专利名称：人骨骼肌中的褐色脂肪细胞祖细胞的利记博彩app
技术领域：
本公开内容涉及褐色脂肪组织、祖细胞、细胞分化和褐色脂肪组织解偶联蛋 白1。本公开内容还涉及代谢疾病，如肥胖症、2型糖尿病、胰岛素抗性和异常脂肪血症 (dyslipidemia)。介绍肥胖症的流行与糖尿病、高血压、冠心病、癌症和其它疾病的流行紧密相关。白 色脂肪组织的作用是储存脂质，而且其与肥胖症相关。褐色脂肪组织(“brown adipose tissue,BAT")的作用实际上相反。其专门氧化脂质并以热量消耗能量。事实上，褐色脂肪 细胞含有很多线粒体(其中进行细胞氧化)并独有地表达BAT解偶联蛋白1 (“uncoupling protein-LUCPl”)。UCPl作为氧化磷酸化的解偶联剂起作用，导致能量以热量损耗。交感 神经系统刺激线粒体发生以及UCPl的表达和活性。在啮齿动物中，BAT相关的热产生在暴 露在低温时提高(例如，防止体温过低)，或为由于过度进食而提高，燃烧过量摄取的脂肪 并防止体重增加。通过调节对体重增加的敏感性和消耗大量葡萄糖，BAT也提高胰岛素敏 感性。因此其在保持体温、能量平衡和葡萄糖代谢中有重要作用。转基因动物的实验证实了 BAT潜在的抗肥胖症特性。例如，已报导BAT的遗传删 除可导致肥胖症，而据报道BAT量和/或功能(和/或UCPl表达)的遗传提高可导致瘦且 健康的表型。尤其地，与对照小鼠相比，BAT量更高的小鼠增加的体重更少而且对胰岛素更 敏感。最近，在小鼠肌肉中证实了 BAT的异位贮存，认为其为防止体重增加和代谢综合征提 供了遗传机制。尽管已报道UCPl在啮齿动物中有控制能量平衡的作用，并且表达UCPl的BAT在 人新生儿中存在，但在长久以来都认为在成人中没有生理相关的UCPl表达。事实上，人们 认为表达BAT的UCPl在生命早期消失，并认为成人中没有BAT。发明概述本申请人在多种组织中鉴定出了可分化为褐色脂肪细胞之细胞的存在。在一个方 面中，申请人在骨骼肌中鉴定了这种细胞群，申请人称其为BAT祖细胞。本公开内容提供了 从多种组织中分选细胞以鉴定和分离BAT祖细胞的方法。在一些实施方案中，从人骨骼肌 中分离BAT祖细胞。本公开内容提供了在体外和体内将BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞的 方法。在一些实施方案中，可在人受试者体内使BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞。在一些实施方案中，本公开内容的BAT祖细胞可在培养物中扩增。在另一个实 施方案中，可通过药剂提高已分化BAT祖细胞中UCPlmRNA的表达，所述药剂如细胞通透 性cAMP衍生物、过氧化物酶体增殖剂激活受体(peroxisome-proliferator-acticated receptor, PPAR γ)激动剂等。在一些实施方案中，已分化为褐色脂肪细胞的BAT祖细胞可 包含大量的线粒体转录因子A(mtTFA)和PPAR γ共激活子_1 α (PGC-1 α )，这两者都参与对线粒体发生以及线粒体标志物细胞色素氧化酶IV(COXIV)的控制。分化的BAT祖细胞可显 示一个或多个以下特征高水平的UCPl表达、高水平的解偶联呼吸作用、高代谢率。申请人 提供了可通过使氧化磷酸化解偶联而代谢葡萄糖、氧化脂肪酸以及作为热量消耗能量的已 分化细胞。本公开内容提供了在成人骨骼肌中检测UCPlmRNA的方法，以及在体内提高其表 达的方法。关于成人UCPl表达的现有研究集中在白色脂肪组织中，但申请人公开了在人骨 骼肌中褐色脂肪祖细胞的存在及其分离，该细胞有表达UCPl的极大潜能。在一些实施方案 中，这种BAT祖细胞库可用于调节能量消耗和用于治疗肥胖症、糖尿病和代谢疾病。在一些方面中，本公开内容提供了在人骨骼肌中鉴定BAT祖细胞的方法，以及从 人骨骼肌样品中分离这些细胞的方法。