专利名称：嵌合dna聚合酶的利记博彩app
嵌合DNA聚合酶本申请要求于2008年11月3日提交的美国临时专利申请序列号61/110，862的优先权，将其全部披露内容以引用方式结合于本文。
背景技术：
DNA聚合酶是使用单链DNA作为模板来合成互补DNA链的酶。尤其是，DNA聚合酶可以将游离核苷酸添加到新形成链的3’端，从而导致新链在5’ -3’方向的延伸。一些 DNA聚合酶可以校正在新合成的DNA中的错误。该过程称作错误校正(纠错)。这些聚合酶可以识别错误地加入(结合)的核苷酸并且酶的3’ - > 5’核酸外切酶(外切核酸酶) 活性允许切除不正确的核苷酸(该活性称作校对)。在碱基切除以后，聚合酶可以重新插入正确碱基并且复制可以继续。与如果合成仅是碱基配对选择步骤的结果相比，校对功能使 DNA 复制具有高得多的保真性(fidelity)。Brutlag, D. and Romberg, Α.，J. Biol. Chem.，247 :241_248 (1972)。当与具有非校对核酸外切酶的聚合酶相比时，具有3，-5，校对核酸外切酶活性的DNA聚合酶具有显著更低的错误率。Chang, L. Μ. S.，J. Biol. Chem.， 252 1873-1880 (1977)。然而，有时，这些聚合酶的优点被它的相对低的持续合成能力 (processivity)(其会降低DNA扩增产物的产率)所抵消。
发明内容
本发明包括以下发现在嵌合酶中，域切换(功能区切换，domain swapping)可以结合不同DNA聚合酶的期望的功能特性(例如，高持续合成能力，高延伸率，热稳定性，对盐、PCR添加物(例如，PCR增强子)以及其它杂质的抗性，以及高保真性)。因此，本发明尤其提供了稳健、快速以及准确的DNA聚合酶，用于DNA扩增、合成、检测、测序以及其它重要的重组DNA技术。在一个方面，本发明提供了嵌合聚合酶，该嵌合聚合酶包含第一域(第一结构域)，其具有至少 80% (例如，至少 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%,99% )相同于在第一 DNA聚合酶(特征在于高持续合成能力、延伸率、抗盐性、热稳定性或TMAC耐受性)中发现的氨基酸序列的序列；以及第二域，其具有至少80% (例如，至少 85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% )相同于在第二 DNA聚合酶 (特征在于高保真性)中发现的氨基酸序列的序列，其中嵌合聚合酶的特征在于高保真性和高持续合成能力、延伸率、或抗盐性。如在本文中所使用的，术语“高持续合成能力”是指借助于模板的持续合成能力高于20壯8(例如，高于401^8、601^8、801^8、100壯8、1201^8、 140nts、160nts、180nts、200nts、220nts、240nts、260nts、280nts、300nts、320nts、340nts、 360ntS、380ntS、400ntS、或更高)/缔合/解离。如在本文中所使用的，术语“高延伸率”是指高于 25nt/s (例如，高于 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、 115、120、125、130、135、140nt/s)的延伸率。如在本文中所使用的，术语“高抗盐性”是指在高于301111(例如，高于351111、401111、451111、或501111)的盐浓度下DNA聚合酶基本上保持它的酶活性的能力。如在本文中所使用的，术语“高保真性”是指错误率小于4. 45 X ΙΟ"6 (例如，小于 4. 0 X 1(Γ6、3· 5 X 1(Γ6、3. OX 1(Γ6、2· 5 X 1(Γ6、2· 0 X 1(Γ6、1· 5 X 1(Γ6、1· 0 X 1(Γ6、0· 5 X IO"6) 突变/nt/加倍。如在本文中所使用的，术语“高TMAC耐受性”是指在高于IOmM(例如，高于15mM、20mM、25mM、30mM)的TMAC(四甲基氯化铵)浓度下DNA聚合酶基本上保持它的酶活性的能力。如在本文中所使用的，术语“高热稳定性”是指在98°C下在大于30分钟温育 (例如，45分钟、60分钟、90分钟、180分钟、210分钟、240分钟)以后DNA聚合酶基本上保持它的酶活性的能力。术语“持续合成能力”、“延伸率”、“保真性”、“抗盐性”、“TMAC耐受性”、以及“热稳定性”在定义部分中进一步定义。在一些实施方式中，适合于本发明的示例性第一 DNA聚合酶包括但不限于KOD聚合酶、TNAl聚合酶、热球菌属9度N-7、T4、T7、或phi29。在一些实施方式中，第一 DNA聚合酶是KOD聚合酶。在一些实施方式中，适合于本发明的示例性第二 DNA聚合酶包括但不限于分离自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、深海热球菌(P. abyssi)、T. gorgonarius、超级嗜热菌(T. Iitoralis)、速生热球菌(T. zilligi) i、热球菌属GT(T. sp. GT)、或火球菌属 GB-D (P. sp.GB-D)的聚合酶。在一些实施方式中，第二 DNA聚合酶是Pfu聚合酶。在具体实施方式
中，第一 DNA聚合酶是KOD聚合酶而第二 DNA聚合酶是Pfu聚合酶。在一些实施方式中，合适的第一域是核酸外切酶域、N-末端域、和/或拇指域。在一些实施方式中，合适的第二域是掌域和/或指域。在一些实施方式中，在第一 DNA聚合酶中发现的氨基酸序列对应于KOD聚合酶 (SEQ ID NO 11)的氨基酸残基26至105、KOD聚合酶(SEQ ID NO 11)的氨基酸残基156 至301、和/或KOD聚合酶(SEQ ID NO 11)的氨基酸残基612至749。在一些实施方式中，在第二 DNA聚合酶中发现的氨基酸序列对应于Pfu聚合酶 (SEQ ID NO 9)的氨基酸残基394至563。在一些实施方式中，根据本发明的嵌合聚合酶包括具有共有序列的第一域(第一结构域)，所述共有序列选自由以下组成的组XXLXXXXXXXEGXRXXXXXXVXXXXXDXXXTXXXXXXXXXXVVKXXXXXVLIXXXXXNXXXAXXKXXC XXXXXNFALXXXXXXXXXXXXIXXMXXRFXXXXXXXXXXXXXPXXRXXXXXXXXXXXXXXXXVXXQXXXXXXXEXX TTXXXT (SEQ ID NO :30)，其中X是任何氨基酸或肽键； XXEXXXXYXXXXEXXFXXXXKXXXAXXXXXXXXAXXXXTVXTVKRXXXXQXXXXXRXVEXXXXXFTXXX XXXAXXDXIXXXXX(SEQ ID NO :31)，其中X是任何氨基酸或肽键；XXXXXXXXXXXXXXXXALXXDXXXXKXXXXXXXXTEXXSKXXVXXXXXVXHXXXXXDXKDXXXTXXXX XXXXRXXXRXXXXRXXTXXSXXXXKXSXRXGDXXXPFDXFXXTXXXXXXXXXXXXXXXXXXEXXXRAXX(SEQ ID NO :32)，其中X是任何氨基酸或肽键；NGx1HaEx2DRTFx3PYx4YALLx5DDsx6IEEvKKlTX7ERHGX8X9VX1c1X11X12X13VEKVX14KKFLGX15P X16X17VffKLYX18X19HPQDVPX201RX21KX22REHPa (SEQ ID NO :33)，其中 X1 不是 K ；X2 不是 H ；X3 不是 R ；X4不是I ；X5不是R ；X6不是K ；X7不是G ；X8不是K ；X9不是I ；X10不是R ；X11不是I ；X12不是ν ；X13不是D ；X14不是E ；X15不是K ；X16不是I ；X17不是T ；X18不是L ；X19不是E ；X20不是 T ；X21不是E ；以及X22不是V;Pix1MisYADEx2X3Ax4VlTffKNx5DLpYvx6VvsX7EREMIKRFLRX8X9X10EKDPDX11X12X13TYNGDX14 fdfx15ylx16krx17eklgix18x19x2(ix21grdgsepkx22qrx23o)x24x25avevkgrihfdlyx26vix27rtinlptytl
