在不存在其辅因子的情况下具有凝血活性的因子ix变体及其治疗出血障碍的用途的利记博彩app

专利名称：在不存在其辅因子的情况下具有凝血活性的因子ix变体及其治疗出血障碍的用途的利记博彩app
在不存在其辅因子的情况下具有凝血活性的因子IX变体 及其治疗出血障碍的用途本发明涉及凝血级联的维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶的变体，优选因子IX (F. IX)的变体，其中该变体的特征在于在不存在其辅因子的情况下具有凝血活性。本发明还 涉及这些变体用于治疗和/或预防出血障碍中的用途，尤其是血友病A和/或血友病B或 由F. VIII的抑制性抗体引起或使其并发的血友病。本发明还涉及具有期望性质并且因此 可被剪裁用于各种特性治疗用途的因子IX (F. IX)的其它变体。发明背景 凝血因子IX
凝血因子IX (F. IX)在凝血级联中起着核心的作用。F. IX是胰蛋白酶样维生素-K依 赖性丝氨酸蛋白酶，其作为单链无活性酶原在血浆中循环(Dikipio等，1977; Davie等， 1991)。因子IX通过因子XIa活化或通过VIIa-组织因子以Ca2+依赖性的方式活化。该活 化需要通过经活化的因子VII (F. VIIa)-组织因子复合物或活化的因子XI (F. XIa)切割两 个肽键(Fujikawa等，1974; Lindquist等，1978)以移除；35残基活化肽。F. IX是多结构域蛋白质。在N-端γ -羧基谷氨酸(GLA)结构域之后是两个表皮 生长因子样(EGF)重复、活性肽(AP)和具有胰蛋白酶样活性部位的C-端丝氨酸蛋白酶结 构域(Dikipio等，1978)。这一结构域结构定义了凝血因子的丝氨酸蛋白酶家族(Furie 和Furie，1988)，所述家族还包括因子II (F. II)、因子VII (F. VII)、因子X (F. X)、因 子XI (F. XI)、因子XII (F. XII)以及蛋白C (PC)。在这一家族中，F. DCa具有独特的蛋 白水解性质。F. DCa与F. VIIIa在磷脂表面上形成复合物使针对天然底物F. X的反应性增 加至IO6倍，然而几乎没有观察到具相应的F. X序列的肽的切割(McRae等，1981)。活化的因子IX (F. IXa)然后在依赖于钙离子、膜表面(磷脂)和非酶蛋白辅因 子、活化的因子VIII (F. Villa)存在的反应中活化因子X (F. X) (Davie等，1991)。F. DCa在止血中的重要性通过在F. IX基因中携带有突变的个体的出血障碍血友 病B的发生得以反映(Gianelli等，1998)。F. DCa在缺乏其辅因子F. VIIIa的情况下对天 然或合成底物仅显示出很少的蛋白水解活性。F. VIIIa的结合导致F. X蛋白水解活性升高 至IO6倍，而对肽底物的活性保持很少的影响(Duffy和Lollar，1992 ； McRae等，1981)。 F. IXa调节的后者的底物依赖性活性在相关的凝血酶活化的PC(辅因子蛋白S)、F. Xa (辅 因子Va)、F. Vila (辅因子组织因子)和FIIa (辅因子血栓调节蛋白)中都类似地观察 到了，它们在其辅因子的存在下，达到显著的活性或与它们天然底物的特异性的改变(Marm 等2003)。所有的凝血丝氨酸蛋白酶共享广泛的结构和功能同源性。此外，凝血因子IXa (F. IXa)和(F. Xa)均仅在磷脂表面与辅因子一起才有效 地切割天然底物。Hopfner等(1997)在大肠杆菌coli)中研究了截短的F. IXa (rf9a) 和F. Xa (rflOa)变体，以鉴定F. IXa的酰胺分解活性为F. Xa的1/104的差异的决定因素。 基于F. IXa和F. Xa的晶体结构，随后在rf9a和rf IOa之间交换四个特征性活性位点成分 (即基于糜蛋白酶编号的Glu219、148-环、Ile213、99_环)。此外，结合所有四个突变基本 上将F. Xa的性质引入了 rf9a中，即具有F. Xa底物选择性的酰胺分解活性增加至130倍。
