阻止结缔组织生长因子的反义核苷酸及其用途
【专利摘要】本发明提供了包含能抑制结缔组织生长因子表达的修饰核苷酸的化合物以及含有同样的修饰核苷酸的组合物，还提供了利用这样的化合物治疗过度增殖病症和纤维变性病的方法，以及减少因伤口愈合引起的瘢痕的方法。
【专利说明】阻止结缔组织生长因子的反义核苷酸及其用途
[0001 ] 在本申请中参考了某些专利和出版物，后者还注明作者，杂志出处和出版日期。这些专利和出版物所披露的内容被全文纳入本申请作为参考以便更加全面地描述与本发明有关的技术的目前动态。
【技术领域】
[0002]本发明涉及用于治疗过度增殖(hyperprolific)病症和纤维变性病，以及减少因伤口愈合引起的瘢痕的新颖反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides, ASOs)。
【背景技术】
[0003]反义技术正在显露出作为一种有效降低特定基因产物的表达的手段，因此，在若干调整结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的表达方面的治疗，诊断和研究应用上可 能证明是异常有用的。(见颁发给Gaarde等人的美国专利U.S.PatentN0.6，965，025B2)
[0004]反义化合物是一种寡聚化合物，能与靶核酸(例如，一种靶标mRNA分子)发生杂交(hybridization)。
[0005]反义化合物，组合物以及调整CTGF的表达和治疗与CTGF表达有关的疾病的方法被披露在上述的美国专利U.S.Patent N0.6，965，025B2中，在此被纳入作为参考。但是，还是需要另外的此类化合物，其能增强对CTGF表达的抑制，提供功能和其他有助的性能。
[0006]在一实施例中，本发明特别地提供了优选的用于抑制CTGF表达的修饰的反义寡核苷酸。业已证实这些修饰的寡核苷酸比先前描述的靶向CTGF的ASOs更具显著的、出乎意料的潜力。
[0007]结缔组织生长因子(CTGF ;也称之为ctgrofact，可诱导成纤维细胞的分泌蛋白(fibroblast inducible secreted protein), fisp-12, N0V2,类似膜岛素生长因子-结合蛋白有关的蛋白质 2，IGFBP-rP2, IGFBP-8，HBGF-0.8，Hcs24，和 ecogenin)是模块蛋白质CCN(CTGF/CYR61/N0V)家族的一员，被提名为经识别的第一家族成员，结缔细胞生长因子，富半胱氨酸(cysteine-rich, CYR61),超量表达的肾母细胞瘤(nephroblastomaoverexpressed, NOV),但是，该家族还包括蛋白质ELM-1 (在低转移性的细胞中表达)，WISP-3 (Wnt-1-诱导的分泌蛋白)，和C0P-1 (WISP-2)。业已发现CCN蛋白质为分泌的，与细胞外基质有关的蛋白质，它调控细胞的过程，像粘附，移动，有丝分裂发生，分化，存活，血管生成，动脉粥样坏死，软骨形成，伤口愈合，肿瘤发生，以及血管和纤维变性的疾病，像硬皮病(scleroderma) (Lau and Lam, Exp.Cell Res.，1999，248，44-57)。结缔组织生长因子蛋白显示出激发DNA的合成和促进成纤维细胞的趋化性(Bradham et al., J.Cell Biol.,1991，114，1285-1294)。
[0008]大多数情况下，在表达的研究中已报导了一种单2.4-千碱基CTGF的转录物，尽管报导了在胶质母细胞瘤中3.5-和7-千碱基的转录物。在正常的分化过程中，结缔组织生长因子在成纤维细胞中表达，分化过程涉及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的生成和重建，像植入后的胚胎发生和子宫蜕膜。结缔组织生长因子频繁地在纤维变性的皮肤病中超量表达，像全身硬化，局部皮肤硬化，瘢痕疙瘩，瘢痕组织，嗜酸性筋膜炎(eosinophilic fasciitis),结节性筋膜炎(nodular fasciitis),和掌挛缩病(Dupuytren; s contracture)。结缔组织生长因子mRNA或者蛋白水平在包括肝，肾,肺,心血管系统，胰，肠，眼和牙龈的主要器官和组织的纤维变性损害中会升高。在乳房，胰腺和纤维组织细胞的肿瘤中，特征明显地累及结缔组织，结缔组织生长因子在基质区室中超量表达。在许多情况下，结缔组织生长因子的表达空间地和时间地与致纤维化因子转化生长因子 _β (transforming growth factor-beta)联系在一起(Moussad and Brigstock, Mol.Genet.Metab.，2000, 71, 276-292)。
[0009]结缔组织生长因子已经被定位到人类染色体区域6q23.1，邻近C_myb基因，涉及该区域的染色体异常已经与人类的肿瘤有关，像肾母细胞瘤(Wilms' tumor) (Martinerieet al.，Oncogene,1992,7,2529-2534)。
[0010]带有显著纤维变性和血管成分的肿瘤呈现出CTGF表达升高，CTGF可能涉及到儿科成肌纤维母细胞瘤的发病机制。在考察过的12个儿科肿瘤中，在肿瘤细胞和/或相关脉管系统的内皮细胞中都显示出中等至强烈的CTGF表达(Kasaragod et al.,Pediatr.Dev.Pathol.，2001，4，37-45)。
[0011]结缔组织生长因子mRNA在儿童急性淋巴母细胞白血病(acute lymphoblasticleukemia, ALL)的恶性人类白血病淋巴母细胞中也特别地被调高(Vorwerk et al.,Br.J.Cance·r，2000,83, 756-760)，在Hs578T人类乳腺癌细胞中mRNA和蛋白质水平都以一种剂量依赖性的方式被TGF-β调高，它表明CTGF是一个重要的神经内分泌因子以及TGF- β 是一个关键性的下游效应子(Yang et al.，].Clin.Endocrinol.Metab.,1998,83,2593-2596)。
[0012]在一个鼠的肺纤维化模型中，结缔组织生长因子mRNA表达的升高也是被争光霉素(bleomycin),—个已知的肺纤维发生剂所诱导(Lasky et al., Am.J.Physiol., 1998,275，L365-371 ;与健康的不吸烟对照试验人群相比较，在先天性肺纤维化和肺肉状瘤病(pulmonary sarcoidosis)患者的支气管肺泡灌洗细胞中也发现了同样的mRNA表达的升高，它表明结缔组织生长因子被涉及到针对损伤的纤维增生应答反应中(Allen et al.，Am.J.Respir.Cell Moll.Biol.，1999，21，693-700)。同样，在一个增生的肾小球肾炎的实验模型中，结缔组织生长因子mRNA的表达在毛细管外和肾小球膜增生损害以及肾小球外周纤维化(periglomerular fibrosis)区域中强烈地升高。早期肾小球结缔组织生长因子的超量表达与TGF-β蛋白质的明显向上调控一致，以及结缔组织生长因子的动力学有力地暗示了在该短暂的肾损伤模型中TGF-β在肾小球的修复，有可能在下游的修复中的角色(Ito et al., J.Am.Soc.Nephrol., 2001,12,472-484)。
[0013]美国专利U.S.Pat.N0.5，876，730所披露和要求权利的是一种实质上纯的或者分离的多肽，它具有与结缔组织生长因子(CTGF)蛋白的羧基末端氨基酸相对应的氨基酸序列这样的特征，其特征在于该多肽具有一氨基酸序列，其由结缔组织生长因子的N端的氨基酸残基247或248开始，一分离的多聚核苷酸序列编码结缔组织生长因子多肽，一重组表达载体含有所述的多肽，一宿主细胞含有所述的表达载体，一种药用组合物，其在药用可接受的载体中包含有效治疗量的结缔组织生长因子多肽。反义寡核苷酸被一般地披露了(Brigstock and Harding,1999)。
[0014]美国专利U.S.Pat.N0.5，783，187 ；5, 585，270 ；6, 232，064 ；6, 150，101 ；6, 069，006和PCT出版物WO 00/35936所披露和要求权利的是一种分离的多聚核苷酸其编码结缔组织生长因子多肽，表达载体，宿主细胞其被所述载体稳定地转化或转染；分离的多聚核苷酸包含从结缔组织生长因子的上游分离出来的5’未翻译的调控核苷酸序列，其特征在于，所述的未翻译的调控核苷酸序列包含转录和翻译起始区域，其特征还在于，所述序列是一TGF-β应答成分；分离的核酸结构包含从结缔组织生长因子(CTGF)基因的上游分离出来的非编码调控序列，其特征在于，所述非编码调控序列与表达所关心的蛋白质或者反义RNA的核酸序列可操作地结合，其特征在于，所述核酸相对于所述非编码序列是异源的；以及具有诱导ECM合成，胶原合成和/或成肌纤维细胞分化能力的结缔组织生长因子(CTGF)的多肽片段，包含由所述多肽的至少外显子2或外显子3编码的氨基酸序列。进一步要求权利的是一种识别组合物的方法，该组合物影响TGF-β诱导的结缔组织生长因子的表达，一种诊断选自由纤维变性疾病和动脉粥样硬化症小组的怀疑有病理学的受试者的病理状况的方法，该方法包含获取怀疑含有结缔组织生长因子的样本，通过检测受试者样本中结缔组织生长因子的水平与正常的标准样本中结缔组织生长因子水平的差异诊断受试者的病理学特征为与结缔组织生长因子细胞相关的增生病症。进一步要求权利的是一种改善与结缔组织生长因子有关的细胞增生病症的方法，它包含在病症部位对患有所述病症的受试者给予一种组合物，该组合物包含药用有效量的抗体或片段，与结缔组织生长因子结合，其特征在于组合物中的抗体或片段不与F1DGF结合。反义寡核苷酸被一般地披露了(Grotendorst,2000 ；Grotendorst and Bradham,2001 ；Grotendorst and Bradham,2000 ；Grotendorstand Bradham, 1996 ；Grotendorst and Bradham, 1998 ；Grotendorst and Bradham,2000)。