EAVYEAX28FGX29PKEKVYAX3(iEIX31X32AWEX33 (SEQ ID NO :34)，其中 X1 不是 I ；X2 不是 N ；X3 不是e ；x4不是k ；x5不是i ；x6不是e ；x7不是s ；x8不是i ；x9不是i ；x10不是r ；x11不是i ；x12不是i ；x13不是v ；x14不是s ；x15不是p ；x16不是a ；x17不是a ；x18不是k ；x19不是l ；x20不是 t ；x21不是i ；x22不是m ；x23不是i ；x24不是m ；x25不是t ；x26不是h ；x27不是t ；x28不是i ； x29不是k ；x30不是d ；x31不是a ；x32不是k ；以及x33不是s ；rdwseiaketqarvlex1x2lkx3 ⑶ vex4avrivkevx5x6klx7x8yex9ppeklxiqix11eqitrx12lx13 x14ykax15GPHVA vakx16laax17gvkix18pgx19vix2(iyivlx21gx22gx23ix24x25raix26x27x28ex29dpx3(ikhkyd AeyyienqvlpavX31RilX32X33FG(seq id no 35)，其中 χι 不是 τ ；x2 不是 ι ；x3 不是 η ；x4 不是 e ；x5不是i ；x6不是q ；x7不是a ；x8不是n ；x9不是i ；x10不是a ；x11不是y ；x12不是p ；x13 不是h ；x14不是e ；x15不是i ；x16不是k ；x17不是k ；x18不是k ；x19不是m ；x20不是g ；x21不是r ；x22不是d ；x23不是p ；x24不是s ；x25不是n ；x26不是l ；x27不是a ；x28不是e ；x29不是 y ；x30不是k ；x31不是l ；x32不是e ；以及x33不是g ；以及它们的组合；以及具有共有序列的第二域，所述共有序列选自由以下组成的组xkxxxxxxxxxxxxaxxxxxxxxxxxxxxxxxlxxxxnxxixxxxxxkxxxxixxxxxxxxxhxxxxx xxxxtxxxexqxxxxkixxxxxxkxxxlxxxxfxxxxxxxkxxxxxxxxxxxxxxxxxkxxelvwxxlxxxfxxxx lxixxxxlyxxxxxgesxeixxxxlx(seq id no :36)，其中 x 是任何氨基酸或肽键；Ex1GLffENIVYLDFRx2LYPSI i ithnvspdtlnx3egckx4ydx5apqvghx6fckdx7pgfipsllgx8l leerqkikx9kmkx1(ltxndpiex12x13lldyrqx14aikx15lansx16ygyygyax17arwyckecaesvtawgrx18yi x19x20x21x22kex23eekx24gfkvx25yx26dtdgx27x28atipgx29x30x31ex32x33kkkax34e(seq id no :37)，其中x1不是r ；x2不是s ；x3不是r ；x4不是e ；x5不是v ；x6不是r ；x7不是f ；x8不是d ；x9不是k ；x10不是a ；x11不是i ；x12不是r ；x13不是k ；x14不是r ；x15不是i ；x16不是y ；x17不是 r ；x18不是e ；x19不是t ；x20不是m ；x21不是t ；x22不是i ；x23不是i ；x24不是y ；x25不是i ； x26不是s ；x27不是f ；x28不是f ；x29不是a ；x30不是d ；x31不是a ；x32不是t ；x33不是v ；x34 不是m，以及它们的组合，其中嵌合聚合酶的特征在于高保真性和高持续合成能力、延伸率、抗盐性、tmac或其它pcr增强子耐受性或热稳定性。在一些实施方式中，根据本发明的嵌合聚合酶通过以下共有序列来定义xxxxtxxxxxdxxxxxxixxxxxxexxxxyxxxxexxfxxxxkxxxaxxxxxxxxaxxxxtvxtvkrxx xxqxxxxxrxvexxxxxftxxxxxxaxxdxixxxxxxixxyxxxxxxxxxxxxxxxxvxxxxdxxxxmxxxxxxxxx xxxxxxaexxxlxxxxxxxegxrxxxxxxvxxxxxdxxxtxxxxxxxxxxvvkxxxxxvlixxxxxnxxxaxxkxxc xxxxxnfalxxxxxxxxxxixxmxxrfxxxxxxxxxxxxxpxxrxxxxxxxxxxxxxxxxvxxqxxxxxxxexxttx xxtxxxxxxxxrxxxxxxxvxxxxxxxxxxxxaxxxxxvxxpxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxvxxxxxsxe xyqxxxxexxtxxfxxxxxkxxxxxxxxxxxxaxxxxxxxxxxxxxxxxxlxxxxnxxixxxxxxkxxxxixxxxxx xxxhxxxxxxxxxtxxxexqxxxxkixxxxxxkxxxlxxxxfxxxxxxxkxxxxxxxxxxxxxxxxxkxxelvwxxl xxxfxxxxlxixxxxlyxxxxxgesxeixxxxlxxlxxxxaxxxxaxxxxxxxxxxxxxxxxxxkxxxxxxxxxitx xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxalxxdxxxxkxxxxxxxxtexxskxxvxxxxxvxhxxxxxdxkdxxxtxxxxxx xxrxxxrxxxxrxxtxxsxxxxkxsxrxgdxxxpfdxfxxtxxxxxxxxxxxxxxxxxxexxxraxxxxxxxxxxxx xxxxxxsaxxkpxgt (seq id no :38)，其中x是任何氨基酸或肽键，并且其中嵌合聚合酶具有高于KOD的保真性和高于Pfu的持续合成能力、延伸率、抗盐性、TMAC或其它PCR增强子耐受性或热稳定性。在一些实施方式中，根据本发明的嵌合聚合酶通过以下共有序列来定义XIXDTDYXTXDGXPXXRIFXKXXGEFXXXYDXXFEPYFYALLKDDSAIXXXXXXXAXRHGTVXTVKRXX XXQXKFLXRXVEVWXLXFTHPQDVPAXXDXIXXHXXVIDIYEYDIPFAKRYLIDXGLVPMEGDEXLXMXXXDIETXY HEGXEFAEGXXLMISYADXEGARVITWKXVDLPYVDVVSTEXEMIKRXXXWKEKDPDVLIXYX⑶NFDXAYLKXRC EXLGXNFALXRXXXXXEPKIXXMGXRFAVEXKGRXHFDLXPXXRXTXNLPTYXLXXVYEXVXGQXKXKXXXEEITTX WETXXXXXXXARYSMEDAXVTXELGXEFXPMEAXLXXLVGXPXWDVXRSSTGNLVEWXLLXXAYXRNEVAPNKPSXE EYQXRXXEXYTGXFVXEPEKGLWXXXXXLDXXALYPSIIXXHNVSPDTLXLEXCXNYDIAPXVGXKFCKDIPGFIPS XLXHLXXXRQXXKTXMXEXQDPXEKIXLDYRQKAXKLLXNSFYGYXGYXKARWYXXECAESVTXWGRKYIELVWXEL EXXFGFKXLYIDTDGLYATIPGGESXEIKXXXLXFLXYINAXLPGALELEYEXFYXRGFFVXKKKYAXIDEEXXITT RGLEXVRRDWSXXAKETXAXVLEALLXDXXVXKAVXXVXXXTEXXSKYXVPXEKLVIHEQITRDXKDYXATGPHVAX AKRLXXRGXXXRPGTXISYXXLKGSGRX⑶RXIPFDEFXXTKHXYDXXYYIENQVLPAVERXLRAFGYXXXXLXXQX XXQXGLSAffXKPXGT (SEQ ID NO :39)，其中X是任何氨基酸或肽键。在一些实施方式中，本发明进一步提供了嵌合聚合酶，该嵌合聚合酶包含第一域， 其具有至少 80% (例如，至少 85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%, 99% )相同于在第一 DNA聚合酶的核酸外切酶域、N-末端域、和/或拇指域中发现的氨基酸序列的序列；以及第二域，其具有至少80% (例如，至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%)相同于在第二 DNA聚合酶的掌和/或指域中发现的氨基酸序列的序列。在一些实施方式中，嵌合聚合酶具有高于第二 DNA聚合酶的保真性以及高于第一 DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、抗盐性、TMAC或其它PCR增强子耐受性或热稳定性。在另一方面，本发明提供了用于设计(基因改造，engineering)嵌合聚合酶的方法。