在酶学上，F. IXa的特征在于其非常低的酰胺分解活性，这在辅因子即因子VIIIa (F. Villa)的存在下也没有提高，这使得F. DCa与所有其他凝血因子相区分。F. IXa-F. VIIIa复合物的活化需要其大分子底物因子X(F. X)。靠近活性位点的99-环部分地解释了 F. DCa较差的活性，因为其采取了干扰典型底物在亚位点S2-S4结合的构象。Sichler等 (2003)公开了残基Lys-98和Tyr_99 (糜蛋白酶编号)与F. 1 的酰胺分解特性密切相关。 用较小的残基替换Tyr-99不仅导致整体降低的活性，还导致了在Sl中受损的结合。用较 小且不带电的残基替换Lys-98增加了活性。同时诱变Lys-98、Tyr-177和Tyr_94 (rf9-Y94F/K98T/Y177T,糜蛋白酶编号))产生了具有升高至7000倍的活性及经改变的对因子 叙的特异性的酶。Sichler等Q003)得出结论，这些残基对低因子DCa活性负责。Sichler 等认为，该三联突变rf9- Y94F/K98T/Y177T(糜蛋白酶编号)很可能模拟了生理上 由辅因子和底物结合所诱导的构象改变。血友病
最著名的凝血因子病症是血友病。血友病是一类遗传性病症的名称，所述病症损害了 机体控制血液凝固、或凝聚的能力。血友病A是最常见的形式，其由因子VIII(F. VIII)基 因的突变所引起，所述突变导致了 F. VIII的缺陷。该遗传是X-连锁隐性基因，因此，雄性 受到影响，而雌性是携带者或非常少的显示温和表型。5000雄性中有1个受到影响。血友 病B也称为因子IX (F. IX)缺陷，其为第二常见的血友病类型，但是血友病B远不如血友 病A常见。这些遗传缺陷可降低正常凝结过程所需的凝血因子的血浆凝血因子水平。当血管 受到损伤时，确实会形成临时性结痂，但是缺乏的凝血因子阻碍了维持血块所需的纤维蛋 白的形成。因此，血友病患者不会比正常人更强烈地出血，但是会出血长得多的时间。在严 重的血友病患者中，甚至很小的创伤也将导致血液的丧失持续数天、数周或甚至不能完全 愈合。这里严重的危险是由于缺乏F. VIII的正常小流血需要长时间来痊愈。在诸如大脑 或内部关节区域，这可能是致命的或会使生命衰弱。外部创伤的流血是正常的，但是后期再 流血和内部流血的发生率升高，尤其是流入肌肉、关节或流入封闭的空间。主要的并发症包 括关节积血、出血、胃肠道出血和月经过多。尽管没有对血友病的疗法，但其可通过规则地输注缺陷凝血因子(即，血友病A中 的F. VIII，或血友病B中的F. IX)而得以控制。在西方国家，对于血友病的护理的通常标准落入以下两种类型之一 (i)预防或请求式。预防包括以规则的方案输注凝血因子，以保持高到足以预防自发流血发作的 凝血水平。请求式治疗包括一旦出现出血发作时对其进行治疗。然而，一些血友病患者产生了针对给予他们的替代因子的抗体(抑制剂)，因此必 须升高该因子的量或必须给予非人替代产品，诸如猪F. VIII或其经修饰的变体，例如参见 WO 01/68109 Al (Emory University)。如果作为循环的抑制剂的结果使得患者变得对替代凝血因子具耐性，这可用重组 人因子 VII (NovoSeven )来克服，也参见 EP 1 282 438 Bl 和 EP 1 282 439 Bl (Novo Nordisk) 0目前这一方法的限制是因子Vila分别与因子VIII (10至14小时)或因子IX (18 至30小时)相比短的、且取决于制备的短半衰期0至3小时)，这使得使用因子VIIa的预 防治疗有困难。此外，在长时间间隔应用已经活化的蛋白酶(例如因子Vila)的风险可能携带风险，包括血栓形成风险、血管内皮的恒久活化以及血管损伤的风险、促-凝血信号传 导可能促进肿瘤生长或转移的风险，等等。WO 02/40544 A2公开了在肝素结合结构域包含突变的突变型人因子IX，与野生型 F. IX相比，其降低了该突变型人F. IX对肝素的亲和力，并且公开了它们在血友病B的治疗 干预中的用途。基因治疗
