucknowense纤维二糖水解酶II是 C. Iucknowense CBH2b，并且埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I包含埃默森篮状菌CBHl和CBD 融合蛋白。
169.权利要求168的共培养物，其中所述第一纤维二糖水解酶包含SEQID NO :26的氨基酸序列，并且所述第二纤维二糖水解酶包含SEQ ID NO :25的氨基酸序列。
170.权利要求137-164任一项的共培养物，其中所述第一纤维二糖水解酶包含与SEQ ID NO 43的氨基酸序列至少85%同一的氨基酸序列。
171.权利要求137-170任一项的共培养物，其中所述葡萄糖苷酶是扣囊复膜酵母菌葡萄糖苷酶。
172.权利要求171的共培养物，其中所述葡萄糖苷酶是扣囊复膜酵母菌 (S. fibuligera) β -葡萄糖苷酶 I。
173.权利要求172的共培养物，其中所述β-葡萄糖苷酶包含SEQID NO 40的氨基酸序列。
174.权利要求137-173任一项的共培养物，其中所述内切葡聚糖酶是里氏木霉(T. reesei)、澳洲乳白蚁(C. Iacteus)、台湾家白蚁(C. formosanus)、高山象白蚁(N. takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C. acinaciformis)、达尔文澳白虫义(M. darwinensis) > N. walkeri> H 月匈 1 白虫义(R. speratus) > Sffi^ (Aspergillus kawachii)、舌甘胃 Ifi ■ _ & (Heterodera schachtii) > tl Ii 1 ^ (H. jecorina)、 Orpinomyces属或白囊耙齿菌(Irpex lacteus)内切葡聚糖酶。
175.权利要求174的共培养物，其中所述内切葡聚糖酶是台湾家白蚁(C.formosanus) 内切葡聚糖酶。
176.权利要求175的共培养物，其中所述内切葡聚糖酶包含SEQIDNO :31的氨基酸序列。
177.权利要求174的共培养物，其中所述内切葡聚糖酶是红褐肉座菌(H.jecorina)内切葡聚糖酶。
178.权利要求177的共培养物，其中所述内切葡聚糖酶包含SEQIDNO 54的氨基酸序列。
179.权利要求137-169或171-176任一项的共培养物，其中(a)所述内切葡聚糖酶是台湾家白蚁(C.formosanus)内切葡聚糖酶I ；(b)所述β-葡萄糖苷酶是扣囊复膜酵母菌(S. fibuligera) β -葡萄糖苷酶I ；(c)所述第一纤维二糖水解酶是埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I；并且(d)所述第二纤维二糖水解酶是C.Iucknowense纤维二糖水解酶II。
180.权利要求137-169、171-174或177-178任一项的共培养物，其中(a)所述内切葡聚糖酶是红褐肉座菌(H.jecorina)内切葡聚糖酶2 ；(b)所述β-葡萄糖苷酶是扣囊复膜酵母菌(S. fibuligera) β -葡萄糖苷酶I ；(c)所述第一纤维二糖水解酶是埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I；并且(d)所述第二纤维二糖水解酶是C.Iucknowense纤维二糖水解酶II。
181.权利要求137-180任一项的共培养物，其中所述共培养物能够以至少大约IOmg/ 小时/升的速度产生乙醇。
182.权利要求181的共培养物细胞，其中所述共培养物能够以至少大约50mg/小时/ 升的速度产生乙醇。
183.权利要求182的共培养物，其中所述共培养物能够产生至少大约500mg/小时/升。
184.权利要求137-183任一项的共培养物，其中所述第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸和第四多核苷酸中的至少一项是密码子优化的。
185.权利要求137-184任一项的共培养物，其中至少一种宿主细胞是利用木糖的宿主细胞。
186.权利要求185的共培养物，其中所述利用木糖的宿主细胞异源表达I^riomyces属 E2 XylA、过表达木酮糖激酶、核糖5-磷酸异构酶、核糖5-磷酸差向异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶，并且不表达编码醛糖还原酶的GRE3基因。
187.包含含有编码纤维素酶的核酸的至少一个异源多核苷酸的宿主细胞，其中所述纤维素酶具有与SEQ ID NO :54的氨基酸序列至少80%同一的氨基酸序列。
188.权利要求188的宿主细胞，其中所述纤维素酶具有与SEQIDNO :54的氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列。