[0015]PCT出版物WO 00/27868所披露和要求权利的是一种实质上纯的结缔组织生长因子多肽或者其中的功能片段，一种编码所述多肽的分离的多聚核苷酸序列，所述多聚核苷酸序列中的T也可以是U，一种与所述多聚核苷酸序列互补的核酸序列，以及所述序列的片段，它们的长度至少为15个碱基，会与对编码结缔组织生长因子蛋白的氨基酸序列的DNA在适度的直至非常严格的条件下杂交。进一步要求权利的是一种包括所述多聚核苷酸的表达载体，一种与所述载体一 起 稳定地转化的宿主细胞，一种与所述多肽结合的抗体，以及一种制备所述多肽的方法。还进一步要求权利的是一种抑制结缔组织生长因子在细胞中表达的方法，它包含使该细胞与结合了该细胞中的靶核酸的多聚核苷酸接触，其特征在于，该多聚核苷酸抑制了结缔组织生长因子在细胞中的表达，并且，该多聚核苷酸是一种反义寡核苷酸，以及检测结缔组织生长因子表达的测试盒，该测试盒包含分成多个格子的置物架子来承放一个或多个容器，至少一个容器中含有至少一种与结缔组织生长因子结合的反义寡核苷酸(Schmidt et al.,2000)。
[0016]PCT出版物WO 00/13706所披露和要求权利的是一种治疗或防止纤维变性的方法，该方法包含对需要的受试者给予有效量的一种试剂，它调整，调控或者抑制结缔组织生长因子或其片段的表达或活性，其特征在于该试剂是一种抗体，一种反义寡核苷酸，或者是一种小分子。该方法直接用于肾纤维化和相关的肾病的治疗，特别是与糖尿病和高血压有关的并发症的治疗(Riser and Denichili，2000)。
[0017]PCT出版物WO 01/29217所披露和要求权利的是一种分离的核酸分子，它包含对编码一多肽的核酸分子，该多肽包含一个氨基酸序列，其选自包括NOVl，N0V2 (结缔组织生长因子)，和N0V3这样一组的氨基酸序列，选自所述组的氨基酸序列的成熟形态或变异体，以及一种核酸分子，它包含编码一多肽的核酸序列，该多肽包含一个氨基酸序列，它选自所述的一组，和所述多肽的成熟和变异体形态或片段，和所述核酸分子的补体。反义寡核苷酸被一般地披露过(Prayaga et al.,2001)。
[0018]肥大性瘢痕的形成，尤其是在临床上消散严重烧伤是个重点难题，它能引起高度增生的瘢痕，造成永久性的功能丧失和外貌损伤的标志特征。每年在美国有超过一百万的人需要治疗烧伤。烧伤后肥大性瘢痕的发病率是个普通的后果，它产生了非常大的问题。因此，像反义寡核苷酸(AOS)那样的CTGF抑制剂应该在防止烧伤后严重的肥大性瘢痕上非常有效。通过局部施涂按预先规定的方法制备的AS0，并且监测烧伤发生后瘢痕发展的严重程度可以来评价它的功效。
[0019]有若干理由或许让CTGF成为调控肥大性瘢痕成为有吸引力的目标。作为TGF-β I或TCD-β 2的辅因子和下游介质(downstream mediator),对于针对瘢痕的基因定向分子疗法而言，CTGF可能比TGF- β I或TCD- β 2代表更加特效的目标，尤其是因为TGF- β I或TCD-β 2具有与瘢痕形成无关的多能的效果的缘故。另外，CTGF可能具有与TGF-β I或TCD- β 2无关的保持纤维变性表型的功能，而TGF- β I或TCD- β 2的策略可能会忽视纤维变性表型。尽管对CTGF在多重器官系统中和在像硬皮病那样的慢性皮肤病中扩大纤维化的作用的了解在深入，但是，CTGF在急性瘢痕和伤口愈合中的作用仍然待大量观察的。
[0020]目前还没有已知的有效抑制结缔组织生长因子合成的治疗剂，至今针对调控结缔组织生长因子功能的研究策略已经涉及到采用丁酸钠(sodium butyrate, NaB),功能阻滞抗体和反义寡核苷酸。
[0021]饮食因素被认为在人类癌症，包括乳腺癌的发展和防止上起了重要作用。饮食的微量营养素NaB是饮食淀粉和纤维消化的主要最终产物，它是一种强有力的增长抑制剂，它启动许多类型细胞在体外的细胞分化。NaB，部 分地，作为乳腺上皮细胞中的组蛋白脱乙酰酶的抑制剂发挥着它的生物学作用，诱导凋亡细胞在Hs578T雌激素-无应答的人类乳腺癌细胞中的死亡，它能根据不同的细胞类型激活在细胞周期阻滞(cell cycle arrest)中涉及到的不同基因。NaB以剂量依赖的方式特别地上调结缔组织生长因子的表达，在癌性和非癌性的乳房细胞中促进mRNA和蛋白水平的升高(Tsubaki et al., J.Endocrinol., 2001,169,97-110)。
[0022]TGF-β具有独特的能力来刺激正常的成纤维细胞在软琼脂中的生长，是转化了的细胞的一种性质。结缔组织生长因子不能诱导这些锚地非依赖的(anchorage-1ndependent)增长的正常鼠肾(normal rat kidney, NRK)的成纤维细胞，但是，结缔组织生长因子的合成和作用对于TGF-β诱导的锚地非依赖的性是必不可少的。结缔组织生长因子的抗体特定地阻断TGF-β诱导的锚地非依赖的增长，通过在反义取向中一种表达结缔组织生长因子基因的结构被转化的NRK成纤维细胞不应答在锚地非依赖的增长试验中的TGF-β (替换为:被构建的表达结缔组织生长因子基因通过反义定向转化过的NRK成纤维细胞在锚地非依赖的的生长分析中不响应TGF-β) (Kothapalli et al.,CellGrowth.Differ.，1997，8，61-68)。这些CTGF-反义表达NRK细胞也被用于显示TGF-β -刺激的胶原合成是通过结缔组织生长因子介导的，这表明结缔组织生长因子可能是抗纤维化疗法有用的靶(Duncan et al.，Faseb J.，1999，13，1774-1786)。
[0023]人类结缔组织生长因子cDNA的3’ -未翻译的区域(untranslated region, UTR)为调控要素承载了若干个共有序列。当3’ -UTR在一个报道基因下游被融合时，发现它作为一个有力的顺式作用阻遏要素在发挥作用，反义3’ -UTR具有相同的，但更强有力的效果(Kubota et al.,FEBS Lett.，1999，450，84-88)。对人类和鼠的结缔组织生长因子 3’_UTR的比较揭示出保留了一个长91个碱基的小片段。该区域被来自NIH3T3鼠成纤维细胞的RT-PCR放大，并被用于形成一个嵌合的融合结构以分析它的阻遏效果。，鼠结缔组织生长因子3’ -UTR无论是在正向还是反义定向中都有强力的报道基因转录阻遏效果，这表明该调控要素是非定向依赖性的(Kondo et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 2000, 278,119-124)。
[0024]长度为16个核苷酸，靶向翻译启动的起始位点的一种硫代磷酸酯(phosphorothioate)反义寡核苷酸被用于抑制结缔组织生长因子的表达，以及抑制牛主动脉血管内皮细胞在培养时的增生和移动(Shimo et al.，J.Biochem.(Tokyo)，1998，124，130-140)。该反义寡核苷酸也被用于显示结缔组织生长因子诱导在MCF-7人类乳腺癌细胞中的凋亡，TGF-β-诱导的凋亡部分地是由结缔组织生长因子介导的(Hishikawa et al.，J.Biol.Chem.，1999，274，37461-37466)。还发现同样的反义寡核苷酸抑制TGF- β -介导的凋亡蛋白酶3(caspase 3)的激活，因而抑制在人类主动脉平滑肌细胞(human aorticsmooth muscle cells, HASC)中 TGF-β -介导的凋亡诱导(Hishikawa et al., Eur.J.Pharmacol.，1999，385，287-290)。该反义寡核苷酸还被用于阻断结缔组织生长因子的表达，并且证实了高血压上调结缔组织生长因子在肾小球系膜细胞(mesangial cells)中的表达，这就转而增强了 ECM蛋白的产生并诱导凋亡，有助于肾小球膜的重塑和最终的肾小球硬化(Hishikawa et al.，J.Biol.Chem.，2001，276，16797-16803)。
[0025]因此，感到还有长期 的需要有另外的能有效抑制结缔组织生长因子功能的试剂。
[0026]发明综沭
[0027]本发明提供了包含修饰的寡核苷酸的化合物，该寡核苷酸包含12-30个连接的核苷，优选包含20个或者至少12个连接的核苷，更为理想的是包含至少14个核苷，化合物能抑制结缔组织因子的表达。还提供了包含本发明的反义化合物的药用组合物和其他组合物。
[0028]进一步提供了治疗患有与CTGF有关疾病或症状的动物.特别是人类的方法，该方法是通过给予一定量的这样的化合物来有效地抑制CTGF的表达，其特征在于，该疾病或症状是一种过度增殖病症，像癌症和纤维变性的疾病。进一步还提供了减少伤口愈合所造成的瘢痕的方法，该方法是通过给予一定量的这样的化合物来有效地抑制CTGF的表达。
[0029]附图的简要i兑明
[0030]图1显示CTGF基因组序列上的靶片段或区域，主要是外显子靶片段，以其为对照制备靶向CTGF的反义寡核苷酸
[0031]图2显示CTGF mRNA序列上的靶片段或区域，以其为对照制备靶向CTGF的反义寡
核苷酸。
[0032]图3提供了试验在CTGF mRNA序列上的反义寡核苷酸靶向外显子序列用以抑制CTGF表达的图解表示。[0033]图4显示CTGF基因组序列上的靶片段或区域，主要是内含子靶片段，以其为对照制备靶向CTGF的反义寡核苷酸。
[0034]图5显示CTGF mRNA序列上的靶片段或区域，以其为对照制备靶向CTGF的反义寡
核苷酸。
[0035]图6提供了在CTGF mRNA序列上的反义寡核苷酸靶向内含子序列用以抑制CTGF表达试验结果的图解表不。
[0036]图7显示抑制CTGF的高度灵敏的反义寡核苷酸，以及它们与两种以前设计的反义寡核苷酸(ISIS 124238和ISIS 124212)活性的比较，披露于美国专利U.S.PatentN0.6，965，025B2中。图7A识别了 8种外显子靶向反义寡核苷酸，图7B提供了反义寡核苷酸的优选序列。
[0037]图8提供了由9种高度活性的新颖的人类CTGF的反义寡核苷酸先导序列用以在培养的人类脐静脉内皮细胞中抑制CTGF所获得的剂量应答的图解表示。序列141923为阴性对照，序列124238和124212为两种以前设计的序列。