还提供了在体外、体内或两者皆有的情况下促进这 些祖细胞分化为褐色脂肪细胞的条件和药剂(例如化合物、蛋白质、生物制品等)。提供了 使用这些条件和药剂治疗代谢疾病(如肥胖症、2型糖尿病、胰岛素抗性、异常脂肪血症等) 的方法。本公开内容提供了允许鉴定药剂(例如化合物、蛋白质、生物制品等)的测定方 法，所述药剂诱导UCPl基因表达、促使BAT祖细胞在体外分化为褐色脂肪细胞、促使BAT祖 细胞在体内分化为褐色脂肪细胞，或以上活性的组合。根据一些实施方案，用该方式鉴定的 药剂可用于治疗代谢疾病，例如肥胖症、2型糖尿病、胰岛素抗性、异常脂肪血症等。本文给出了本公开内容的这些特征和其它特征。附图简述
图1显示了人胎儿肌肉中血管细胞的免疫组织化学描述、FACS分析和分选。图 I(A)的比例尺为50 μ M。图2显示了从人胎儿肌肉中分选出的细胞在脂肪形成条件下的培养物，以及 CD34+细胞的RT-PCR和Western印迹分析。图2 (A)、(B)、(C)相差图；比例尺50 μ Μ。图3显示了人胎儿肌肉⑶34+细胞中线粒体呼吸作用的解偶联和对UCPlmRNA表 达的控制。图4显示了成人肌肉和WAT细胞在脂肪形成培养条件下的表征。图4(A)、(C)相 差图；比例尺50μΜ。图5显示了罗格列酮对人骨骼肌中UCPlmRNA表达的作用。多个实施方案的描述本公开内容提供了用于在多种组织中鉴定和分离BAT祖细胞的方法，在一些实施 方案中，其包括鉴定人骨骼肌中的普通褐色脂肪细胞祖细胞，并从人骨骼肌样品中分离该 细胞。在一些实施方案中，可通过对细胞表面标记的免疫组织化学分析来对细胞进行分选， 如分化/命名抗原簇(“⑶”)分子⑶34、⑶45、⑶56和⑶146。造血细胞和成肌祖细胞 (myogenic progenitor)可分别基于其细胞表面的CD45和CD56的鉴定来分选。CD34和 ⑶146可分别用于鉴定内皮细胞和周细胞。在一个方面中，⑶34的表达标志着细胞是褐色 脂肪细胞的祖细胞。流式细胞术、荧光激活细胞分选(“FACS”)和其它本领域已知的细胞分选技术可 用于分选从多种组织中获得的细胞，并用于将BAT细胞与其它细胞分开。包括其它本领域 已知的技术，多色FACS可用于鉴定⑶34+内皮细胞和⑶146+周细胞，并将它们彼此分开，并与CD45+造血祖细胞和CD56+的成肌祖细胞分开。逆转录酶聚合酶链式反应(“RT-PCR”) 分析可用于证实在⑶34+和⑶146+细胞类群中无造血祖细胞和成肌祖细胞。申请人:发现在骨骼肌中存在祖细胞类群，并且在一些实施方案中，该类群可见于 骨骼肌中，而不可见于白色脂肪组织中，并且在一些实施方案中，其只可见于骨骼肌中(即 不可见于其它组织中)。骨骼肌可为人或任何动物的骨骼肌，并且祖细胞类群可散布在骨骼 肌中或集中在离散的区域中。在一些实施方案中，BAT祖细胞可见于肌纤维之间。骨骼肌 BAT祖细胞可为固定不动的类群，或可在骨骼肌或其它组织中以及不同组织之间移动。此 外，BAT祖细胞可见于胎儿、幼龄和成体骨骼肌中。本教导内容提供了分离自多种组织的BAT祖细胞。例如，提供了分离自人骨骼肌 的BAT祖细胞。在一些实施方案中，BAT祖细胞可见于骨骼肌中，而不可见于白色脂肪组织 中，和/或仅可见于骨骼肌中。一些BAT祖细胞可表达UCP1、线粒体转录因子A(mtTFA)和 /或PPAR γ共激活子1 α (PGC-1 α )，以及一种或多种相应的mRNA。本公开内容提供了在成 人骨骼肌中检测BAT祖细胞和/或UCPlmRNA的方法。关于成人UCPl表达的现有研究着眼 于白色脂肪组织，而申请人公开了褐色脂肪祖细胞在人骨骼肌中的存在和分离，其有表达 UCPl的高潜能。在一些实施方案中，BAT祖细胞在骨骼肌中的贮存可提供调节能量消耗以 用于治疗代谢性疾病(如肥胖症、糖尿病等)的机制。至少，在骨骼肌中存在的一部分祖细胞类群能够分化为真正的褐色脂肪细胞，并 且在一些实施方案中，在骨骼肌中存在的一部分祖细胞类群能够在体外分化为真正的褐色 脂肪细胞。