189.权利要求189的宿主细胞，其中所述纤维素酶具有与SEQIDNO :54的氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列。
190.权利要求187的宿主细胞，其中所述核酸与SEQID NO :49的核苷酸序列至少90% 同一。
191.权利要求187的宿主细胞，其中所述核酸是密码子优化的。
192.权利要求187-191任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酿酒酵母宿主细胞。
193.权利要求187-191任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是克鲁维酵母属的宿主细胞。
194.权利要求187-193任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是耐热的。
195.权利要求187-194任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是利用木糖的宿主细胞。
196.权利要求187-195任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够水解Avicel。
197.权利要求187-196任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含含有编码β-葡萄糖苷酶I的核酸的异源多核苷酸、含有编码纤维二糖水解酶I的核酸的异源多核苷酸和含有编码纤维二糖水解酶II的核酸的异源多核苷酸。
198.权利要求197的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含含有编码扣囊复膜酵母菌 β -葡萄糖苷酶I的核酸的异源多核苷酸、含有编码埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I的核酸的异源多核苷酸和含有编码C. Iucknowense纤维二糖水解酶II的核酸的异源多核苷酸。
199.权利要求197或权利要求198的宿主细胞，其中，当使用纤维素作为碳源生长时， 所述宿主细胞能够产生乙醇。
200.用于水解纤维质的底物的方法，包括将所述纤维质的底物与根据1-136或 187-199任一项的宿主细胞或根据权利要求137-186任一项的共培养物接触。
201.权利要求200的方法，其中所述纤维质底物是选自下列的木质纤维素生物质草、 柳枝稷、大米草、黑麦草、草芦、芒草、糖加工残渣、甘蔗渣、农业废弃物、稻草、稻壳、大麦秸秆、玉米棒、谷物秸秆、小麦秸秆、芸苔秸秆、燕麦秸秆、燕麦壳、玉米纤维、秣草、大豆秸秆、 玉米秸秆、林业废弃物、再生木浆纤维、造纸淤泥、锯屑、硬木、软木、Agave及其组合。
202.权利要求200或权利要求201的方法，还包括将所述纤维质的底物与外部产生的纤维素酶接触。
203.权利要求200-202任一项的方法，其中所述宿主细胞或所述共培养物产生乙醇。
204.使用权利要求1-136或187-199任一项的宿主细胞或权利要求137-186任一项的共培养物发酵纤维素的方法，所述方法包括在含有不可溶的纤维素的培养基中，在合适的条件下将所述转化的宿主细胞或所述共培养物培养足以允许纤维素糖化和发酵的时间。
205.权利要求200-204任一项的方法，其中所述接触或所述培养在至少大约37°C的温度进行。
206.权利要求205的方法，其中所述温度是至少大约42°C。
207.权利要求206的方法，其中所述温度是大约42°C至大约50°C。
208.权利要求207的方法，其中所述温度是大约42°C至大约45°C。
209.权利要求200-208任一项的方法，其中以至少大约IOmg/小时/升的速度产生乙
210.权利要求209的方法，其中以至少大约50mg/小时/升的速度产生乙醇。
211.权利要求210的方法，其中以至少大约500mg/小时/升的速度产生乙醇。
全文摘要
包括表达异源纤维素酶的克鲁维酵母的宿主细胞从纤维素产生乙醇。另外，可以一起共同培养表达不同的异源纤维素酶的多种宿主细胞并用于从纤维素产生乙醇。重组酵母菌株和酵母菌株的共培养物可用于独自地产生乙醇，或者也可以与外部添加的纤维素酶一起使用以增加糖化和发酵过程的效率。
文档编号C12P21/00GK102272303SQ200980153709
公开日2011年12月7日 申请日期2009年11月23日 优先权日2008年11月21日
发明者A·K·沃纳, A·吉尔伯特, A·弗罗利赫, C·甘地, C·赖斯, D·墨菲, D·威尔斯, D·拉格兰格, E·A·斯通豪斯, E·布列夫诺瓦, E·范齐尔, H·H·豪, H·徐, I·谢克哈尔, J·D·基廷, J·乌西塔洛, J·弗莱特, J·维拉里, J·麦克布赖德, K·德洛尔特, M·伊尔曼, M·彭蒂莱, M·梅隆, M·西尔卡-阿霍, N·索恩格伦, R·登哈恩, S·罗斯, V·拉吉加里亚 申请人:斯泰伦博斯大学, 马斯科马公司