根据本发明的方法包括以下步骤(a)提供基于第一 DNA聚合酶的N-末端域、核酸外切酶域、和/或拇指域；(b)提供基于第二 DNA聚合酶的掌和/或指域；(c)结合(组合)来自步骤(a)和步骤(b)的域以形成嵌合聚合酶；其中嵌合聚合酶具有高于第一 DNA聚合酶的保真性以及高于第二 DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、抗盐性、TMAC或其它PCR增强子耐受性或热稳定性。在一些实施方式中，根据本发明设计(engineered)的嵌合聚合酶具有基本上类似于第一 DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、抗盐性、TMAC或其它PCR增强子耐受性或热稳定性以及基本上类似于第二 DNA聚合酶的保真性。在一些实施方式中，适合于本发明的示例性第一 DNA聚合酶包括但不限于KOD聚合酶、TNAl聚合酶、热球菌属9度N-7、T4、T7、或phi29。在一些实施方式中，第一 DNA聚合酶是KOD聚合酶。在一些实施方式中，适合于本发明的示例性第二 DNA聚合酶包括但不限于分离自激烈火球菌、深海热球菌、T. gorgonarius、超级嗜热菌(T. Iitoralis)、速生热球菌(T. zilligii)、热球菌属GT(T. sp. GT)、或火球菌属GB-D(P. sp. GB-D)的聚合酶。在一些实施方式中，第二 DNA聚合酶是Pfu聚合酶。在一些实施方式中，第一 DNA聚合酶是KOD聚合酶而第二 DNA聚合酶是Pfu聚合酶。在一些实施方式中，第一 DNA聚合酶是Pfu聚合酶而第二 DNA聚合酶是KOD聚合酶。在一些实施方式中，本发明提供了改善DNA聚合酶的保真性的方法。在具体实施方式
中，根据本发明的方法包括以下步骤用来自特征在于相对于感兴趣的DNA聚合酶具有更高保真性的不同DNA聚合酶的相应序列替代在感兴趣的DNA聚合酶的掌和/或指域内的序列。在一些实施方式中，本发明提供了改善DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、抗盐性、TMAC或其它PCR增强子耐受性或热稳定性的方法。在具体实施方式
中，根据本发明的方法包括以下步骤用来自特征在于相对于感兴趣的DNA聚合酶具有更高持续合成能力、 延伸率、抗盐性、TMAC或其它PCR增强子耐受性或热稳定性的不同的DNA聚合酶的相应序列，来替代感兴趣的DNA聚合酶的N-末端域、核酸外切酶域和/或拇指域内的序列。本发明提供了本文描述的各种嵌合聚合酶，包括利用如本文描述的本发明的方法设计(engineered)和/或改善的嵌合聚合酶。在一些实施方式中，根据本发明的嵌合聚合酶包含这样的氨基酸序列，其至少80%相同于SEQ ID NO: 16 (Kofu氨基酸序列，如在序列部分中所示出的)。在特定实施方式中，根据本发明的嵌合聚合酶包含SEQ ID N0:16的氨基酸序列。在一些实施方式中，根据本发明的嵌合聚合酶包含这样的氨基酸序列，其至少 80%相同于SEQ ID N0:15(Pod氨基酸序列，如在序列部分中所示出的)。在特定实施方式中，根据本发明的嵌合聚合酶包含SEQ ID NO :15的氨基酸序列。本发明还提供了包含本文描述的各种嵌合聚合酶的试剂盒和组合物，以及它们的应用(例如，利用本发明的嵌合DNA聚合酶来扩增DNA片段的方法)。此外，本发明提供了编码本文描述的各种嵌合聚合酶的核苷酸序列，以及包含根据本发明的核苷酸序列的载体和/或细胞。
附图仅用于说明的目的而不是用于限制目的。图1示出了在示例性的天然存在的B型DNA聚合酶和示例性的嵌合DNA聚合酶， Kofu和Pod中域的序列对比。在Kofu和Pod嵌合体中被切换的KOD和Pfu聚合酶域示在序列对比上方。图2示出了示例性的嵌合聚合酶Pod包含Pfu的N-末端域、3’ _5’核酸外切酶域和拇指域以及KOD的掌和指域，而相互嵌合的聚合酶Kofu包含KOD的N-末端域、3’ -5’核酸外切酶域和拇指域以及Pfu的掌和指域。图3描绘了示例性的结果，其示出了 KOD、PfiuKofu以及Pod的热稳定性。图4描绘了示例性的结果，其示出了 KOD、PfiuKofu以及Pod的抗盐性。图5描绘了示例性的结果，其示出了 KOD、Pfu、Kofu以及Pod的TMAC耐受性。定义氨基酸如在本文中所使用的，术语“氨基酸”，在其最广泛的意义上，是指可以被加入(结合)到多肽链的任何化合物和/或物质。在一些实施方式中，氨基酸具有一般结构 H2N-C(H) (R)-C00H。在一些实施方式中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方式中， 氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方式中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方式中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常在天然存在的肽中发现的任何的二十种标准L-氨基酸。“非标准氨基酸”是指不同于标准氨基酸的任何氨基酸，而不管它是合成制备的或者获自天然来源。如在本文中所使用的，“合成氨基酸”包括化学修饰氨基酸，其包括但不限于盐、氨基酸衍生物(如酰胺)、和/或取代。氨基酸，包括在肽中的羧基末端和/或氨基末端氨基酸，可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、和/或用其它化学基团的取代加以修饰。氨基酸可以参与二硫键。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互换使用，并且可以指游离氨基酸和/ 或肽的氨基酸残基。根据其中使用该术语的上下文将显而易见的是，它是指游离氨基酸或肽的残基。应该指出的是，所有氨基酸残基序列在本文中是用化学式表示，其左和右方向是在氨基末端至羧基末端的常规方向。碱基对(bp):如在本文中所使用的，碱基对是指在双链DNA分子中腺嘌呤㈧与胸腺嘧啶(T)、或胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的伙伴关系(合作关系)。嵌合聚合酶如在本文中所使用的，术语“嵌合聚合酶”(也被称为“嵌合体”)是指任何聚合酶，该聚合酶包含两个或更多个异源域、氨基酸序列、肽、和/或蛋白质，其共价或非共价连接以产生在自然界中并不存在的聚合酶。通常，嵌合聚合酶包含连接于第二域的第一域，其中第一域和第二域并不以相同关系存在于自然界中。通常，第一域衍生自第一 DNA聚合酶而第二域衍生自第二 DNA聚合酶。通常，第一 DNA聚合酶和第二 DNA聚合酶的特点在于至少一种不同的功能特性(例如，持续合成能力、延伸率、保真性、盐耐受性、相对于 PCR添加物的耐受性或热稳定性)。如在本文中所使用的，衍生自感兴趣的DNA聚合酶的序列是指在感兴趣的DNA聚合酶中发现的任何序列、或任何这样的序列，其至少70% (例如， 至少 75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% )相同于在感兴趣的DNA聚合酶中发现的氨基酸序列。根据本发明的“嵌合聚合酶”可以包含来自相关或类似聚合酶的两个或更多个氨基酸序列(例如，共享类似序列和/或结构的蛋白)， 其加以连接以形成新的功能蛋白。根据本发明的“嵌合聚合酶”可以包含来自非相关聚合酶的两个或更多个氨基酸序列，其加以连接以形成新的功能蛋白。例如，本发明的嵌合聚合酶可以是由不同种类的生物体表达的蛋白质结构的“种间”或“基因间”融合。互补如在本文中所使用的，术语“互补”是指在两个多核苷酸链的区域之间或在两个核苷酸的区域之间通过碱基配对的序列互补性的广义概念。已知，腺嘌呤核苷酸能够与作为胸腺嘧啶或尿嘧啶的核苷酸形成特定的氢键(“碱基配对”)。类似地，已知，胞嘧啶核苷酸能够与鸟嘌呤核苷酸碱基配对。DNA结合亲合力如在本文中所使用的，术语“DNA结合亲合力”通常是指DNA聚合酶在结合DNA核酸方面的活性。在一些实施方式中，可以用二条带移位分析(测定)来测量 DNA结合活性。例如，在一些实施方式中(基于Guagliardi等人(1997) J. Mol. Biol. 267 841-848的测定)，利用标准方法，用32P标记双链核酸(来自S. solfataricus IacS基因的 452-bp HindIII-EcoRV 片段)至至少约 2. 5 X 107cpm/μ g (或至少约 4000cpm/fmol)的比活性。参见，例如，Sambrook 等人(2001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)的 9. 