[0038]图9提供了鼠在接受了四星期的25mg/kg或50mg/kg剂量的反义寡核苷酸ISIS412294(SEQ ID NO:39)，ISIS 412295(SEQ ID NO:40)或 ISIS 418899(SEQ ID NO:166)后的血衆丙氨酸转氨酶(alanine aminotranferease, ALT)(图9A)和血衆天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)(图9B)水平的图解表示。结果表明鼠在接受了25mg/kg 或 50mg/kg 剂量的反义寡核苷酸 ISIS 412294 (SEQ ID NO:39), ISIS 412295 (SEQID NO:40)或 25mg/kg 剂量的 ISIS 418899 (SEQ ID NO:166)后的 ALT 和 AST 水平与盐水(载体)对照组中的水平相似；鼠在接受了 50mg/kg剂量的ISIS 418899 (SEQ ID NO:166)后的ALT和AST水平明显升高，高于对照组的观测值。
[0039]图10提供了 接受四星期的反义寡核苷酸治疗后，显示50mg/kg剂量的ISIS412295治疗组的体重增加明显低于对照组体重增加的图解表示
[0040]图11显示鼠的皮肤伤口真皮内用3.0，1.0，0.3或0.1mg的CTGF反义寡核苷酸治疗结果，对所有的剂量，CTGF和CollA2 mRNA的表达都有统计学上的明显降低。这些结果清楚地证实了利用2’ MOE修饰的反义寡核苷酸来抑制CTGF的表达会减少胶原在皮肤上的沉积。
[0041]图12提供的图解表示说明兔在接受了 50mg/mL(总剂量5mg)的真皮内给药至少达14天后存在的CTGF反义寡核苷酸显著的水平。
[0042]发明的i羊细i兑明
[0043]在一个实施例中，本发明提供了一种化合物，它包含由12-30个连接的核苷所组成的修饰的寡核苷酸，在选自SEQ ID NO:9的核苷酸718-751，1388-1423，1457-1689，2040-2069，2120-2147，2728-2797，2267-2301，553-611，1394-1423，1469-1508，1559-1605，1659-1689，2100-2129及1399-1423的区域内至少存在它的一个12个核碱基序列的部分。
[0044]在另一个实施例中，本发明提供了一种化合物，它包含由12-30个连接的核苷所组成的修饰寡核苷酸，在选自SEQ ID NO: 10的核苷酸2540-2559，2568-2587，2623-2647和2623-2642的区域内至少存在它的一个12个核碱基序列的部分。
[0045]在一个实施例中，本发明提供了一种化合物，它包含由12-30个连接的核苷所组成的修饰寡核苷酸，在 SEQ ID NO:28，30，39，40，43，44，45，50，51，52，56，78，125 和 166 中提出的核碱基序列中至少存在它的一个12个核碱基序列的部分。
[0046]在本发明一个优选的实施例中，该化合物包含20个或者至少12个连接的核苷，更优选地，包含至少14个连接的核苷，它存在于SEQ ID NO:28，30，39，40，43，44，45，50，51，52，56，78，125和166中提出的核碱基序列中。
[0047]这些序列的选择是通过筛选在图1至图7中呈现出的结果以及在人类脐静脉内皮细胞(HuVEC)中剂量应答研究的结果所决定的。详细的实验和数据见下面的实施例部分中的实施例8。
[0048]在图1-6中呈现的靶序列包括内含子和外显子靶向序列。靶区域是核酸结构上定义的一个区域。例如，一个靶区域可以包含一个3’ UTR, 一个5’ UTR, 一个外显子，一个内含子，一个编码区域，一个翻译起始区域，一个翻译终止区域，或者其他的被定义的核酸区域。靶标包括确定至少一个与反义化合物杂交的靶片段，这样能产生合乎理想的效果。在该实施例中，该合乎理想的效果是减低mRNA靶核酸的水平。
[0049]在外显子和内含子序列中都识别出多个序列的活性明显高于以前设计的序列，像SEQIDN0:15 (ISIS 124238)。若干个新的内含子(SEQ NO:125)和外显子(SEQ NOs.28，30，40，45，52，50和78)寡核苷酸表现出的活性显著高于其他序列。
[0050]在最初的ASO活性筛选中SEQ ID NOs.39和40显示出是高度有效的CTGF表达抑制剂(在此有数据显示)。为了进一步考察在CTGF mRNA上的这片区域是否代表一个以ASOs为目标的“热点”，又设计了另一个ASO序列(SEQ ID N0166)，它被设计成与被SEQNOs 39和40作为目标的那些序列的上游序列杂交。也发现该AS0(SEQ ID N0166)是一个对CTGFmRNA表达的十分有效的抑制剂，表明CTGF mRNA的这一段对于以ASO抑制剂为目标是个有吸引力的区域。
[0051]在某个实施例 中，反义化合物与一部分的CTGF区域互补，该区域为将靶位点从1396伸展至1424的活性寡核苷酸的靶标。这是一个作为ISIS 418899,412295,和412294(分别为SEQ ID NOs: 166，40和39)的靶标的序列空间。
[0052]本发明还提供了一种化合物，它包含一种修饰的寡核苷酸，该寡核苷酸包含至少12个，优选至少14个连接的核苷，它的核碱基序列是提出在SEQ ID NO:28，30，39，40，43，44，45，50，51，52，56，78，125 和 166 之一种中的一部分。
[0053]在此描述的反义化合物可以包含一个具有12至30，12至20，优选14至20个连接
的核苷的寡核苷酸。
[0054]在本发明的一个实施例中，该修饰的寡核苷酸是单链或双链的寡核苷酸。
[0055]本发明采用寡聚化合物，特别是反义寡核苷酸，用以调节核酸分子编码结缔组织生长因子的功能，最终调节结缔组织生长因子产生的数量。这是通过提供专一地与一个或多个编码结缔组织生长因子的核酸杂交的反义化合物来实现的。在此所使用的术语“靶核酸”和“编码结缔组织生长因子的核酸”包含编码结缔组织生长因子的DNA，由这样的DNA转录的RNA(包括pre-mRNA和mRNA)，以及从这样的RNA中衍生出来的cDNA。一种寡聚化合物与其靶核酸特定的杂交干扰了该核酸的正常功能。这种通过化合物专一地与靶核酸杂交来调节靶核酸功能的方法通常称之为“反义”。被干扰的DNA功能包括复制和转录。被干扰的RNA功能包括所有维持生命所必需的功能,像,例如,RNA移位到蛋白质翻译的位点上，由RNA翻译蛋白质，剪接RNA以生成一个或多个mRNA种类，以及可能是RNA参与的或促进的催化活性。这种干扰靶核酸功能的总效果是调节结缔组织生长因子的表达。在本发明的内容中，“调节”意味着基因表达的升高(促进)或者降低(抑制)。在本发明的内容中，抑制是调节基因表达的优选方式，mRNA是优选的靶标。
[0056]靶核酸，靶区域和核苷酸序列
[0057]优选将特定的核酸作为反义的目标。在本发明的内容中，将反义化合物“靶向”到一种特定的核酸上是一个具有多步的过程。
[0058]可以理解的是，包含在实施例中的每个SEQ ID NO中提出出来的序列与对糖组成部分，核苷间的连接，或者核碱基的任何修饰无关。同样地，由一个SEQ ID NO确定的反义化合物可以独立地包含一处或多处对糖组成部分，核苷间的连接，或者核碱基的修饰。由Isis号码(Isis No)描述的反义化合物表示了核碱基和模体(motif)的一种结合。
[0059]在一个实施例中，靶区域是核酸结构上定义出来的。例如，一个靶区域可以包含一个3’ UTR, 一个5’ UTR, 一个外显子，一个内含子，一个编码区域，一个翻译起始区域，一个翻译终止区域，或者其他的被定义的核酸区域。核酸结构上定义出的区域通过由序列数据库如NGBI给出的登录编号获得，那些信息在此被引为参考纳入。在一个实施例中，靶区域可包含这样的序列，该序列从靶区域内的一个靶片段的5’靶点至靶区域内的另一个靶片段的3，靶点。
[0060]靶标包括确定至少一个与反应化合物杂交的靶片段，这样能产生合乎理想的效果。在特定的实施例中，·该合乎理想的效果是减低mRNA靶核酸的水平。在其他的实施例中，该合乎理想的效果是由靶核酸编码的蛋白质的水平或者是与靶核酸相关联的表型变化。
[0061]靶区域可包含一个或者多个靶片段。靶区域内的多个靶片段可以是重叠的。或者，它们也可以是不重叠的。在一个实施例中，在一个靶区域中的靶片段被不超过约300个核苷隔开。在另外的实施例中，在一个靶区域中的靶片段被靶核酸上的不多于约250，200，150，100，90，80，70，60，50，40，30，20或10个核苷隔开。在另一个实施例中，在一个靶区域中的靶片段被靶核酸上的不多于约5个核苷隔开。在别的实施硫中，靶片段是邻接的。
[0062]合适的靶片段可以在一个5’ UTR, 一个编码区，一个3’ UTR, 一个内含子，或者一个外显子内发现。包含一个开始密码子或者一个终止密码子的靶片段也是合适的靶片段。合适的靶片段可以特异地排除某些结构上定义的区域，像开始密码子或者终止密码子。
[0063]合适靶片段的确定可以包括将靶核酸的序列在整个基因组中与其他序列相比较。例如，BLAST算法可以用于识别在不同核酸中具有相似性的区域。这种比较能防止选择的反义化合物序列会以非特异的方式与一个不是选出来的靶核酸(即，非靶序列或偏离的靶序列)杂交。
[0064]在一个活性的靶区域内，反义化合物的活性(例如被定义为靶核酸水平降低的百分数)可以是有变化的。在一个实施例中，CTGF mRNA水平的下降表现出对CTGF表达的抑制。CTGF蛋白水平的下降也表现出对靶mRNA表达的抑制。还有，表型变化是抑制CTGF表达的征兆。例如，CTGF测量值的增加是抑制CTGF表达的征兆。