血友病对于基因治疗方法是理想的，因为所需要凝固作用是在血流中循环的，并且因 此可在机体的每一处基础地表达。此外，对具有严重形式疾病的患者的预防治疗的研究已 证实了循环凝血因子超过1%的最小提升已经能够改善临床结果并且避免多数由该疾病引 起的损害，即关节破坏。已经开发了数种基因治疗方法，但测试仍在早期临床阶段。最有希 望的方法是当前的使用腺相关病毒载体(AAV)治疗血友病B。肌肉内注射AAV至患有血友病的人的骨骼肌中是安全的，但是为达到治疗的因子 IX水平需要较高的剂量。然而，剂量增加在这一方法中是不可能的，因为形成抑制抗体的风 险取决于每一注射位点的肌肉中表达的F. IX抗原量。在血友病B狗模型中的估测得到了这 样的结论，为了在人体中获得约1%的F. IX表达水平将需要超过400次肌肉内注射(Arruda 等，2004)。因此，这一方法不能用于人。这一方法的效力受到F. IX在肌肉细胞外空间中 滞留的妨碍，以及受到肌肉以高表达率合成完全活性F. IX的有限的能力的妨碍。为克服这 些限制，Schuettrumpf等Q005)构建了编码F. IX变体的AAV载体，用于血友病B小鼠中 的肌肉或肝脏定向表达。肌肉内注射AAV-F. IX-K5A/V10K (F. IX编号)(对细胞外基质具 有低亲和力的变体)后，循环F. IX水平是野生型(WT)F. IX的2-5倍高，而蛋白质比活保持 类似。在载体分别递送至骨骼肌或肝脏后，F. IX-R338A的表达产生了为F. IX-WT的2或6 倍高的比活的蛋白。在通过尾剪除测试的攻击时，F. IX-WT和变体形式在体内提供了有效的 止血。重要的是，肌内注射AAV-F. IX变体没有在对F. IX-WT耐受的小鼠中引发针对F. IX 的抗体形成。除了所提到的首先由Chang等(1998)描述的R338A变体之外，已经还描述了 具有更高F. IX比活的另一变体V86A (Chang等，2002)。与血友病B相比，对血友病A的基因治疗策略的应用更为复杂，这是由F. VIII比 F. IX更高的免疫原性和更大的大小导致的。因此，本领域需要提供改进的用于治疗和/或预防出血障碍，尤其是血友病A和/ 或B的工具和方法。因此，本发明的目标是改进现有技术中存在的用于治疗和/或预防出血障碍的方 法和工具，并且因此本发明的目的是提供允许有效、特异性和靶向治疗和/或预防出血障 碍，尤其是血友病A和/或B的经改进的方法和工具。根据本发明，这一目的通过提供凝血级联中的维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶的变 体得以解决，其中该变体的特征在于在不存在其辅因子的情况下具有凝血活性。凝血因子VII (F. VII)、IX (F. IX)和X (F. X)以及辅因子抑制蛋白C(其降解辅 因子F. Va和F. Villa)以及凝血酶是凝血级联中的维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶。维生素 K是对肝Y -谷胺酰基羧化酶重要的因子，其将羧基加到因子II (凝血酶)、VII、IX和X，以 及蛋白S、蛋白C和蛋白Z的谷氨酸残基上(在Gla结构域中)。如上面所讨论的那样，包括因子II (F. II)、因子VII (F. VIII)、因子IX (F. IX)、因子X (F.X)和蛋白C (PC)的凝血因子丝氨酸蛋白酶家族由特定的结构域结构所定义 (Furie 和 Furie, 1988)。丝氨酸蛋白酶由在该酶的活性位点存在丝氨酸残基来表征。所提到的蛋白以酶原 形式循环，并通过活性部位的切割得以活化。在所有维生素K-依赖性凝血蛋白酶之间存 在高同源性。它们中的若干种仅在组装于由蛋白酶、辅因子和磷脂膜组成的复合物中时才 显示出活性的升高。辅因子结合的分子效果及结合位点在这些蛋白之间是类似的。