63-9. 75 (描述核酸的末端标记)。 制备反应混合物，其包含在约IOy 1结合缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)、10%甘油、 25mMKCl、25mM MgCl2)中的至少约0. 5 μ g多肽。将反应混合物加热至37°C，时间为10分钟。将约1 X IO4至5X IO4Cpm(或约0. 5-2ng)的标记双链核酸加入到反应混合物中并温育另外的10分钟。将反应混合物加载到在0. 5X Tris-硼酸盐缓冲液中的天然聚丙烯酰胺凝胶上。在室温下对反应混合物进行电泳。干燥凝胶并利用标准方法对其进行放射自显影。 标记的双链核酸的迁移率的任何可检出的减小表明在多肽与双链核酸之间形成了结合复合物。可以利用标准光密度法来量化这样的核酸结合活性以测量相对于在初始反应混合物中的放射性的总量在结合复合物中的放射性的量。测量DNA结合亲合力的其它方法在本领域中是已知的(参见，例如，Kong et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(3) 1965-1975)。域如在本文中所使用的，术语“域”是指多肽(例如，聚合酶)的氨基酸序列，其包含一种或多种定义的功能或性能。延伸率如在本文中所使用的，术语“延伸率”是指DNA聚合酶延伸聚合物链的平均速度。如在本文中所使用的，高延伸率是指高于25nt/s的延伸率(例如，高于30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140nt/s)。酶活性如在本文中所使用的，术语“酶活性”是指DNA聚合酶的特异性和效率。 DNA聚合酶的酶活性也被称为“聚合酶活性”，其通常是指DNA聚合酶在催化多核苷酸的模板定向(导向)合成方面的活性。可以利用本领域中已知的各种技术和方法来测量聚合酶的酶活性。例如，可以在稀释缓冲液(例如，20mM Tris. Cl, pH8. 0,50mM KC1,0. 5% NP40, 以及0.5%吐温-20)中制备连续稀释的聚合酶。对于每次稀释，可以除去5μ1并加入到 45 μ 1的反应混合物中，所述反应混合物包含25mM TAPS (pH9. 25)、50mM KCl、2mM MgCl2,
0.2mM dATP、0. 2mM dGTP、0. 2mM dTTP、0. ImM dCTP、12. 5 μ g 激活的 DNA、100 μ M[ α -32P] dCTP(0. 05yCi/nmol)以及无菌去离子水。可以在37°C (或74°C，对于耐热DNA聚合酶) 下温育反应混合物10分钟，然后通过立即将反应冷却至4°C并添加10 μ 1冰冷的60mM EDTA 来终止。可以从每个反应混合物中除去25 μ 1等分部分。可以通过凝胶过滤(Centri-S印， Princeton Separations, Adelphia,N. J.)从每个等分部分除去未结合的放射性标记dCTP。 可以使柱洗脱液与闪烁液(Iml)混合。借助于闪烁计数器来量化柱洗脱液中的放射性以确定通过聚合酶合成的产物量。一个单位的聚合酶活性可以定义为在30分钟内合成10纳摩尔产物所必要的聚合酶的量(Lawyer et al. (1989) J. Biol. Chem. 264 :6427_647)。测量聚合酶活性的其它方法在本领域中是已知的(参见，例如，Sambrook et al. (2001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual(3rd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY))。保真性如在本文中所使用的，术语“保真性”是指通过模板依赖性DNA聚合酶的 DNA聚合的精确度。通常通过错误率(加入不准确的核苷酸，即，并不互补于模板核苷酸的核苷酸的频率)来测量DNA聚合酶的保真性。通过聚合酶活性和DNA聚合酶的3’ -5’ 核酸外切酶活性来维持DNA聚合的精确度或保真性。术语“高保真性”是指错误率小于 4. 45 X IO"6 (例如，小于 4. 0X10_6、3. 5 X ΙΟ-6』· 0 X 1(Γ6、2· 5 X 1(Γ6、2. 0 X 1(Γ6、1. 5Χ1(Γ6、
1.OX 10_6、0. 5Χ 10_6)突变/nt/加倍。可以利用本领域已知的测定方法来测量DNA聚合酶的保真性或错误率。例如，可以利用在Cline，J. et al. (96)NAR 24 :3546_3551中所描述的IacI PCR保真性分析(测定)来测试DNA聚合酶的错误率。简单地说，使用在适当的 PCR缓冲液中的2. 5U DNA聚合酶(S卩，为在30分钟内在72°C下加入25nmol的总dNTP所必要的酶的量)，从PPRIAZ质粒DNA扩增编码lacIOlacZa靶基因的1. 9kb片段。然后将包含IacI的PCR产物克隆到XGT 10臂中，并用颜色筛选试验来确定IacI突变体的百分比 (MF,突变频率)，如(Lundberg，K. S.，Shoemaker, D. D.，Adams, M. W. W.，Short, J. Μ.，Sorge, J. A. ,and Mathur,E. J. (1991)Genel80 :1_8)所描述的。错误率表示为突变频率/bp/复制 (MF/bp/d)，其中bp是在IacI基因序列(349)中可检测位点的数目而d是有效靶加倍的数目。与上述类似，包含lacIOlacZa靶基因的任何质粒可以被用作用于PCR的模板。可以将 PCR产物克隆到不同于XGT(例如，质粒)的载体中，其便于进行蓝色/白色筛选。
连接如在本文中所使用的，“连接”是指本领域中已知的用于功能上连接多肽域的任何方法，其包括但不限于重组融合(有或没有间插域)、中间介导的(inter-mediated) 融合、非共价缔合、以及共价键合(结合)，包括二硫键合(结合)、氢键合、静电键合、以及构象键合。核苷酸如在本文中所使用的，是指由糖部分(戊糖)、磷酸酯、以及含氮杂环碱基构成的DNA或RNA的单体单元。碱基经由糖苷碳(戊糖的1'碳)而连接至糖部分，并且碱基和糖的组合是核苷。当核苷包含结合于戊糖的3’或5’位置的磷酸酯基团时，它被称作核苷酸。可操作上连接的核苷酸的序列在本文中通常称作“碱基序列”或“核苷酸序列”，并且在本文中由化学式表示，其左到右方向是在5’ _末端至3’ -末端的常规方向。寡核苷酸或多核苷酸如在本文中所使用的，术语“寡核苷酸”定义为这样的分子， 其包括两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸，优选多于三个。它的确切尺寸将取决于许多因素，其又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。可以通过合成或通过克隆来获得寡核苷酸。如在本文中所使用的，术语“多核苷酸”是指这样的聚合物分子，其包括在链中共价结合的核苷酸单体。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的实例。聚合酶如在本文中所使用的，“聚合酶”是指催化核苷酸的聚合(即，聚合酶活性)的酶。通常，该酶将在退火至多核苷酸模板序列的引物的3’-端开始合成，并将继续朝向模板链的5’端。“DNA聚合酶”催化脱氧核苷酸的聚合。持续合成能力如在本文中所使用的，“持续合成能力”是指聚合酶保持附着于模板以及进行多种修饰反应的能力。“修饰反应”包括但不限于聚合、以及核酸外切剪切。在一些实施方式中，“持续合成能力”是指DNA聚合酶进行一系列聚合步骤而没有干预酶与增长DNA链的解离的能力。通常，DNA聚合酶的“持续合成能力”是通过核苷酸的长度(例如 20ntS、300ntS、0. 5_lkb、或更长)来测量的，其中对核苷酸进行聚合或修饰而没有干预DNA 聚合酶与增长DNA链的解离。“持续合成能力”可以取决于聚合酶的特性、DNA模板的序列、 以及反应条件，例如，盐浓度、温度或特定蛋白质的存在。如在本文中所使用的，术语“高持续合成能力”是指与模板的高于20nts (例如，高于40nts、60nts、80nts、100nts、120nts、 140nts、160nts、180nts、200nts、220nts、240nts、260nts、280nts、300nts、320nts、340nts、 360ntS、380ntS、400ntS、或更高)/缔合/解离的持续合成能力。可以按照在本文中以及在 WO 01/92501A1中所定义的方法来测量持续合成能力。