[0065]详细地说，靶标过程通常从识别一个其功能要被调节的核酸序列开始。例如，这可以是一个细胞基因(或者从该基因转录的mRNA)，它的表达与一种特殊的失调或病症相联系，或者可以是来自传染试剂(infectious agent)的一个核酸分子。在本发明中，祀是一种编码结缔组织生长因子的核酸。靶标过程还包括确定该基因内发生反义相互作用的一个或多个位点，这样来得到理想的结果，例如，蛋白质表达的识别和调节。在本发明的内容之中，优选的基因内的位点是包含该基因的开放阅读框架(open reading frame, ORF)的翻译起始密码子或翻译终止密码子的区域。如业内所知晓的那样，因为典型的翻译起始密码子是5’ -AUG(在转录的mRNA分子中；5’ -ATG在相应的DNA分子中)，所以，翻译起始密码子也称之为“AUG密码子”，“开始密码子”或者“AUG开始密码子”。少数的基因的翻译起始密码子具有 RNA 序列 5 ‘-GUG，5’ -UUG 或 5’ -CUG,而且 5’ -AUA，5’ -ACG,和 5’ -CUG,已显示出在体内起作用。因而，术语“翻译起始密码子”和“开始密码子”可包含许多的密码子序列，尽管在每种情况下的启动氨基酸典型地是蛋氨酸(在真核生物中)或者甲酰蛋氨酸(formylmethionine)(在原核生物中)。业内也熟知真核生物和原核生物的基因可以具有两种或更多的可选的开始密码子，它们的任何一种可以优先用于在特定细胞类型或组织中，或者在一组特定的条件下的翻译起始。在本发明的内容中，“开始密码子”和“翻译起始密码子”指的是用在体内的，启动由编码结缔组织生长因子基因转录的mRNA分子的翻译，而不论这些密码子的序列。
[0066]业内也知晓基因的翻译终止密码子(或“终止密码子”)可以具有三种序列之中的一种，即 5’ -UAA ，5’ -UAG 和 5’ -UGA (相应的 DNA 序列分别为 5’ -TAA，5’ -TAG 和 5’ -TGA)。术语“开始密码子区域”和“翻译起始密码子区域”指的是这样的mRNA或基因的一个部分，它包含从一个翻译起始密码子算起往任一方向(即，5’或3’)大约25个至大约50个连续的(contiguous)核苷酸。同样，术语“终止密码子区域”和“翻译终止密码子区域”指的是这样的mRNA或基因的一个部分，它包含从一个翻译终止密码子算起往任一方向(即，5’或3’ )大约25个至大约50个连续的核苷酸。
[0067]业内已知晓开放阅读框架(ORF)或者“编码区域”指的是翻译起始密码子与翻译终止密码子之间的区域，它也是个可以被有效定向的区域。其他的靶区域包括5’未翻译的区域(5，-UTR)，业内指的是从翻译起始密码子算起的mRNA沿着5’方向上的一个部分，因而，它包括一个mRNA或者基因上相应核苷酸的5’-加帽位点(5' cap site)与翻译起始密码子之间的部分；以及3’未翻译的区域(3’-UTR)，业内指的是从翻译终止密码子算起的mRNA沿着3’方向上的一个部分，因而，它包括一个mRNA或者基因上相应核苷酸的翻译终止密码子与3’末端之间的部分。mRNA的5’帽结构包含一个N7-甲基化的鸟嘌呤核苷残基，它通过一个5’ -5’的三磷酸盐(triphosphate)连接与mRNA的5’ -most残基结合在一起。mRNA的5’帽区域被认为是包括5’帽结构本身以及紧接着该帽的最初50个核苷酸。5’帽区域可能也是个优选的靶区域。
[0068]虽然某些真核生物的mRNA转录物直接被翻译，许多含有一个或多个称之为“内含子”的区域，它们在转录物被翻译之前被切除。剩下的(因而被翻译了)区域被称之为“外显子”，被剪接在一起形成一个连续的mRNA序列。mRNA剪接位点，即内含子_外显子的接头也可能是优选的靶区域，当在与疾病相关的异常剪接或者一种特殊的mRNA剪接产物的生产过剩的情况下它们是特别有用处的。由于重排或缺失所造成的异常融合接头也是优选的靶。业已发现内含子也可能是有效的，因而是优选的适合于反义化合物靶向DNA或pre-mRNA的祀区域。
[0069]业内也知晓从DNA的同一个基因组区域里可以产生出可替代的RNA转录物。这些可替代的转录物统称为“变异体”。更准确地说，“pre-mRNA变异体”产自同一基因组DNA的转录物，它与产自同一基因组DNA的其他转录物的不同之处在于，或者是它们的开始位置或者是它们的终止位置，以及它们含有内含子区域与外显子区域。
[0070]剪接过程中去除一个或多个外显子或内含子区域或者它们的部分时，pre-mRNA变异体产生出较小的“mRNA变异体”。因此，mRNA变异体是被加工过的pre-mRNA变异体，作为剪接的结果，每个独特的pre-mRNA变异体一定总是产生出一个独特的mRNA变异体。这些mRNA变异体也称之为“可替代剪接变异体”。如果不存在pre-mRNA变异体的剪接，则该pre-mRNA变异体与mRNA变异体一致。
[0071]业内也知晓可以通过利用替代的信号来开始或终止转录以生产变异体，而且，pre-mRNA和mRNA可以具有多于一个的开始密码子或终止密码子。来自利用替代开始密码子的pre-mRNA或mRNA的生产处的变异体被称之为该pre-mRNA或mRNA的“替代开始变异体”。那些利用替代终止密码子的转录物被称之为该pre-mRNA或mRNA的“替代终止变异体”。替代终止变异体的一个特殊类型是“多聚腺苷酸变异体“(polyA variant)，其中的许多个所产生的转录物是由转录机构替代选择了 “polyA终止信号”的一个信号所引起的，从而生产出在独特的polyA位点上终止的转录物。
[0072]反义化合物一般被用作研究试剂和诊断学。例如，反义寡核苷酸能以敏锐的特异性来抑制基因的表达，常被业内人士用于解释特殊基因的功能。反义化合物也被用于，例如区分生物途径中各个成员的功能。因此，反义调整已经被拿来作研究之用。
[0073]当用于试验盒和诊断学时，本发明的反义化合物既可以单独也可以结合其他的反义化合物或疗法，用作差异和/或组合分析的工具来解释在细胞和组织中表达的基因的一部分或整个补体的表达模式。
[0074]将在用一种或多种反义化合物处理过的细胞或组织内的表达模式与未经过反义化合物处理的对照的细胞或组织进行比较，产生的模式被用于分析它们的基因表达的差异水平是属于，例如，与疾病有关，信号传输途径，细胞定位，表达水平，所检验的基因的大小，结构或功能。这些分析可以在受激的或未受激的细胞上进行，可以有或者没有影响表达模式的其他化合物存在下进行。
[0075]业内知晓的基因表达分析方法的例子包括DNA阵列或微阵列(Brazma and Vilo,FEDS Lett.，2000，480，17-24 ;Celis，et al.，FEBS Lett.,2000,480,2-16), SAGA (serialanalysis of gene expression)(基因表达的系列分析)(Madden, et al.， Drug Discov.Today,2000,5,415-425), READS(restriction enzyme amplification of digestedcDNAs)(消化的 cDNAs 的限制性酶扩增)(Prashar and Weissman,Methods Enzymo1., 1999,303, 258-72), TOGA (total gene expression analysis)(全基因表达分析)(Sutcliffe, etal.，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.2000,97,1976-81)，蛋白质阵列和蛋白质组学(proteinarrays and proteomics)(Celis,et al.,FEBS Lett., 2000,480, 2-16 ； Jungblut,et al.,Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10),表达序列标记物(expressed sequence tag) (EST)测序(Celis, et al., FEBS Lett., 2000,480, 2-16 ；Larsson, et al., J.Biotechnol.,2000,80,143-57),相减 RNA 指纹图谱(subtractive RNA fingerprinting) (SuRF) (Fuchs,et al., Anal.Biochem.,2000, 286,91-98 ；Larson,et al., Cytometry,2000,41, 203-208),相减克隆(subtractive cloning),差异显不(differential display) (DD) (Jurecic andBelmont, Curr.0pin.Microbiol., 2000, 3, 316-21),比较基因组杂交(Carrrrrrrulli,et al., J.Cel I Biochem.Supp1., 1998,31,286-96), FISH (fluorescent in situhybridization)(突光原位杂交)技术(Going and Gusterson, Eur.J.Cancer, 1999, 35,1895-904)以及质谱方法(reviewed in (To, Comb.Chem.High Throughput Screen, 2000, 3,235-41)。
[0076]反义化合物
[0077]在本发明的内容中，术语“寡核苷酸”指的是核糖核酸(RNA)或者脱氧核糖核酸(DNA)或者它们的模拟物的一种寡聚物或聚合物。该术语包括由天然存在的核碱基，糖类和共价核苷间(骨架)键合组成的寡核苷酸，以及具有非天然存在的但功能类似的部分的寡核苷酸。相对于天然形式，由于具有合乎理想的性质，像增强的细胞摄入，与核酸靶之间增强的亲和力，以及核酸酶的存在下的稳定性提高，所以通常优选这种修饰的或取代的寡核苷酸。
[0078]尽管反义寡核苷酸是反义化合物一种优选的形式，本发明还是包含了其他寡聚反义化合物，包括但不限寡核苷酸模拟物。
[0079]反义化合物指的是一种能与靶核酸通过氢键杂交的寡聚化合物。反义化合物包括但不限于寡核苷酸类，寡核苷类，寡核苷酸类似物，寡核苷酸模拟物，反义寡核苷酸类，siRNA, RNAi,核糖酶类(ribozymes),外部指导序列(external guide sequence,EGS)寡核苷酸类(oligozymes),和其他与祀核酸杂交并调控其表达的寡核苷酸类。
[0080]在某些实施例中，反义化合物具有一种核碱基序列，当在5’至3’的方向上书写时，它包含它被祀向的祀核酸的祀片段的反向补体(reverse complement)。在某些这样的实施例中，反义寡核苷酸具有一种核碱基序列，当在5’至3’的方向上书写时，它包含它被靶向的靶核酸的靶片段的反向补体。