F. DCa 调节的后者的底物依赖性活性在相关的凝血酶活化的PC(辅因子蛋白S) ,F. Xa (辅因子 Va) ,F. VIIa (辅因子组织因子)和FIIa (辅因子血栓调节蛋白)中都类似地观察到了，它 们在其辅因子的存在下，达到显著的活性或与它们天然底物的特异性的改变(Hockin等， 2002)。因此，凝血级联中的维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶的变体优选选自VII (F. VII)、 因子IX (F. IX)、因子X (F. X)、蛋白C或凝血酶的变体。术语“变体”优选指氨基酸替换、添加(插入)或缺失变体，或天然存在的蛋白的 衍生物。变体还包括包含经修饰的氨基酸、非天然氨基酸或肽模拟物(P^tidomimetic)或 其它可模拟肽键/结构的化合物的氨基酸序列。变体还可以包含用其它分子的一部分替换 或偶联、或与其它分子偶联。氨基酸替换包含通过其它氨基酸的或通过等构物(isostere，拥有与蛋白质氨基 酸的相近结构和空间相似性的经修饰的氨基酸)的保守及非保守替换、氨基酸添加或等构 物添加。保守氨基酸替换通常涉及相同类氨基酸之间的替换。这些类包括，例如 -具有不带电极性侧链的氨基酸，诸如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸以及酪氨
酸；
-具有碱性侧链的氨基酸，诸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸； -具有酸性侧链的氨基酸，诸如天冬氨酸和谷氨酸；以及
-具有非极性侧链的氨基酸，诸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、 苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸以及半胱氨酸。因子IX的变体蛋白
在本发明的优选的实施方案中，提供了维生素K-依赖性丝氨酸蛋白酶因子IX (F. IX) 或活化的因子XI (F. IXa)的变体，其中该F. IX变体的特征在于其在不存在其辅因子的情 况下具有凝血活性，其中该辅因子是因子VIII (F. VIII)或活化的因子VIII (F. Villa)。本专利申请中的因子IX (F. IX)是指由Kurachi和Davie, 1982描述的人F. IX蛋 白和cDNA。对于mRNA/cDNA 的 Ref seq NM_000133 (SEQ ID NO. 1 )禾口 对于蛋白质序列的 Refseq NP_000124 (SEQ ID NO. 2)。SEQ ID NO. 2的氨基酸序列含有信号肽和F. IX的前肽。实际的编号从-46 (Met) 开始；+ 1是Tyr。在F. IX的基因以及氨基酸序列中存在多个天然存在的多态性。以下显示了来自 King's College London ^ifil^^f B(Hemophilia B Mutation Database)白勺歹Ij 表(例如参见 http://www. kcl. ac. uk/ip/petergreen/haemBdatabase. html)。例如，最常
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权利要求
1.因子IX(F.IX)或活化的因子IX(F. IXa)的变体，其特征在于其在不存在其辅因子 的情况下具有凝血活性，其中所述的辅因子是因子VIII (F. VIII)或活化的因子VIII (F. Villa)， 优选包 含至少 一个选 自 255 至 269, 383 ISl, 290, 388, 34, 25, 353 35S, 338,.3.77,. 4 86, 217, 277的位置上的氨基酸替换， 和/或99-环的修饰，更优选选自 IC265T； K265A, !3S3V, V1SH, 1290L, E388G, N34D, F25Y, F353Y, R358A, R338A, R33IL, S377W, G4Y. V86A, V2I7L, ￡277A的氨基酸替换，和 / 或99-环的修饰。