引物如在本文中所使用的，术语“引物”是指寡核苷酸，无论是天然存在的或人工合成的，当被放置在其中诱导引物延伸产物(其互补于核酸链)的合成的条件下，例如，在适当缓冲液(“缓冲液”包括适当的PH、离子强度、辅因子(协同因子)等)中存在四种不同三磷酸核苷和耐热酶的条件下并在合适的温度下，其能够作为核酸合成的起始点。引物优选为单链，以获得扩增的最高效率，但可以可替换地是双链。如果是双链，则在用来制备延伸产物以前首先处理引物以分开其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在耐热酶存在的情况下引发延伸产物的合成。引物的准确长度将取决于许多因素， 包括温度、引物源以及方法的使用。例如，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常包含 15-25个核苷酸，虽然它可以包含更多或更少的核苷酸。短引物分子通常需要较低的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合物。抗盐性如在本文中所使用的，术语“抗盐性”(也被称为盐耐受性)是指在盐或PCR添加物(例如，TMAC)存在的情况下DNA聚合酶基本上保持它的酶活性的能力。在一些实施方式中，通过在其下DNA聚合酶仍然具有活性的最大盐浓度来测量对盐或PCR添加物的抗性。对于每种聚合酶，最大盐浓度是不同的并且在本领域中是已知的，或者可以按照本领域中的方法实验上来确定。例如，在30mM盐(存在)下(在PCR反应中)，Pfu受到抑制。合成如在本文中所使用的，术语“合成”是指用于以模板依赖性方式来制备多核苷酸的新链或延伸现有的多核苷酸(即，DNA或RNA)的任何体外方法。根据本发明，合成包括扩增，借助于使用聚合酶，其可以增加多核苷酸模板序列的拷贝数。多核苷酸合成(例如，扩增)导致核苷酸添加到多核苷酸(即，引物)中，从而形成与多核苷酸模板互补的新多核苷酸分子。形成的多核苷酸分子和它的模板可以被用作模板来合成另外的多核苷酸分子。如在本文中所使用的，“DNA合成”包括但不限于PCR、多核苷酸的标记(即，用于探针和寡核苷酸引物)、多核苷酸测序。模板DNA分子如在本文中所使用的，术语“模板DNA分子”是指这样的核酸链，通过DNA聚合酶从其合成互补核酸链，例如，在引物延伸反应中。模板依赖性方式如在本文中所使用的，术语“模板依赖性方式”是指这样的方法， 其涉及引物分子的模板依赖性延伸(例如，通过DNA聚合酶的DNA合成)。术语“模板依赖性方式”通常是指RNA或DNA的多核苷酸合成，其中通过众所周知的互补碱基配对规则来决定新合成的多核苷酸链的序列(参见，例如，Watson, J. D. et al.，In =Molecular Biology of the Gene, 4th Ed. , W. A. Benjamin, Inc. , Menlo Park, Calif. (1987))。耐热酶如在本文中所使用的，术语“耐热酶”是指这样的酶，其对于加热是稳定的 (也被称为耐热)并催化(促进)核苷酸的聚合以形成互补于多核苷酸模板序列的引物延伸产物。通常，在热循环过程中耐热聚合酶是优选的，其中在PCR循环过程中通过曝露于高温(例如，约95°C )来使双链核酸变性。本文描述的有效用于PCR扩增反应的耐热酶满足至少一个标准，即，当经受升高的温度为实现双链核酸的变性所必要的时间时，该酶并没有变得被不可逆地变性(灭活)。用于本文目的的不可逆变性是指酶活性的永久和完全丧失。 变性必要的加热条件将取决于，例如，缓冲盐浓度以及待变性核酸的长度和核苷酸组成，但通常在约90°C至约96°C的范围内，时间主要取决于温度和核酸长度，通常为约0. 2至4分钟。当增加缓冲盐浓度和/或核酸的GC组成时，可以容忍更高的温度。在一些实施方式中，在约90°C -100°C下，耐热酶将不会被不可逆地变性。通常，适合于本发明的耐热酶具有它发挥作用的高于约40°C的最佳温度，其是这样的温度，在低于上述温度下可以促进引物与模板的杂交，虽然，取决于(1)镁和盐浓度以及(2)引物的组成和长度，可以在更高的温度(例如，45°C-70°C)下发生杂交。用于酶的最佳温度越高，则引物定向(导向，引导)的延伸过程的特异性和/或选择性就越高。然而，低于40°C (例如，在37°C下)具有活性的酶也在本发明的范围内，只要它们是热稳定的。在一些实施方式中，最佳温度在约50°C至 900C (例如，60°C -80°C )范围内。TMAC或其它PCR增强子耐受性如在本文中所使用的，术语“TMAC或其它PCR增强子耐受性”(也被称为TMAC或其它PCR增强子抗性)是指在TMAC或其它PCR增强子(例如，甘油、DMS0、甜菜碱、酰胺、其它四甲基铵盐)存在的情况下DNA聚合酶基本上保持它的酶活性的能力。
具体实施例方式本发明尤其是提供了嵌合DNA聚合酶，该嵌合DNA聚合酶包含异源域，该异源域具有衍生自至少两种DNA聚合酶的序列，所述至少两种DNA聚合酶具有至少一种不同的功能特性(例如，延伸率、持续合成能力、错误率或保真性、盐耐受性或耐性)，以及制备和使用嵌合DNA聚合酶的方法。DNA聚合酶根据本发明的嵌合DNA聚合酶可以设计自任何DNA聚合酶，尤其是耐热聚合酶。通常，将DNA聚合酶分为六个家族A、B、C、D、X以及Y。家族A、B、C是基于它们分别与大肠杆菌聚合酶I、II、以及III的氨基酸序列同源性来分组的。家族X没有同源大肠杆菌聚合酶。在一些实施方式中，适合于本发明的DNA聚合酶是家族B DNA聚合酶。家族B聚合酶包括但不限于大肠杆菌pol II、古菌聚合酶、PRD1、phi29、M2、T4噬菌体DNA聚合酶、真核生物聚合酶α、Δ、ε、以及许多病毒聚合酶。在一些实施方式中，适合于本发明的DNA聚合酶是古菌聚合酶(例如，宽古菌聚合酶(euryarchaeal polymerases))。适宜的示例性古菌聚合酶包括但不限于DNA聚合酶，其来自古菌(例如，嗜热高温球菌(Vent ，GenBank :AAA72101)、激烈火球菌(Pfu，GenBank :D12983、BAA02362)、沃氏火球菌、火球菌 GB-D (Deep Vent , GenBank :AAA67131)、超嗜热原始菌 KODI (KOD, GenBank BD175553、BAA06142 ；热球菌属菌株 KOD (Pfx, GenBank :AAE68738))、Thermococcus gorgonarius (Tgo，Pdb :4699806)、硫磺矿硫化叶菌(GenBank :NC002754、P26811)、 Aeropyrum pernix (嗜热泉生古细菌，超嗜热需氧古细菌)(GenBank :BAA81109)、闪烁古生球菌(GenBank :029753)、嗜气菌(GenBank :AAL63952)、隐蔽热网菌(GenBank :BAA07579、 BAA07580)、热球菌属 9 度 Nm(GenBank :AAA88769、Q56366)、Thermococcus fumicolans (热海藻球菌)(GenBank :CAA93738、P74918)、Thermococcus hydrothermalis (热水高温球菌)(GenBank :CAC18555)、热球菌属 GE8 (GenBank :CAC12850)、热球菌属 JDF-3 (GenBank AX135456 ；W00132887)、热球菌属 TY (GenBank :CAA73475)、Pyrococcus abyssi (GenBank P77916)、Pyrococcus glycovorans (GenBank :CAC12849)、Pyrococcus horikoshii (掘越氏热球菌)(GenBank :NP143776)、Pyrococcus sp. GE23 (GenBank :CAA90887)、Pyrococcus sp.ST700(GenBank:CAC12847) 、 Thermococcus pacificus(GenBank :AX411312. 1)、 Thermococcus zilligii (GenBank :DQ3366890)、Thermococcus aggregans、Thermococcus barossii、速生热球菌(GenBank :DD259850. 1)、Thermococcus profundus (GenBank E14137)、Thermococcus siculi (GenBank :DD259857. 1)、Thermococcus thioreducens、 Thermococcus onnurineus NA1、B誉酸热硫化卩十菌、Sulfolobus tokodaii、Pyrobaculum calidifontis、冰岛热棒菌(GenBank :AAF27815)、詹氏甲烧球菌(GenBank Q58295)、Desulforococcus species TOK> Desulfurococcus、热球菌属、热网菌属、 Staphylothermus、Vulcanisaetta、甲烷球菌属(GenBank :P52025)以及其它古菌B聚合酶， 如GenBank AAC62712、P956901、BAAA07579))。另外的代表性温度稳定的家族A和B聚合酶包括，例如，这样的聚合酶，其提取自嗜热菌栖热菌属(例如，黄栖热菌、红栖热菌、嗜热栖热菌、乳栖热菌、红色栖热菌、水生栖热菌)、嗜热脂肪芽胞杆菌、海栖热袍菌、炽热甲烷嗜热菌。