[0081]在某些实施例中，靶向一种核酸的反义化合物的长度为12-30个亚单位。换言之，反义化合物是从12个至30个连接的亚单位。在其他的实施例中，反义化合物是8-80个，12-50个，15-30个，18-24个，19-22个，或者20个连接的亚单位。在某些这样的实施例中，反义化合物的长度是 8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，或80个连接的亚单位，或者是由任何两个上述数值定义的范围。在某些实施例中，反义化合物是一种反义寡核苷酸，连接的亚单位是核苷酸。
[0082]在本发明一个优选的实施例中，该化合`物包含20个或者至少14个连接的核苷，其特征在于，修饰的寡核苷酸具有与SEQ ID NOs:28，30，39，40，45，52，56，78，125和166中的所提出的一个序列100%—致。在另一个优选的实施例中，感兴趣的先导化合物具有SEQIDNO:39中提出的序列(ISIS 412294)。
[0083]在某些实施例中，一种靶向一种核酸的截短的(shortened)或缺失的(truncated)反义化合物具有一个亚单位从5’端缺失(5’ truncation),或者就是从3’端缺失(3’truncation)。一种祀向一种核酸的截短的或缺失的化合物可以有两个亚单位从该反义化合物的5’端，或者有两个亚单位从该反义化合物的从3’端缺失。或者，该缺失的核苷可以分散在整个反义化合物中，例如，在一个反义化合物中，它有一个核苷从5’端缺失，一个核苷从3’端缺失。
[0084]当一个伸长的反义化合物中存在有一个另外的亚单位时，该另外的亚单位可以位于该反义化合物的5’端或者3’端。当有两个或更多另外的亚单位存在时，增加的亚单位可以相互邻接，例如，在一种有两个加在该反义化合物的5’端上的亚单位(5，加成)，或者加在3’端上的亚单位(3’加成)的反义化合物中。或者，该增加的亚单位可以分散在整个反义化合物中，例如，在一个反义化合物中，它有一个核苷加到5’端上，一个核苷加到3’端上。
[0085]有可能增加或减少像寡核苷酸那样反义化合物的长度，和/或引入错配(mismatch)喊基而不消除活性。例如，Woolf 等(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:7305-7309,1992)测试了一系列长度为13-25个核碱基的反义寡核苷酸在注射卵母细胞的模式中诱导一种靶RNA切割的能力。长度为25个核碱基，且在靠近该反义寡核苷酸端点处有8或11个错配的反义寡核苷酸，其能够引导靶mRNA的特异切割，虽然要比不含有错配的反义寡核苷酸的程度低。类似地，采用有13个核碱基的反义寡核苷酸，包括那些有I个或3个错配的反义寡核苷酸，实现了靶向特异切割。
[0086]Gautschi 等(J.Natl.Cancer Inst.93:463-471, March2001)证实了一种寡核苷酸在体外和体内降低bcl-2和bcl-xL表达的的能力，该寡核苷酸100%与该bcl-2mRNA互补，并且对bcl-xL mRNA有3个错配。更进一步，证实了这种寡核苷酸在体内具有强有力的抗癌活性。
[0087]Maher 和Dolnick(Nuc.Acid.Res.16:3341-3358,1988)分别试验了一系列串联 14个核碱基的反义寡核苷酸，以及有28个和42个核碱基的反义寡核苷酸，后两种反义寡核苷酸由2个或3个该串联反义寡核苷酸的序列组成，用以试验它们阻止人类DHPF在兔网织红细胞试验中转录的能·力。这三种14个核碱基反义寡核苷酸中的任意一种单独就能抑制转录，虽然要比28个或42个核碱基的反义寡核苷酸的水平更加适度。
[0088]Bhanot等(PCT/US2007/068401)提供了短反义化合物，包括哪些包含化学修饰的高亲和力单体，，其有8-16个单体的化合物。这些短反义化合物显示出可用于减少细胞，组织和动物的靶核酸和/或蛋白，提高了效力，改善了治疗指数。短反义化合物在比上述的那些反义化合物剂量低时就有效果，可以降低毒性和治疗成本。此外，所述的短反义化合物有更大的潜力作为口服药剂。
[0089]杂交
[0090]一旦一个或多个靶位点被识别，就会选择与靶足够互补的寡核苷酸，即足够好，足够特异地与靶杂交，以获得理想的效果。
[0091]在本发明的内容中，“杂交”意指氢键，它们可以是互补核苷或核苷酸碱基之间的ffatson-Crick,Hoogsteen或者反向Hoogsteen氢键。例如，腺嘌呤与胸腺卩密唳是互补核碱基,它们通过形成氢键来配对。
[0092]在某些实施例中，杂交发生在此披露的一种反义化合物与一种核酸之间。杂交最常见的机理涉及核酸分子的互补核碱基之间的氢键。
[0093]杂交过程可以在各不相同的条件下发生。严格的条件是序列依赖性的，它们是由要杂交的核酸分子的性质和组成来决定的。
[0094]确定一个序列对于一种靶核酸是否能特异地杂交的方法是业内所熟知的。在一个实施例中，在此提供的一种反义化合物与一种核酸是能特异地杂交的。
[0095]互补
[0096]在此说的“互补”指的是两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，在寡核苷酸的某一个位置上的核苷酸能与一种DNA或RNA分子同样位置上的核苷酸形成氢键,则该寡核苷酸与DNA或RNA被认为在那个位置上是互补的。当在每个分子中有足够数量的位置被能相互形成氢键的核苷酸占据时，该寡核苷酸与DNA或者RNA是互补的。因而，“特异地可杂交的”和“互补”是用以表明互补性或者精确配对充分程度的术语，以致于在寡核苷酸与DNA或者RNA靶之间产生稳定，特异的氢键。业内懂得反义化合物的序列不必100%与其特异地可杂交的靶核酸的序列互补。当该化合物结合到靶DNA或RNA分子上去时，干扰了该靶DNA或RNA分子的正常功能，造成失去了效用，并且有充分程度的互补以避免该反义化合物与非靶序列之间在希望有特异结合的条件下，即在体内试验或者治疗处理中的生理条件下，以及在体外的试验中的试验条件下有非特异的结合，则一种反义化合物是特异地可杂交的。
[0097]本发明的与靶杂交并抑制该靶表达的反义和其他化合物是通过实验来识别的，在下文中这些化合物的序列作为本发明的优选实施例被识别。与这些优选的序列互补的靶位点在下文中被称之为“活性位点”，因此，它们是优选的靶向位点。所以，本发明的另一个实施例包含与这些活性位点杂交的化合物。
[0098]当反义化合物有足够数量的核碱基能与靶核酸相应的核碱基形成氢键，这样就产生了合乎理想的效果(例如，反义抑制一种像CTGF那样的核酸的靶核酸)，则一种反义化合物与一种靶核酸是互补的。
[0099]在一种反义化合物与一种CTGF核酸之间的非互补的核碱基可以被容许，只要该反义化合物保持能与靶核酸特异地杂交。另外，反义化合物可以越过CTGF核酸的一个或多个片段来进行杂交，这样一来，介于中间的或邻接的片段就不会参与到杂交过程中(例如，一种环结构，错配或者发夹结构)。
[0100]在一个实施例中，在此提供的反义化合物至少70%，至少75%，至少80%，至少85 %，至少90 %，至少95 %，至少96 %，至少97 %，至少98 %，或至少99 %与一种CTGF核酸互补。可以采用常规方法来确定一种反义化合物与一种靶核酸互补的百分程度。
[0101]例如，一种反义化合物有20个核碱基，其中的18个与一种靶核酸互补，因而，它将会特异地杂交，将会代表了 90%的互补度。在该实施例中，剩下的非互补的碱基可以被群集成簇或者与互补的核碱基散布开来，不必相互邻接或者与互补的核碱基邻接。同样地，一种其长度为18个核碱基的反义化合物有4个非互补的核碱基，这4个非互补的核碱基与两个完全与靶核酸互补的区域侧面相接，该反义化合物应当会有77.8%总的互补度，因而位于本发明的范围之内。一种反义化合物与靶核酸的一个区域的百分互补度的确定可以例行米用业内知晓的 BLAST 程序(basic local alignment search tools)和 PowerBLAST 程序(Altschul et al., J.Mol.Biol.1990,215,403-410 ；Zhang and Madden, Genome Res.,1997,7,649-656)。百分同源性,序列一致性或互补度可以通过例如，Gap程序(Wisconsin序列分析软件包，Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University ResearchPark,Madison Wis.),采用默认设置来确定，它是利用Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Maath.,1981,2,482-489)。
[0102]在其他的实施例中，在此提供的反义化合物与靶核酸完全互补(即100%互补)。例如，反义化合物可以完全与CTGF核酸互补，或者是它的一个靶部分，或者一个靶片段或靶序列互补。在此所说的“完全互补”指的是反义化合物的每个核碱基能与靶核酸相应的核喊基精确喊基配对。
[0103]非互补的核碱基可以位于反义化合物的5’端或3’端。或者，非互补的一个或多个核碱基可以位于反义化合物里边的位置。当有两个或更多个非互补的核碱基存在时，他们可以邻接(即连接的)或者不邻接的。在一个实施例中，一个非互补的核碱基位于gapmer反义寡核苷酸的翼段。
[0104]在一个实施例中，长度达20个核碱基的反义化合物包含不多于4个，不多于3个，不多于2个，不多于I个的相对于如CTGF核酸那样的靶核酸的非互补核碱基。
[0105]在另外一个实施例中，长度达30个核碱基的反义化合物包含不多于6个，不多于5个，不多于4个，不多于3个，不多于2个，不多于I个的相对于如CTGF核酸那样的靶核酸的非互补核碱基。
[0106]在此提供的反义化合物也包括那些与靶核酸的一部分互补的反义化合物。在此所说的“部分”指的是在靶核酸的一个区域或片段内规定数量的邻接的(即连接的)核碱基。一个“部分”也可以指一种反义化合物的定义数量的邻接核碱基。在一个实施例中，该反义化合物与靶片段的一个至少有8个核碱基的部分互补。在另外一个实施例中，该反义化合物与祀片段的一个至少有12个核碱基的部分互补。在还有一个实施例中，该反义化合物与靶片段的一个至少有15个核碱基的部分互补。还注视到那些反义化合物，其与靶片段的一个至少有9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19,20个或更多个核碱基的部分，或者由任意两个这些数值所规定的范围互补。