2.权利要求1的变体因子IX，其包含位置沈5上的氨基酸替换或氨基酸替换K265T，其与至少一个选自 383, 181, 290, 388, 34, 25, 353, 358, 338 377, 4,16,21 和 / 或 277 的位置上的氨基酸替换 结合；优选位置265上的氨基酸替换或氨基酸替换K265T，其与选自G4Y. V86A, V217L和/或E277A的氨基酸替换结合。
3.权利要求1或权利要求2的变体因子IX，其中所述的变体的特征在于在不存在辅因子F. VIII的情况下具有凝血活性， 其包含至少一个选自265、383、181和四0的位置上的氨基酸替换， 优选包含位置265上的氨基酸替换或氨基酸替换K265T，其与选自383、181和/或290 位置上的氨基酸替换结合，更优选包含位置265上的氨基酸替换或氨基酸替换K265T，其与选自I383V、V181I和/ 或I290L的氨基酸替换结合。
4.权利要求2或权利要求3的变体因子IX，其中位置265上的氨基酸替换选自K265T、 K265A、K265G、K265V、K265N和 K265D。
5.权利要求1至4任一项的变体因子IX，其中所述的变体的特征在于其在不存在辅因子F. VIII的情况下具有凝血活性，但是 与野生型相比、优选与变体因子IX K265T或与权利要求3的变体因子IX相比具有降低的 辅因子F. VIII存在下的活性，其包含至少一个在选自265、383、388、34、25、353和/或358的位置上的氨基酸替换， 优选包含氨基酸替换K265T，其与在选自383、388、34、25、353和/或358位置上的氨基 酸替换结合，更优选包含氨基酸替换K265T，其与选自I383V、E388G、N;34D、F25Y、F;353Y和/或R358A的氨基酸替换结合， 或包含至少一个在选自265、383、181、290、388、34、25、353和/或358位置上的氨基酸替换，优选包含氨基酸替换K265T，其与选自383、181、290、388、34、25、353和/或358的位置上的氨基酸替换结合，更优选包含氨基酸替换K265T，其与选自I383V、V181I、I290L、E388G、N34D, F25Y、 F353Y和/或R358A的氨基酸替换结合。
6.因子IX(F.IX)的变体，其特征在于与野生型相比，其具有升高的在其辅因子存在下 的凝血活性，其中所述的辅因子是因子VIII (F. VIII)或活化的因子VIII (F. Villa)，其优选包含至少一个在选自338、377、4、86、217和/或277的位置上的氨基酸替换，更优选地包含至少一个选自R338A、R338L、S377W、G4Y、V86A、V217L和/或E277A的氨基酸替换。
7.权利要求1、2或6任一项的变体因子IX，其中所述变体的特征在于其在不存在辅因子F. VIII的情况下具有凝血活性，并且具 有与野生型相比升高的在辅因子F. VIII存在下的凝血活性，其包含至少一个在选自沈5、338、377、4、86、217和/或277的位置上的氨基酸替换， 优选包含氨基酸替换K265T，其与在选自338、377、4、86、217和/或277的位置上的氨基肽替换结合，更优选包含氨基酸替换K265T，其与选自R338A、R338L、S377W、G4Y、V86A、V217L和/或 E277A的氨基酸替换结合， 或包含至少一个在选自265、383、181、290、338、377、4、86、217和/或277的位置上的氨基酸替换，优选包含氨基酸替换K265T，其与在选自383、181、290、338、377、4、86、217和/或277 的位置上的氨基酸替换结合，更优选地包含氨基酸替换K265T，其与选自I383V、V181I、I290L、R338A、R338L、S377W、 G4Y、V86A、V217L和/或E277A的氨基酸替换结合。