适用于本发明的DNA聚合酶包括还未分离的DNA聚合酶。用于本发明的适宜的聚合酶包括融合聚合酶。融合聚合酶通常包含在N-或C-末端的另外的蛋白质结构域，与没有额外域的聚合酶相比，其会改变融合聚合酶的表型。示例性的聚合酶包括但不限于具有双链DNA结合域的融合于C-或N-末端的聚合酶。融合聚合酶的另外的实例包括那些具有 dUPT酶的融合于N-或C-末端的融合聚合酶(美国专利申请20070190538)。在一些实施方式中，根据本发明的嵌合DNA聚合酶包含来自两种或更多种DNA聚合酶(其具有至少一种不同的功能特性)的序列。示例性的功能特性包括但不限于持续合成能力、延伸率、保真性、对盐或PCR添加剂(例如，PCR增强子)的抗性、热稳定性、链取代活性(移位活性)、核酸外切酶活性、尿嘧啶预读功能、核苷酸选择性、结合修饰类似物的能力、以及逆转录酶活性。例如，一些DNA聚合酶的特征在于高保真性。如在本文中所使用的， 术语“高保真性”是指错误率小于4. 45 X 10_6 (例如，小于4. OX 10_6、3. 5 X 10_6、3. 0 X 10_6、 2. 5Χ1(Γ6、2. 0Χ1(Γ6、1. 5 X 10_6、1. 0 X 10_6、0. 5 X IO"6)突变/nt/加倍。一些 DNA 聚合酶的特征在于高持续合成能力。如在本文中所使用的，术语“高持续合成能力”是指借助于模板的持续合成能力高于 20nts(例如，高于 40nts、60nts、80nts、100nts、120nts、140nts、 160nts、180nts、200nts、220nts、240nts、260nts、280nts、300nts、320nts、340nts、360nts、 380ntS、400ntS、或更高)/缔合/解离。一些DNA聚合酶的特征在于高延伸率。如在本文中所使用的，术语“高延伸率”是指高于25nt/s (例如，高于30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140nt/s)的延伸率。一些酶的特征在于高抗盐性(也被称为盐耐受性)。如在本文中所使用的，术语“高抗盐性”(也被称为高盐耐受性)是指在高于30mM (例如，高于35mM、40mM、45mM、50mM)的盐浓度下DNA聚合酶基本上保持它的活性的能力。此外，一些酶的特征在于对PCR添加物的耐性。某些PCR添加物是PCR增强子。例如，Kovarova等人表明，TMA盐、DMS0、甜菜碱以及甲酰胺作为PCR 增强子(Kovarova and Draber. (2000) Nucl. Acids. Res. 28 (13)，e70)。PCR 增强子的另一个实例是甘油。一些酶的特征在于对PCR增强子、尤其是TMAC的耐性(也被称为TMAC耐受性)。如在本文中所使用的，术语“高TMAC耐受性”是指在高于IOmM(例如，高于15mM、 20mM)的TMAC(四甲基氯化铵)浓度下DNA聚合酶基本上保持它的酶活性的能力。示例性的DNA聚合酶的某些特性在表1中示出。表1.示例性DNA聚合酶的特性
权利要求
1.一种嵌合聚合酶，包括第一域，具有至少80%相同于在第一 DNA聚合酶中发现的氨基酸序列的序列，所述第一DNA聚合酶的特征在于高持续合成能力、延伸率、抗盐性、热稳定性或TMAC耐受性；以及第二域，具有至少80%相同于在第二 DNA聚合酶中发现的氨基酸序列的序列，所述第二DNA聚合酶的特征在于高保真性，其中，所述嵌合聚合酶的特征在于高保真性和高持续合成能力、延伸率、抗盐性、热稳定性或TMAC耐受性。
2.根据权利要求1所述的嵌合聚合酶，其中，所述第一DNA聚合酶选自KOD聚合酶、或 TNAl聚合酶、热球菌属9度N-7、T4、T7或phi29。
3.根据权利要求2所述的嵌合聚合酶，其中，所述第一DNA聚合酶是KOD聚合酶。
4.根据权利要求1所述的嵌合聚合酶，其中，所述第二DNA聚合酶选自分离自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、深海热球菌(P. abyssi)、T. gorgonarius、超级口誉热菌 (T. Iitoralis)、速生热球菌(T. zilligii)、热球菌属 GT(T. sp.GT)、或火球菌属 GB-D(P. sp.GB-D)的聚合酶。
5.根据权利要求4所述的嵌合聚合酶，其中，所述第二DNA聚合酶是Pfu聚合酶。
6.根据权利要求1所述的嵌合聚合酶，其中，所述第一DNA聚合酶是KOD聚合酶而所述第二 DNA聚合酶是Pfu聚合酶。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合聚合酶，其中，所述第一域选自由核酸外切酶域、N-末端域、拇指域以及它们的组合组成的组。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的嵌合聚合酶，其中，所述第二域是掌域和/或指域。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的嵌合聚合酶，其中，在所述第一DNA聚合酶中发现的所述氨基酸序列对应于KOD聚合酶(SEQ ID NO 11)的氨基酸残基156至301。
10.根据权利要求9所述的嵌合聚合酶，进一步包括第三域，所述第三域具有至少80% 相同于氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列对应于KOD聚合酶(SEQ ID NO=Il)的氨基酸残基26至105。
11.根据权利要求10所述的嵌合聚合酶，进一步包括第四域，所述第四域具有至少 80%相同于氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列对应于KOD聚合酶(SEQ ID NO=Il)的氨基酸残基612至749。
12.根据权利要求1-8中任一项所述的嵌合聚合酶，其中，在所述第一DNA聚合酶中发现的所述氨基酸序列对应于KOD聚合酶(SEQ ID NO=Il)的氨基酸残基26至105。
13.根据权利要求12所述的嵌合聚合酶，进一步包括第三域，所述第三域具有至少 80%相同于氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列对应于KOD聚合酶(SEQ ID NO=Il)的氨基酸残基612至749。
14.根据权利要求1-8中任一项所述的嵌合聚合酶，其中，在所述第一DNA聚合酶中发现的所述氨基酸序列对应于KOD聚合酶(SEQ ID NO=Il)的氨基酸残基612至749。
15.根据权利要求14所述的嵌合聚合酶，进一步包括第三域，所述第三域具有至少 80%相同于氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列对应于KOD聚合酶(SEQ ID NO 11)的氨基酸残基156至301。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的嵌合聚合酶，其中，在所述第二DNA聚合酶中发现的所述氨基酸序列对应于Pfu聚合酶(SEQ ID NO 9)的氨基酸残基394至563。