[0107]一致性
[0108]在此提供的反义化合物也可以有一个明确表示的对于一个特定核苷酸序列，SEQID NO，或者用一个特定Isis号码代表的化合物的百分一致性。如果一种反义化合物具有同样的核碱基配对能力，在在此就说它与在此披露的系列一致。例如，一种RNA含有尿嘧啶代替了披露出的DNA序列中的 胸腺嘧啶脱氧核苷，该RNA则应该被认为与该DNA序列一致，因为尿嘧啶和胸腺嘧啶脱氧核苷都与腺嘌呤配对。也注视到在此描述的反义化合物截短的或伸长的版本，以及具有与在此提供的反义化合物不一致的碱基的化合物。不一致的碱基可以互相邻接或者分散在整个反义化合物中。反义化合物的百分一致性是按照具有的同一碱基配对的碱基数目相对于与之相比较的序列来计算。
[0109]在一个实施例中，反义化合物至少70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %，96 %，97 %，98%，99%，或100%与在此披露的一个或更多个反义化合物，或者SEQ ID NOs，或者它们得一个部分一致。
[0110]修饰
[0111]在本发明的某实施例中，对于反义化合物的修饰包含取代或者对核苷之间的连接，糖组成部分，或核碱基的改变。
[0112]在本发明的一个实施例中，该化合物包含至少一项修饰，该修饰选自修饰的核苷间连接，修饰的糖，和修饰的核碱基组成的一组。
[0113]虽然可以采用含有各种各样修饰核苷间连接的反义寡核苷酸，目前优选的修饰核苷间连接是一种在一个或多个核苷之间的硫代磷酸酯(phosphothioate)连接,或者,其中所有的核苷间连接都是硫代磷酸酯核苷间连接。一般地，也优选含有至少一个，而且典型地多于一个的修饰糖的反义寡核苷酸，其特征在于该糖是一种二环糖。尽管可以采用各种各样的修饰糖，现在还是优选采用2’ -O-甲氧基乙基糖。
[0114]更进一步，包含在反义寡核苷酸中的至少一个，而且典型地多于一个的核碱基将是一种修饰的核苷酸，像5-甲基胞嘧啶。
[0115]核苷是一种碱-糖的结合物。核苷的核碱基(也称之为碱基)部分通常是一个杂环碱基组成部分。核苷酸是进一步还包括一个共价地键合在核苷的糖的部分的磷酸酯基的核苷。对于那些包括五元呋喃(pentofuranosyl)糖的核苷,该磷酸酯基可以连接在该糖的2’，3’或5’ -位羟基组成部分上。寡核苷酸是通过相邻核苷互相共价连接以形成线性多聚的寡核苷酸来形成的。在寡核苷酸结构内，磷酸酯基通常被称之为形成了寡核苷酸的核苷间的连接。
[0116]对反义化合物的修饰包含取代或者改变核苷之间的连接,糖组成部分,或核碱基。经过修饰的反义化合物往往优于原来的形态，这是因为具有合乎理想的性质，像增强的细胞摄入，与核酸靶 之间增强的亲和力，以及核酸酶(nucleases)的存在下的稳定性提高，或者抑制活性的提闻。
[0117]也可以采用化学修饰核苷来提高截短的或缺失的反义寡核苷酸对于其靶核酸的结合亲和力。因此，经常能获得具有那样的化学修饰核苷的较短的反义化合物的可比较的结果。
[0118]修饰的核苷酸间连接
[0119]天然存在的RNA和DNA的核苷间连接是一种3’到5’的磷酸二酯键。通常选择具有一个或多个经修饰的，即非天然存在的核苷间连接的反义化合物，而非选择具有天然存在的核苷间连接的反义化合物，这是由于其合乎理想的性质，像增强的细胞摄入，与核酸靶之间增强的亲和力，以及核酸酶的存在下的稳定性提高。
[0120]具有修饰的核苷间连接的寡核苷酸包括保留一个磷原子的核苷间连接以及没有一个磷原子的核苷间连接。有代表性的含磷核苷间连接包括，但不限于磷酸二酯，磷酸三酯，甲基磷酸酯(methylphosphonates),氨基磷酸酯(phosphoramidate),和硫代磷酸酯。制备含磷和不含磷的连接的方法是大家熟知的。
[0121]在一个实施例中，靶向CTGF核酸的反义化合物包含一个或多个修饰核苷间连接。在一些实施例中，修饰核苷间连接是硫代磷酸酯键。在其他实施例中，反义化合物的每个核苷间连接是硫代磷酸酯键。
[0122]如业内所知，核苷是一种碱-糖的结合物。核苷的碱基部分通常是一个杂环碱基。两类最普通的这样的杂环碱基是嘌呤类和嘧啶类。核苷酸是进一步还包括一个共价地键合在核苷的糖的部分的磷酸酯基的核苷。对于那些包括五元呋喃糖的核苷，该磷酸酯基可以键合在该糖的2’，3’或5’ -位羟基组成部分上。在形成寡核苷酸时，磷酸酯基通过相邻核苷互相共价连接以形成一种线型聚合物。随后，该线型聚合物结构的各端可以连接起来形成一种环状结构，但是，一般优选开放的线型结构。在寡核苷酸结构内，该磷酸酯基常被称之为形成了寡核苷酸的核苷间的骨架。RNA和DNA正常的连接或骨架是一种3’到5’的磷酸二酯键。
[0123]可用于本发明的优选的反义化合物的特别的例子包括包含有修饰骨架或非天然核苷间连接的寡核苷酸。如在本说明书中所定义，具有修饰骨架的寡核苷酸包括那些骨架中保留有一个磷原子以及骨架中没有一个磷原子的骨架。为了本说明书的目的，以及有时业内所参考，在其核苷间骨架中没有一个磷原子的修饰的寡核苷酸也被认为是寡核苷。
[0124]优选的修饰寡核苷酸骨架包括但不限于，例如硫代磷酸酯类，手性硫代磷酸酯类，二硫代磷酸酯类，磷酸三酯类，氨烧基磷酸三酯类(aminoalkylphosphotriesters),磷酸甲酯和其他的烷基酯类，包括3’ -亚烷基(alkylene)磷酸酯类，5’ -亚烷基磷酸酯类和手性磷酸酯类，次磷酸酯类(phosphinates)，氨基磷酸酯类，包括3’ -氨基氨基磷酸酯和氨基烧基氨基磷酸酯类(aminoalkylphosphoramidates),硫羰氨基磷酸酯类(thiono-phosphoramidates)，硫擬憐酸烧基酯类(thionoalkylphosphonates)，硫擬憐酸烧基三酯类(thionoalkylphospho-triesters),硒代憐酸酯类(selenophosphates)和硼代磷酸酯类(boranophosphates),上述这些酯类具有正常3’_5’连接,这些化合物的2’_5’结合类似物，以及那些具有反转极性的化合物，其特征在于，一个或多个连接是3’ -3’，5’ -5’或者2’ -2’连接。优选的具有反转极性的寡核苷酸在3’ -most核苷酸间的连接上包含单一的3’-3’连接，即一个单一的反转核苷残基，它可能是脱碱基的(核碱基丢失或者用一个羟基来替代)。各种各样的盐类，混合的盐类和游离酸形式也都包括在其中。
[0125]讲授上述含磷连接制备方法的有代表性的美国专利包括但不限于，U.S.Pat.Nos:3, 687，808 ;4，469，863 ;4，476，301 ;5，023，243 ;5，177，196 ;5，188，897 ;5，264，423 ；5，276，019 ;5，278，302 ;5，286，717 ;5，321，131 ;5，399，676 ;5，405, 939 ;5，453，496 ；5，455，233 ;5，466，677 ;5，476，925 ;5，519，126 ;5，536，821 ;5，541，306 ;5，550, 111 ；5，563，253 ;5，571，799 ;5，587，361 ;5，194，599 ;5，565，555 ;5，527，899 ;5，721，218 ；5，672，697和5，625，050，它们中的某一些本发明所共同，这些专利每篇都被结合于此作为参考。
[0126]优选的其中不含磷原子的修饰寡核苷酸骨架具有由短链烷基或者环烷基核苷间连接，混合的杂原子和烷基或环烷基的核苷间连接，或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷连接构成的骨架。这些还包 括那些具有吗啉代连接(部分地是由核苷的糖部分形成的)；娃氧烧骨架(siloxane);硫化物(sulfide),亚砜(sulfoxide)和砜(sulfone)骨架；formacetyl 和 thioformacetyl 骨架；亚甲基(methylene) formacetyl 和 thioformacetyl骨架；riboaCetyl骨架；含烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；及其他具有混合的N，O, S和'CH2成分部分的骨架。
[0127]讲授上述寡核苷制备方法的有代表性的美国专利包括但不限于，U.S.Pat.Nos:5，034，506 ;5，166，315 ;5，185，444 ;5，214，134 ;5，216，141 ;5，235，033 ;5，264，562 ；5，264，564 ;5，405，938 ;5，434，257 ;5，466，677 ;5，470，967 ;5，489，677 ;5，541，307 ；5，561，225 ;5，596，086 ;5，602，240 ;5，610，289 ;5，602，240 ;5，608，046 ;5，610，289 ；5，618，704 ;5，623，070 ;5，663，312 ;5，633，360 ;5，677，437 ;5，792，608 ;5，646，269 ；和5，677，439，它们中的某一些本发明所共有，每个这些专利都被结合于此作为参考。
[0128]在其他的优选寡核苷酸模拟物中，核苷酸单位的糖和核苷间连接，即骨架，都用新颖的基团替代掉。碱基单位保持下来与合适的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物，一种已经显示出具有优异的杂交性能的寡核苷酸模拟物被称之为肽核酸(peptidenucleic acid，PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被一个含酰胺的骨架，特别是，被一个氨乙基甘氨酸(aminoethylglycine)骨架所替代。核碱基被保留下来，并直接或间接地与骨架酰胺部分的氮杂氮原子(aza nitrogen atoms)相连。讲授PNA化合物制备方法的有代表性的美国专利包括但不限于，U.S.Pat.Nos:5，539，082 ;5，714，331 ;和5，719，262，这些专利每篇都被结合于此作为参考。还可以在Nielsen et al.，Science，1991，254，1497-1500中找到关于PNA化合物的讲授。