本公开内容提供了扩增BAT祖细胞培养物的方法，以及将BAT祖细胞分化为真 正的BAT细胞的方法，其包括在脂肪形成培养基中分化之前分选之细胞的方法。在一些实 施方案中，可通过使用维持白色脂肪细胞分化的条件或者通过使用已确定可促进祖细胞分 化为褐色脂肪细胞的药剂，而将分选的祖细胞分化为褐色脂肪细胞。一些实施方案利用了 UCP1、线粒体转录因子A(mtTFA)，和/或PPARy共激活 子-1 α (PGC-1 α )及一种或多种相应的mRNA，来鉴定已开始至少部分分化的BAT祖细胞。 可使用以下来鉴定已开始至少部分分化的BAT祖细胞高代谢率或高水平的解偶联呼吸作 用、葡萄糖利用、脂肪酸氧化或上述特征彼此的组合或与其他特征的组合。就本公开内容而 言，已开始至少部分分化成褐色脂肪细胞的BAT祖细胞被称为“已分化褐色脂肪细胞”。作为一个实例，已确定为表达⑶34标记的细胞(即⑶34+细胞)可在通过在以下 培养基中培养而分化为褐色脂肪细胞，所述培养基为含0. 86 μ M胰岛素、10 μ g/ml转铁蛋 白、0. 2nM三碘甲腺原氨酸、1 μ M罗格列酮、100 μ M 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1 μ M地塞米 松和青霉素-链霉素的DMEM-Ham' s F-12培养基。还可用其它药剂促进祖细胞分化 为褐色脂肪细胞。在一些实施方案中，可使用根据本公开内容的教导而鉴定的药剂促进祖 细胞分化为褐色脂肪细胞。在一些实施方案中，已分化褐色脂肪细胞表现出高水平的UCPl 表达、高水平的解偶联呼吸作用和/或高代谢率。本公开内容提供了在BAT祖细胞、已分化褐色脂肪细胞或这两者中提高UCPlmRNA 表达的方法。例如，诸如细胞透过性cAMP衍生物和过氧化物酶体增殖剂激活受体 Y (PPARy)激动剂的药剂可用于提高BAT祖细胞、已分化褐色脂肪细胞或上述两者中 UCPlmRNA表达。UCPl表达的提高可通过本领域已知的方法确定，包括通过定量RT-PCR测 定UCPlmRNA。用于UCPlmRNA的RT-PCR分析的示例性引物在SEQID NOS :1_4和11-12中提供。与不接触脂肪形成培养基的BAT祖细胞相比，接触脂肪形成培养基的BAT祖细胞 可含有更高水平的UCPlmRNA。亲环素的mRNA水平可作为评价细胞中UCPlmRNA丰度的归一 化数值(反映细胞数或RNA总量)。在一些实施方案中，不接触脂肪形成培养基的BAT祖细 胞中的UCPlmRNA水平无法用RT-PCR检测到，而已分化褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平则 可以检测到，并可根据亲环素mRNA的水平进行归一化。作为UCPl表达的比较测量，已分化 褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平可与培养的小鼠褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平相当。 本公开内容提供的已分化褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平约为培养的小鼠褐色脂肪细胞 中UCPlmRNA水平的25%。而在另一些实施方案中，UCPlmRNA水平约为培养的小鼠褐色脂 肪细胞中UCPlmRNA水平的25士 10%，或约15%至约30%。本公开内容所涉及的已分化褐 色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平为培养的小鼠褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平的约5%至 约100%。在一些实施方案中，UCPlmRNA水平可超过培养的小鼠褐色脂肪细胞中UCPlmRNA 水平的100%。