17. 一种嵌合聚合酶，包括具有共有序列的第一域，所述共有序列选自由以下组成的组(1)XXLXXXXXXXEGXRXXXXXXVXXXXXDXXXTXXXXXXXXXXVVKXXXXXVLIXXXXXNXXXAXXKXXCX XXXXNFALXXXXXXXXXXXXIXXMXXRFXXXXXXXXXXXXXPXXRXXXXXXXXXXXXXXXXVXXQXXXXXXXEXXTT XXXT (SEQ ID NO :30)，其中X是任意氨基酸或肽键；(2)XXEXXXXYXXXXEXXFXXXXKXXXAXXXXXXXXAXXXXTVXTVKRXXXXQXXXXXRXVEXXXXXFTXXXX XXAXXDXIXXXXX(SEQ ID NO :31)，其中X是任意氨基酸或肽键；(3)XXXXXXXXXXXXXXXXALXXDXXXXKXXXXXXXXTEXXSKXXVXXXXXVXHXXXXXDXKDXXXTXXXX XXXXRXXXRXXXXRXXTXXSXXXXKXSXRXGDXXXPFDXFXXTXXXXXXXXXXXXXXXXXXEXXXRAXX(SEQ ID NO :32)，其中X是任意氨基酸或肽键；(^NGx1HaEx2DRTFx3PYx4YALLx5DDsx6IEEvKKlTx7ERHGx8X9VX1c1X11X12X13VEKVX14KKFIGX15PX 16X17VWKLYX18X19HPQDVPX201RX21KX22REHPA(SEQ ID NO 33)，其中 X1 不是 K ；X2 不是 H ；X3 不是 R ；X4不是I ；X5不是R ；X6不是K ；X7不是G ；X8不是K ；X9不是I ；X10不是R ；X11不是I ；X12不是ν ；X13不是D ；X14不是E ；X15不是K ；X16不是I ；X17不是T ；X18不是L ；X19不是E ；X20不是 T ；X21不是E ；以及X22不是V;(5)Pix1MisYADEx2X3Ax4VlTffKNx5DLpYvx6VvsX7EREMIKRFLRX8X9X10EKDPDX11X12X13TYNGDX14F dfx15ylx16krx17eklgix18x19x2(ix21grdgsepkx22qrx23o)x24x25avevkgrihfdlyx26vix27rtinlptytleAVYEAX28FGX29PKEKVYAX3(iEIX31X32AWEX33 (SEQ ID NO :34)，其中 X1 不是 I ；X2 不是 N ；X3 不是 E ； X4不是κ ；X5不是I ；X6不是E ；X7不是S ；X8不是I ；X9不是I ；X10不是R ；X11不是I ；X12不是 I ；X13不是V ；X14不是S ；X15不是P ；X16不是A ；X17不是A ；X18不是K ；X19不是L ；X20不是T ； X21 ^^ I ；X22 ^^ M ；X23 ^^ I ；X24 ^^ M ；X25 ^^ T ；X26 ^^ H ；X27 ^^ T ；X28 ^^ I ；X29 不是K ；X30不是D ；X31不是A ；X32不是K ；以及X33不是S ；(6)RDWSEIAKETQARVLEX1X2LKX3 ⑶ VEX4AVRivKEVx5x6KLX7x8YEX9ppEKLX1(lixnEQiTRX12Lx13x 14ykax15gphvavakx16laax17gvkix18pgx19vix2。yivlx21gx22gx23ix24x25raix26x27x28ex29dpx3。khkydaEYnENQVLPAVX31RILX32X33FG (SEQ ID NO :35)，其中 X1 不是 T ;X2 不是 I ；X3 不是 H ;X4 不是 E ； X5不是I ；X6不是Q ；X7不是A ；X8不是N ；X9不是I ；X10不是A ；X11不是Y ；X12不是P ；X13不是H ；X14不是E ；X15不是I ；X16不是K ；X17不是K ；X18不是K ；X19不是M ；X20不是G ；X21不是 R ；X22不是D ；X23不是P ；X24不是S ；X25不是N ；X26不是L ；X27不是A ；X28不是E ；X29不是Y ； X30不是K ；X31不是L ；X32不是E ；以及X33不是G ；以及它们的组合，以及具有共有序列的第二域，所述共有序列选自由以下组成的组(1)XKXXXXXXXXXXXXAXXXXXXXXXXXXXXXXXLXXXXNXXIXXXXXXKXXXXIXXXXXXXXXHXXXXXX XXXTXXXEXQXXXXKIXXXXXXKXXXLXXXXFXXXXXXXKXXXXXXXXXXXXXXXXXKXXELVWXXLXXXFXXXXLX IXXXXLYXXXXXGESXEIXXXXLX(SEQ ID NO :36)，其中 X 是任何氨基酸或肽键；(2)Ex1GLffENivYLDFRx2LYpsHlTHNvspDTLNx3EGcKx4YDx5ApQvGHx6FCKDx7PGFIPsLLGx8LLE ERQKIKX9KMKX1(lTXnDPIEX12X13LLDYRQX14AIKX15LANSX16YGYYGYAX17ARWYCKECAESVTAWGRX18YIX19X 20X21X22KEX23EEKX24GFKVX25YX26DTDGX27X28ATIPGX29X3。X31EX32X33KKKAX34E(SEQ ID NO :37)，其中X1 不是R ；X2不是S ；X3不是R ；X4不是E ；X5不是V ；X6不是R ；X7不是F ；X8不是D ；X9不是K ；X10 ^^ A ；X11 ^ I ；X12 ^^ R ；X13 ^^ K ；X14 ^^ R ；X15 ^^ I ；X16 ^^ Y ；X17 ^^ R ；X18 ^ 是E ；X19不是T ；X20不是M ；X21不是T ；X22不是I ；X23不是I ；X24不是Y ；X25不是I ；X26不是 S ；X27不是F ；X28不是F ；X29不是A ；X30不是D ；X31不是A ；X32不是T ；X33不是V ；X34不是M，以及它们的组合，其中，所述嵌合聚合酶的特征在于高保真性和高持续合成能力、延伸率、抗盐性、热稳定性或TMAC耐受性。
18.一种嵌合聚合酶，包括至少85%相同于SEQ ID NO 16 (Kofu氨基酸序列)的氨基酸序列。
19.根据权利要求18所述的嵌合DNA聚合酶，其中，所述氨基酸序列包括以下共有序列XXXXTXXXXXDXXXXXXIXXXXXXEXXXXYXXXXEXXFXXXXKXXXAXXXXXXXXAXXXXTVXTVKRXXXXQXXXXXRXVEXXXXXFTXXXXXXAXXDXIXXXXXXIXXYXXXXXXXXXXXXXXXXVXXXXDXXXXMXXXXXXXXXX XXXXXAEXXXLXXXXXXXEGXRXXXXXXVXXXXXDXXXTXXXXXXXXXXVVKXXXXXVLIXXXXXNXXXAXXKXXC XXXXXNFALXXXXXXXXXXIXXMXXRFXXXXXXXXXXXXXPXXRXXXXXXXXXXXXXXXXVXXQXXXXXXXEXXTT XXXTXXXXXXXXRXXXXXXXVXXXXXXXXXXXXAXXXXXVXXPXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXVXXXXX SXEXYQXXXXEXXTXXFXXXXXKXXXXXXXXXXXXAXXXXXXXXXXXXXXXXXLXXXXNXXIXXXXXXKXXXXIX XXXXXXXXHXXXXXXXXXTXXXEXQXXXXKIXXXXXXKXXXLXXXXFXXXXXXXKXXXXXXXXXXXXXXXXXKXX EIVWXXLXXXFXXXXLXIXXXXLYXXXXXGE SXEIXXXXLXXLXXXXAXXXXAXXXXXXXXXXXXXXXXXXKXXX XXXXXXITXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXALXXDXXXXKXXXXXXXXTEXXSKXXVXXXXXVXHXXXXXDXK DXXXTXXXXXXXXRXXXRXXXXRXXTXXSXXXXKXSXRXGDXXXPFDXFXXTXXXXXXXXXXXXXXXXXXEXXXR AXXXXXXXXXXXXXXXXXXSAXXKPXGT(SEQ ID NO 38)其中X是任何氨基酸或肽键。
20.根据权利要求18所述的嵌合聚合酶，其中，所述氨基酸序列相同于SEQID NO 16 (Kofu氨基酸序列)。