[0129]大多数本发明优选的实施例是具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸类和具有杂原子骨架的寡核苷类，特别是，上述参考的美国专利U.S.Pat.N0.5，489，677的-CH2-NH-O-CH2-,-CH2-N (CH3)-O-CH2-[称之为亚甲基(甲基亚氛基)或MMI 骨架]，-CH2-O-N (CH3)-CH2-,-CH2-N(CH3) -N (CH3) _012_和-O-N (CH3) -CH2-CH2-[其中，原本的磷酸酯骨架被表示为-0-P-0-CH2-]，以及上述参考的美国专利U.S.Pat.N0.5，602, 240的酰胺骨架。还优选的是上述参考的美国专利U.S.Pat.N0.5，034，506的具有吗啉代骨架结构的寡核苷酸类。
[0130]修饰糖组成部分
[0131]修饰寡核苷酸类也可以含有一个或多个取代的糖组成部分。例如，呋喃糖(furanosyl sugar)环可以利用多种方法来修饰,包括用取代基来取代,桥联以形成一种二环核酸“BNA”(bicyclic nucleic acid),以及如颁授给Seth等的美国专利U.S.Pat.N0.:7，399, 845中描述的，并全部被结合于此作为参考的，利用像S或N(R)那样的杂原子来取代4’-O。其他关于BNA的例子可见国际专利申请号WO 2007/146511的出版物，全部被结合于此作为参考。
[0132]本发明的反义化合物可选地可以含有一个或多个具有修饰糖组成部分的核苷酸。糖修饰可以赋予反义化合物核酸酶稳定性，结合亲和力或者一些其他有益的生物特性。核苷的呋喃糖环可以利用多种方法来修饰，包`括单不限于:加入一个取代基，特别是在2’位置上；桥接两个不成对(non-geminal)环的原子以形成一种二环核酸(BNA);利用一个原子或者像-S-，-N(R)_或-C(R1) (R2)那样的基团来取代环上4’位置的O。修饰糖包括但不限于:取代糖，尤其是具有2’ -F，2’ -OCH2 (2’ -OMe)或者2’ -O (CH2) 2_0CH3 (2’ -O-甲氧基乙基或2’ -Μ0Ε)取代基的2’ -取代糖；以及具有4’ - (CH2) n-0-2’桥接的二环糖类(BNAs)，其中η = I或η = 2。制备修饰糖的方法是业内人士所熟知的。
[0133]在某些实施例中，2’ -修饰核苷具有一个二环糖组成部分。在某些这样的实施例中，该二环糖组成部分是一种a-D-糖。在某些这样的实施例中，该二环糖组成部分是一种β-D-糖。在某些这样的实施例中，该二环糖组成部分是一种a-L-糖。在某些这样的实施例中，该二环糖组成部分是一种β-L-糖。
[0134]在某些这样的实施例中，该二环糖组成部分包含在2’ -C原子与4’ -C原子间的桥接基团。在某些这样的实施例中，该桥接基团包含从I至8个连接的双自由基(biradical)基团。在某些实施例中，该桥接基团包含从I至4个连接的双自由基基团。在某些实施例中，该桥接基团包含2个或3个连接的双自由基基团。在某些实施例中，该桥接基团包含2个连接的双自由基基团。在某些实施例中，一个连接的双自由基基团选自-O-, -S-, -N(R1)-, -C(R1) (R2)-, -C(R1) = C(R1)-, -C(R1) = N-, -C ( = NR1)-, -Si (R1)(R2) -，-S ( = 0) 2_，-S ( = 0) -, _C ( = 0)-和-C ( = S)-;式中，每个 Rl 和 R2 是独立的，H,羟基，C1-C12烷基，取代的C1-C12烷基，C2-C12链烯基，取代的C2-C12链烯基，C2-C12炔基，取代的C2-C12炔基，C5-C20芳基，取代的C5-C2tl芳基，杂环自由基(radical)，取代的杂环自由基，杂芳基(heteroaryl)，取代的杂芳基，C5-C7脂环自由基，取代的C5-C7脂环自由基，卤素，取代的氧代(-O-)，氨基，取代的氨基，叠氮基(azido)，羧基，取代的羧基，酰基，取代的酰基，CN,硫轻(thiol),取代的硫轻,磺酰基(S( = O)2-H),取代的磺酰基,砜基(sulfoxyl) (S(=O)-H)或取代的砜基(S( = O)-H);而且，每个取代基各自独立的是卤素，C1-C12烷基，取代的C1-C12烧基，C2-C12链烯基，取代的C2-C12链烯基，C2-C12炔基，取代的C2-C12炔基，氨基，取代的氨基，酰基，取代的酰基，C1-C12氨烷基，C1-C12氨代烷氧基，取代的C1-C12氨烷基，取代的C1-C12氨代烷氧基或者一种保护基团。
[0135]在某些实施例中，该二环糖组成部分利用一个双自由基基团被桥接在2’与4’位置之间，该双自由基基团选自-O-(CH2)P-, -O-CH2-, -O-CH2CH2-, -O-CH(alkyl)-, -NH-(CH2) P-? _N (alkyI) _ (CH2) p_，_0_CH (alkyl) _ (CH (alkyl)) _ (CH2) p-? -NH-O- (CH2)) p-?N(alkyl)-O-(CH2)P-,或者 _0_N(alky)-(CH2)p-，式中的 p 为 1，2，3，4 或者 5，每个烷基(alkyl)还可以被进一步取代。在某些实施例中，P为1，2或者3。
[0136]一方面，每个所说的桥接独立地是-[C(R1) (R2)Un-, -[C(R1) (R2)]n-Ο-, -C(R1R2)-N(R1)-O-或者-C(R1R2)-O-N(R1)_。另一方面，每个所说的桥接独立地是 4’ _ (CH2) 3_2，，4’ _ (CH2) 2_2，，4，_CH2_0_2，，4，_ (CH2) 2_0_2，，4，-CH2-O-N(R1) _2，和4’ -CH2-N(R1)-0-2’，式中，每个R1独立地是H，一种保护基团或者C1-C12烷基。
[0137]在具有修饰糖组成部分的核苷酸中，核碱基组成部分(天然的，修饰的或者它们二者的结合)保持与合适的核酸靶杂交。
[0138]在一个实施例中，靶向核酸的反义化合物包含一个或多个具有修饰糖组成部分的核苷酸。在一个优选的实施例中，修饰糖组成部分是2’-Μ0Ε。在另外一个实施例中，该2’ -MOE修饰核苷酸被配置在一个gapmer模体中。
[0139]目前优选的寡核苷酸在2’位置上包含有以下基团之一种:0H;F ；0-, S_,或N-烧基；0-，S-，或N-链烯基 ；0-，S-，或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，式中，烷基，链烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1-Cltl烷基或者C2-Cltl链烯基和炔基。特别优选的是0[ (CH2)n0] IiiCH3,0 (CH2) nOCH3,0 (CH2) nNH2，O (CH2) nCH3,0 (CH2) nONH2,和 0 (CH2) nON[ (CH2) nCH3] 2，式中的n和m为从I至10左右。其他优选的寡核苷酸包含如下的在2’位置上的基团之一种:C1-C5低碳烷基，取代的低碳烷基，链烯基，炔基，烷芳基，芳烷基，O-烷芳基或者O-芳烷基，SH, SCH3, 0CN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2,杂环烷基，杂环烷芳基，氨烷基氨基，多烷基氨基，取代的甲硅烷基，RNA切割基团，报道基团(reporter group)，嵌入剂，改善寡核苷酸药物动力学性能的基团，或者改善寡核苷酸药效学性能的基团，以及其他具有相同性质的取代基团。一种优选的修饰包括2’ -甲氧基乙氧基(2’ -O-CH2CH2OCH3,也称为 2’ -0-(2-甲氧基乙基)或者 2’ -Μ0Ε) (Martin et al.，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504),即一种烧氧基烧氧基基团(alkoxyalkoxy)。还有一种修饰包括2’-二甲氨基氧乙氧基，即一个O(CH2)2ON(CH3)2，也称为2’-DMA0E，以及2’- 二甲氨基乙氧基乙氧基(业内也称之为2’ 二甲氛基乙氧基乙基，或者2’ -DMAE0E)，即2’ -O—CH2—O—CH2一N(CH2)2。还有一个优选的修饰包括二环核酸(也称之为锁定的核酸类(locked nucleic acids,LNAs))，其中2’ -羟基连接在糖环3’或4’的碳原子上形成一个双环的糖组成部分。键合优选桥接2’氧原子与4’碳原子的亚甲基(一CH2--)n，其中η为I或2，包括α-L-亚甲基氧(a-L-MethyIeneoxy) (4，-CH2-0_2，)ΒΝΑ, β-D-亚甲基氧(4，-CH2-0_2，)BNA 和亚乙基氧(Ethyleneoxy) (4，-(CH2)2H )BNA。二环修饰糖也包括(6，S)_6’ 甲基 BNA，氨基氧(Aminooxy) (4，_CH2_0_N(R)_2’ )BNA,氧氣基(Oxyamino) (4，_CH2_N(R)_0_2’ )BNA,式中，R独立地是H，一种保护基团，或者C1-C12烷基。LNAs也与互补的DNA，RNA或LNA以高的热亲和力形成双链体。圆二色性(Circular dichroism,⑶)光谱显示涉及完全修饰的LNA (特别是LNA: RNA)的双链体在结构上类似一种A型的RNA: RNA双链体。对一种LNA: DNA双链体的核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)检验肯定了 LNA单体的3’ -内向(3’-endo)构象。双链DNA的识别也已经证实了假定的LNA链入侵。关于错配序列的研究显示LNAs遵循Watson-Crick碱基配对规则，与相应的未修饰的参照链相比,它的选择性一般较高。
[0140]LANs中的2’ -羟基与糖环的4’碳原子连接，形成2’ -C，4’ -C-氧亚甲基连接，如此形成了一个二环糖组成部分。反应该连接可以是桥接2’氧原子与4’碳原子的亚甲基(-012-)11，其中11为1或2(51叩11 et al.，Chem.Commun.，1998，4，455-456)。LNA 和 LNA 类似物表现出非常高的与互补的DNA和RNA的双链体热稳定性(Tm = +3-+10°C )，抗3’ -外切核苷酸(3' -exonucleolytic)降解的稳定性以及良好的溶解性。其他优选桥接集团包括2’ -脱氧-2’ -CH20CH2-4’桥接。关于LNAs及其制备可见国际专利申请N0.WO 98/39353和TO99/14226的出版物。