8.权利要求1至7任一项的变体因子IX，选自
9.权利要求1至7任一项的变体因子IX，选自变体K265T或具有在位置265上的氨基酸替换的变体(优选选自K265T、K265A、K265G、 K265V、I^65N 和，优选与位置181和/或383上的氨基酸替换(优选V181I和/或I383V)结合， 更优选
10.权利要求1至9任一项的变体因子IX，包含其它的化合物或部分，其优选与该变体 共价连接，诸如蛋白质、标记和/或聚合物。
11.编码权利要求1至10任一项的变体因子IX的核酸，优选与启动子和/或终止子序列可操作地连接，其更优选为表达质粒、基因治疗构建物、病毒或非病毒载体或用于基因修复的模板。
12.药物组合物，其包含至少一种权利要求1至10任一项的因子IX(F.IX)的变体，或 至少一种权利要求11的核酸，以及任选地可药用载体和/或赋形剂。
13.权利要求1至10任一项的因子IX(F.IX)的变体、权利要求11的核酸或权利要求 12的药物组合物，用于诊断、预防和/或治疗疾病。
14.权利要求13的因子IX(F.IX)的变体、核酸或药物组合物，其中所述的疾病是出血 障碍或出血，其中所述的出血障碍优选是血友病A、由针对因子F. VIII或F. VIIIa的抑制性抗体引 起或使其并发的血友病、血友病B，和/或其中所述的出血障碍或出血是其中使用了旁路试剂的出血障碍，包括例如新生 儿凝血病；严重肝病；高风险外科手术；外伤血丧失；骨髓移植；血小板减少和血小板功能 障碍；口服抗凝药的紧急逆转；因子V、VII、X和XI的先天性缺陷；以及具有血管性血友病 因子抑制剂的血管性血友病；与大伤相关的血丧失；脑出血；血小板功能障碍。
15.权利要求13或14的因子IX(F.IX)的变体、核酸或药物组合物，其用于细胞治疗、 基因治疗、蛋白质输注治疗。
16.权利要求13至15任一项的因子IX(F.IX)的变体、核酸或药物组合物，其中所述的因子IX(F. IX)的变体是变体D65T或如权利要求3、4、5或7任一项定义的，并且其中所述的疾病是血友病A或由针对因子F. VIII或F. VIIIa的抑制性抗体引起 或使其并发的血友病。
17.权利要求13至15任一项的因子IX(F.IX)的变体、核酸或药物组合物， 其中所述的因子IX(F. IX)的变体如权利要求3至7任一项所定义，并且其中所述的疾病是血友病B。
18.权利要求13至16任一项的因子IX(F.IX)的变体、核酸或药物组合物， 其中所述的因子IX(F. IX)的变体如权利要求5所定义，用于最小化血栓形成的风险。
19.权利要求13至18任一项的因子IX(F.IX)的变体、核酸或药物组合物， 其中所述的因子IX(F. IX)的变体如权利要求3、4、5或7所定义，用于诊断、预防和/或治疗血友病A、或由针对因子F. VIII的抑制性抗体引起或使其并 发的血友病或血友病B。
20.筛选抗凝剂、优选直接抑制F.DCa的物质的方法，包括应用权利要求1至10任一项 的变体因子IX。
全文摘要
本发明涉及凝血级联的维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶的变体,优选因子IX(F.IX)的变体，其中该变体的特征在于在其辅因子不存在的情况下具有凝血活性。本发明还涉及这些变体用于治疗和/或预防出血障碍中的用途，尤其是血友病A和/或血友病B或由针对F.VIII的抑制性抗体引起或使其并发的血友病。本发明还涉及具有期望性质并且因此可被设计用于各种特异性治疗用途的因子IX(F.IX)的其它变体。
文档编号C12N9/64GK102112608SQ200980129669
公开日2011年6月29日 申请日期2009年7月28日 优先权日2008年7月28日
发明者E.塞弗里德, J.塞特鲁姆普夫 申请人:巴登－符滕堡－黑森Drk－献血服务有限责任公司