21.一种嵌合聚合酶，包括以下氨基酸共有序列XXXXTXXXXXDXXXXXXIXXXXXXEXXXXYXXXXEXXFXXXXKXXXAXXXXXXXXAXXXXTVXTVKRXXXX QXXXXXRXVEXXXXXFTXXXXXXAXXDXXXXXXXIXXYXXXXXXXXXXXXXXXXVXXXXDXXXXMXXXXXXXXXXX XXXXAEXXXLXXXXXXXEGXRXXXXXXVXXXXXDXXXTXXXXXXXXXXVVKXXXXXVLIXXXXXNXXXAXXKXXCX XXXXNFALXXXXXXXXXXIXXMXXRFXXXXXXXXXXXXXPXXRXXXXXXXXXXXXXXXXVXXQXXXXXXXEXXTTX XXTXXXXXXXXRXXXXXXXVXXXXXXXXXXXXAXXXXXVXXPXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXVXXXXXS XEXYQXXXXEXXTXXFXXXXXKXXXXXXXXXXXXAXXXXXXXXXXXXXXXXXLXXXXNXXIXXXXXXKXXXXIXX XXXXXXXHXXXXXXXXXTXXXEXQXXXXKIXXXXXXKXXXLXXXXFXXXXXXXKXXXXXXXXXXXXXXXXXKXXE LVWXXLXXXFXXXXLXIXXXXLYXXXXXGESXEIXXXXLXXLXXXXAXXXXAXXXXXXXXXXXXXXXXXXKXXXX XXXXXITXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXALXXDXXXXKXXXXXXXXTEXXSKXXVXXXXXVXHXXXXXDXKD XXXTXXXXXXXXRXXXRXXXXRXXTXXSXXXXKXSXRXGDXXXPFDXFXXTXXXXXXXXXXXXXXXXXXEXXXRA XXXXXXXXXXXXXXXXXXSAXXKPXGT(SEQ IDNO 38)其中X是任意氨基酸或肽键；并且其中，所述嵌合聚合酶具有高于KOD的保真性以及高于Pfu的持续合成能力、延伸率、 抗盐性、热稳定性或TMAC耐受性。
22.根据权利要求21所述的方法，所述氨基酸共有序列是XIXDTDYXTXDGXPXXRIFXKXXGEFXXXYDXXFEPYFYALLKDDSAIXXXXXXXAXRHGTVXTVKRXXXX QXKFLXRXVEVWXLXFTHPQDVPAXXDXIXXHXXVIDIYEYDIPFAKRYLIDXGLVPMEGDEXLXMXXXDIETXYH EGXEFAEGXXLMISYADXEGARVITWKXVDLPYVDVVSTEXEMIKRXXXVVKEKDPDVLIXYX⑶NFDXAYLKXRC EXLGXNFALXRXXXXXEPKIXXMGXRFAVEXKGRXHFDLXPXXRXTXNLPTYXLXXVYEXVXGQXKXKXXXEEITT XWETXXXXXXXARYSMEDAXVTXELGXEFXPMEAXLXXLVGXPXWDVXRSSTGNLVEWXLLXXAYXRNEVAPNKP SXEEYQXRXXEXYTGXFVXEPEKGLWXXXXXLDXXALYPSHXXHNVSPDTLXLEXCXNYDIAPXVGXKFCKDIPG FIPSXLXHLXXXRQXXKTXMXEXQDPXEKIXLDYRQKAXKLLXNSFYGYXGYXKARWYXXECAESVTXWGRKYIE LVffXELEXXFGFKXLYIDTDGLYATIPGGESXEIKXXXLXFLXYINAXLPGALELEYEXFYXRGFFVXKKKYAXI DEEXXITTRGLEXVRRDWSXXAKETXAXVLEALLXDXXVXKAVXXVXXXTEXXSKYXVPXEKLVIHEQITRDXKD YXATGPHVAXAKRLXXRGXXXRPGTXISYXXLKGSGRXiiDRXIPFDEFXXTKHXYDXXYYIENQVLPAVERXLRA FGYXXXXLXXQXXXQXGLSAWXKPXGT(SEQ ID NO 39)其中X是任意氨基酸或肽键。
23.一种嵌合聚合酶，包括第一域，具有至少80%相同于在第一 DNA聚合酶的核酸外切酶域、N-末端域、和/或拇指域中发现的氨基酸序列的序列；以及第二域，具有至少80%相同于在第二 DNA聚合酶的掌域和/或指域中发现的氨基酸序列的序列，其中，所述嵌合聚合酶具有高于所述第二 DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、抗盐性、热稳定性或TMAC耐受性，以及高于所述第一 DNA聚合酶的保真性。
24.根据权利要求23所述的嵌合聚合酶，其中，所述第一DNA聚合酶选自KOD聚合酶、 TNAl聚合酶、热球菌属9度N-7、T4、T7、或phi29。
25.根据权利要求23所述的嵌合聚合酶，其中，所述第一DNA聚合酶是KOD聚合酶。
26.根据权利要求23所述的嵌合聚合酶，其中，所述第二DNA聚合酶选自分离自激烈火球菌、深海热球菌、T. gorgonarius、超级嗜热菌(T. Iitoralis)、速生热球菌 (T. zilligii)、或火球菌属 GB-D(P. sp. GB-D)的聚合酶。
27.根据权利要求26所述的嵌合聚合酶，其中，所述第二DNA聚合酶是Pfu聚合酶。
28.根据权利要求23所述的嵌合聚合酶，其中，所述第一DNA聚合酶是KOD聚合酶而所述第二 DNA聚合酶是Pfu聚合酶。
29.根据权利要求23所述的嵌合聚合酶，其中，所述第一DNA聚合酶是Pfu聚合酶而所述第二 DNA聚合酶是KOD聚合酶。
30.一种嵌合聚合酶，包括至少90%相同于SEQ ID NO 15 (Pod氨基酸序列)的氨基酸序列。
31.一种核苷酸序列，编码根据权利要求1-30中任一项所述的嵌合聚合酶。
32.—种载体，包括根据权利要求31所述的核苷酸序列。
33.一种细胞，包括根据权利要求31所述的核苷酸序列。
34.一种试剂盒，包括根据权利要求1-30中任一项所述的嵌合聚合酶。
35.一种利用根据权利要求1-30中任一项所述的嵌合聚合酶的DNA合成的方法。
36.一种利用根据权利要求1-30中任一项所述的嵌合聚合酶扩增DNA片段的方法。
37.一种设计嵌合聚合酶的方法，所述方法包括以下步骤(a)提供基于第一DNA聚合酶的N-末端域、核酸外切酶域、和/或拇指域；(b)提供基于第二DNA聚合酶的掌域和/或指域；(c)结合来自步骤(a)和步骤(b)的域以形成嵌合聚合酶；其中，所述嵌合聚合酶具有高于所述第二 DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、抗盐性、热稳定性或TMAC耐受性，以及高于所述第一 DNA聚合酶的保真性。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述第一DNA聚合酶选自KOD聚合酶、或TNAl 聚合酶、热球菌属9度N-7、T4、T7、或phi29。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述第一DNA聚合酶是KOD聚合酶。
40.根据权利要求38所述的方法，其中，所述第二DNA聚合酶选自分离自激烈火球菌、 深海热球菌、T. gorgonarius、超级嗜热菌(T. Iitoralis)、速生热球菌(T. zilligii)、热球菌属GT (T. sp. GT)、或火球菌属GB-D (P. sp. GB-D)的聚合酶。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述第二DNA聚合酶是Pfu聚合酶。
42.根据权利要求37所述的方法，其中，所述第一DNA聚合酶是KOD聚合酶而所述第二 DNA聚合酶是Pfu聚合酶。
43.一种利用根据权利要求35-42中任一项所述的方法设计的嵌合聚合酶。
44.一种改善DNA聚合酶的保真性的方法，所述方法包括以下步骤用来自不同的DNA 聚合酶的相应序列替代感兴趣的DNA聚合酶的掌域和/或指域内的序列，所述不同的DNA 聚合酶的特征在于相对于感兴趣的DNA聚合酶具有更高的保真性。
45.一种改善DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、抗盐性、热稳定性或TMAC耐受性的方法，所述方法包括以下步骤用来自不同的DNA聚合酶的相应序列替代在感兴趣的DNA聚合酶的N-末端域、核酸外切酶域和/或拇指域内的序列，所述不同的DNA聚合酶的特征在于相对于感兴趣的DNA聚合酶具有更高的持续合成能力、延伸率、抗盐性或PCR增强子抗性。
46.根据权利要求44或45所述的方法的改进的DNA聚合酶。
全文摘要
本发明尤其提供了嵌合DNA聚合酶，该嵌合DNA聚合酶包括具有来自至少两种DNA聚合酶的序列的异源域，所述至少两种DNA聚合酶具有至少一种不同的功能特性(例如，延伸率、持续合成能力、错误率或保真性、盐耐受性或抗性)，以及制备和应用嵌合DNA聚合酶的方法。在一些实施方式中，本发明可以在嵌合聚合酶中结合不同DNA聚合酶的期望的功能特性(例如，高持续合成能力；高延伸率；热稳定性；对盐、PCR添加物(例如，PCR增强子)以及其它杂质的抗性；以及高保真性)。
文档编号C12N9/12GK102257136SQ200980151063
公开日2011年11月23日 申请日期2009年11月3日 优先权日2008年11月3日
发明者保罗·迈克瓦恩, 加文·拉什, 威廉·布尔恩, 比亚内·弗尔霍尔姆 申请人:卡帕生物系统