[0141]其他优选的修饰包括2’ -甲氧基(2’ -O-CH3)，2’ -氨丙氧基(2’ -OCH2CH2CH2NH2)，2’ -烯丙基(2’ -CH2-CH = CH2)，2’ -O-烯丙基(2’ -O-CH2-CH = CH2)和 2’ -氟(2’ -F)。2’-修饰可以在阿糖(arabino)(上边)位置 或者在核糖(ribo)(下边)位置。优选的2’ -阿糖修饰是2’ -F。也可以在寡核苷酸的其他位置上进行类似的修饰，尤其是在3’末端核苷酸上或者在2’ -5’连接的寡核苷酸中的糖的3’位上，以及5’末端核苷酸的5’位置上。寡核苷酸也可以具有糖模拟物或者替代物(有时指的是DNA类似物)，像环丁基组成部分来替代五元呋喃糖。讲授这样的修饰糖结构制备方法的有代表性的美国专利包括但不限于，U.S.Pat.Nos:4，981，957 ;5，118，800 ;5，319，080 ;5，359，044 ;5，393，878 ;5，446，137 ；5，466，786 ;5，514，785 ;5，519，134 ;5，567，811 ;5，576，427 ;5，591，722 ;5，597，909 ；5，610，300 ;5，627，053 ;5，639，873 ;5，646，265 ;5，658，873 ;5，670，633 ;5，792，747 ；和5，700，920，它们中的某一些为本申请所共有，每个这些专利都被结合于此作为参考。在某些实施例中，核苷的修饰是把核糖基环用替代物环系统，像吗啉代环，环己烯基环，环己基环或者四氢吡喃基环来代替，例如有如以下结构式中的一种:
[0142]
HO--v^O^HO^s^O、
HO' ￡ Βχ ΗΟ'、.^^Βχ
FOCH3
[0143]业内也知晓许多其他的二环和三环的糖替代物环系统可以用于修饰核苷，以结合到反义化合物中去(见综述文章，例如:Leumann, Christian J.,)。这样的环系统可以经历各种各样另外的取代反应来增强其活性。
[0144]在本发明的一个实施例中，该化合物包含至少一个四氢吡喃修饰核苷，其中，一个四氢吡喃环取代了呋喃糖环。[0145]在本发明的另一个实施例中，其中至少一个四氢吡喃修饰核苷的每一个具有结
构:
[0146]
【权利要求】
1.一种化合物，它包含由12-30个连接的核苷所组成的修饰寡核苷酸，在选自SEQIDNO:9 的核苷酸 718-751，1388-1423，1457-1689，2040-2069，2120-2147，2728-2797，2267-2301,553-611,1394-1423，1469-1508，1559-1605，1659-1689，2100-2129 及1399-1423的区域内至少存在它的一个12个核碱基序列的部分。
2.一种化合物，它包含由12-30个连接的核苷所组成的修饰寡核苷酸，在SEQ ID NO:28，30，39，40，43，44，45，50，51，52，56，78，125和166中提出的核碱基序列中至少存在它的一个具有12个核碱基序列的部分。
3.如权利要求第2项所述的化合物，其特征在于，该修饰寡核苷酸由20个连接的核苷所组成。
4.一种化合物，它包含由至少12个连接的核苷所组成的修饰寡核苷酸，在SEQ ID NO:28，30，39，40，43，44，45，50，51，52，56，78，125和166中提出的核碱基序列中存在它的核碱基序列部分。
5.如权利要求第4项所述的化合物,其特征在于,该修饰寡核苷酸由至少14个连接的核苷所组成。
6.如权利要求第1-5项的任意一项所述的化合物，其特征在于，该修饰寡核苷酸为单链寡核苷酸。
7.如权利要求第1-5项的任意一项所述的化合物，其特征在于，该修饰寡核苷酸为双链寡核苷酸。
8.如权利要求第1-7项的任意一项所述的化合物，其特征在于，该修饰寡核苷酸具有一个序列，在其整个长度上，它与 SEQ ID NO:28，30，39，40，43，44，45，50，51，52，56，78，125和166中提出的序列之一的一个 部分100%完全一致。
9.如权利要求第1-8项的任意一项所述的化合物，其特征在于，该修饰寡核苷酸至少包含一个修饰的核苷间的连接。
10.如权利要求第9项所述的化合物，其特征在于，至少一个修饰的核苷间的连接为硫代磷酸酯核苷间的连接。
11.如权利要求第10项所述的化合物，其特征在于，所有修饰的核苷间的连接为硫代磷酸酯核苷间的连接。
12.如权利要求第1-7项的任意一项所述的化合物，其特征在于，至少一个核苷包含修饰的糖。
13.如权利要求第12项所述的化合物，其特征在于，该修饰的糖为一种二环糖。
14.如权利要求第12项所述的化合物，其特征在于，至少一种该修饰的糖包含2’-0_甲氧基乙基。
15.如权利要求第1-7项的任意一项所述的化合物，包含至少一个四氢吡喃修饰的核苷，其特征在于，一个四氢吡喃环替代了呋喃糖环。
16.如权利要求第15项所述的化合物，其特征在于，每一个所述化合物的至少一个四h°^°^氢吡喃修饰的核苷具有结构:
VO: Bx
F 其特征在于，Bx为可选的被保护的杂环碱基部分。
17.如权利要求第1-7项的任意一项所述的化合物，其特征在于，至少一个核苷包含修饰的核碱基。
18.如权利要求第17项所述的化合物，其特征在于，该修饰的核碱基为5’-甲基胞嘧啶。
19.如权利要求第1-7项的任意一项所述的化合物，其特征在于，该修饰的寡核苷酸包含: (a)由连接的脱氧核苷组成的缺口片段； (b)由连接的修饰的核苷组成的5’翼片段； (c)由连接的修饰的核苷组成的3’翼片段； 其特征在于，该缺口片段位于该5’翼片段和该3’翼片段之间，其特征还在于每个翼片段之中的每个修饰的核苷包含修饰糖。
20.如权利要求第19项所述的化合物，其特征在于，该修饰的寡核苷酸包含: (a)由13个连接的脱氧核苷组成的缺口片段； (b)由2个连接的修饰的核苷组成的5’翼片段； (c)由5个连接的修饰的核苷组成的3’翼片段； 其特征在于，该缺口片段位于该5’翼片段和该3’翼片段之间，其特征在于每个翼片段之中的每个修饰的核苷包含2’ -O-甲氧基乙基糖；其特征还在于，每个核苷间的连接为硫代磷酸酯连接。
21.如权利要求第1-20项的任意一项所述的化合物，其特征在于，该修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成。
22.如权利要求第1-21项的任意一项所述的化合物，其特征在于，该核碱基序列为SEQID NO:39所提出的序列。
23.如权利要求第1-21项的任意一项所述的化合物，其特征在于，该核碱基序列为SEQID NO:40所提出的序列。
24.如权利要求第1-21项的任意一项所述的化合物，其特征在于，该核碱基序列为SEQID NO:45所提出的序列。
25.如权利要求第1-21项的任意一项所述的化合物，其特征在于，该核碱基序列为SEQID NO:52所提出的序列。
26.如权利要求第1-21项的任意一项所述的化合物，其特征在于，该核碱基序列为SEQID NO:166所提出的序列。
27.一种组合物，它含有包含连接的核苷的修饰寡核苷酸，它的核碱基序列为SEQIDNO:28，30，39，40，43，44，45，50，51，52，56，78，125 和 166 中所提出的序列，或者是其盐，还含有药用可接受的载体或稀释剂。
28.如权利要求第1-21项的任意一项所述的化合物，其特征在于，该核碱基序列在SEQID N0:9的核苷酸范围内(例如，1388-1423，A-B，C-D，及E-F) 100%互补，只要先前设计的寡核苷酸不在该范围内。
29.如权利要求第28项所述的化合物，其特征在于，该修饰寡核苷酸为单链寡核苷酸。
30.如权利要求第28项所述的化合物，其特征在于，该修饰寡核苷酸为双链寡核苷酸。
31.如权利要求第28-30项的任意一项所述的化合物，其特征在于，该修饰寡核苷酸由20个连接的核苷组成。
32.—种抑制结缔组织生长因子在细胞或组织中表达的方法，它包括使该细胞或组织在结缔组织生长因子的表达被抑制的条件下与如权利要求第1-31项的任意一项所述的化合物接触。
33.一种治疗患有与结缔组织生长因子的表达有关的疾病或状况的动物的方法，它包括给该动物施加 一定量的如权利要求第1-31项的任意一项所述的化合物，有效地抑制结缔组织生长因子的表达，以治疗该动物。
34.如权利要求第33项所述的方法，其特征在于，该疾病或状况为过度增生病症。
35.如权利要求第34项所述的方法，其特征在于，该过度增生病症为癌症。
36.如权利要求第33项所述的方法，其特征在于，该疾病或失调为纤维变性病。
37.如权利要求第36项所述的方法，其特征在于，该纤维变性病为瘢痕肥大，瘢痕疙瘩，皮肤瘢痕，肝纤维化，肺纤维化，肾纤维化，心纤维化，或者再狭窄。
38.如权利要求第33项所述的方法，其特征在于，该疾病或失调为关节纤维化(包括冻结肩综合症，腱和外周神经损伤)，脊髓损伤，冠状动脉搭桥，腹部和腹膜粘连(包括子宫内膜异位症，子宫平滑肌瘤和纤维瘤)，角膜放射状切开术和角膜光反射状切开术，视网膜再附着手术，器械介导的纤维变性(例如在糖尿病中)，腱粘连，掌挛缩病，或者硬皮病。
39.一种在需要时减少受试者因伤口愈合引起的瘢痕的方法，它包括给该受试者施加一定量的如权利要求第1-32项的任意一项所述的化合物，有效地抑制结缔组织生长因子的表达以减少受试者因伤口愈合引起的瘢痕。
40.如权利要求第39项所述的方法，其特征在于，伤口愈合为选自由皮肤破损，手术切口，和烧伤组成的这一组的伤口的愈合。
【文档编号】C12N15/113GK103429270SQ200980133819
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2009年8月25日 优先权日:2008年8月25日
【发明者】尼古拉斯·M·迪恩, J·戈登·福克斯, 尼尔·欧唐奈, C·弗兰克·本尼特, 苏珊·M·弗赖尔 申请人:埃克斯雷德制药有限公司, Isis制药有限公司