与同一物种或同一成体个体的骨骼肌活检中的细胞相比，已分化褐色脂肪细胞可 含显著更高水平的UCPlmRNA。此外，已分化褐色脂肪组织中UCPl蛋白的量可与同一物种或 同一胎儿个体的BAT中UCPl蛋白的量大致相同。本公开内容所涉及的人已分化褐色脂肪 细胞的UCPlmRNA水平与人体内褐色脂肪细胞的UCPlmRNA水平大致相同。在一些实施方案 中，人已分化褐色脂肪细胞的UCPlmRNA水平可为人体内褐色脂肪细胞的UCPlmRNA水平的 约到高于后者很多倍。本公开内容提供了用于提高BAT祖细胞、已分化褐色脂肪细胞或上述两者中的 UCPlmRNA的方法。在一些实施方案中，提供了用于选择性提高BAT祖细胞、已分化褐色脂 肪细胞或上述两者中的UCPlmRNA的方法。PPARy激动剂可在骨骼肌和已分化褐色脂肪细 胞中刺激UCPImRNA的生成。例如，在一些实施方案中，PPAR γ激动剂罗格列酮在骨骼肌或 已分化褐色脂肪细胞中刺激UCPlmRNA的生成。细胞透过性cAMP衍生物可在骨骼肌和已分 化褐色脂肪细胞中刺激UCPlmRNA的生成。例如，在一些实施方案中，细胞透过性cAMP衍生 物8-溴代-cAMP在骨骼肌或已分化褐色脂肪细胞中选择性刺激UCPlmRNA的生成，而在另 一些实施方案中，cAMP衍生物(4-氯代苯基硫)-cAMP在骨骼肌或已分化褐色脂肪细胞中 选择性刺激UCPlmRNA的生成。线粒体转录因子A(mtTFA)和过氧化物酶体增殖剂激活受体Y共激活剂 1 α ( “PGC-I α ”)参与了线粒体发生的控制。已分化褐色脂肪细胞与未分化的BAT祖细胞 相比，可含有大量的mtTFA、PGC-I α或上述两者。本公开内容提供了与未分化的BAT祖细 胞相比，含更高水平的mtTFAmRNA、PGC-I α mRNA或上述两者的已分化褐色脂肪细胞。线粒 体标志物细胞色素氧化酶IV(C0X IV)参与了线粒体的呼吸链。本公开内容提供了与未分 化的BAT祖细胞相比，含显著提高水平的COX IV mRNA的已分化褐色脂肪细胞。根据一些实施方案，已分化褐色脂肪细胞有高水平的解偶联呼吸作用和/或高代 谢率。当质子通过线粒体内膜泄露，而不是通过三磷酸腺苷合酶(“ATP合酶”)驱动三磷 酸腺苷(“ATP”)的合成时，发生解偶联呼吸作用。质子在电化学质子梯度下的跨膜运动所 释放的能量作为热量消耗，而不是消耗在生成ATP的过程中。解偶联呼吸作用可作为不依 赖于ATP形成(通过ATP合酶)而发生的细胞呼吸作用(例如，氧消耗)的比例的函数来衡量。例如，在寡霉素(阻断ATP合酶的功能)存在下氧化磷酸化电子转移链中的氧消耗 为解偶联呼吸作用提供了一种度量。本公开内容提供了与未分化的BAT祖细胞相比，解偶联呼吸作用水平显著升高的 已分化褐色脂肪细胞。在一些实施方案中，本公开内容提供了解偶联呼吸作用水平为总呼 吸作用的约50%的未分化褐色细胞。一些实施方案显示的解偶联呼吸作用水平为总呼吸作 用的约20%至约50%。以成体白色脂肪细胞中解偶联呼吸作用的水平作为比较标准，一些 实施方案显示的解偶联呼吸作用为成体白色脂肪细胞的约1. 5至约3. 5倍。在一些实施方 案中，解偶联呼吸作用水平为成体白色脂肪细胞的约2. 5倍。本公开内容还提供了可通过 氧化磷酸化的解偶联进行葡萄糖代谢、脂肪酸氧化并以热量消耗能量的已分化褐色脂肪细 胞。本公开内容提供了在体外和体内可促进BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞的条件 和药剂(例如，化合物、蛋白质、生物制品等)。在一些实施方案中，分化促进剂为PPARY激 活剂、调节剂或抑制剂(例如罗格列酮)，PPAR α激活剂或调节剂(例如，GW9578)，PPAR δ 激活剂或调节剂(例如GW501516或GW0742)，PPARa和PPAR δ双激活剂或调节剂，泛 PPAR (α、δ、γ )激活剂或调节剂(例如，GW4148)，PDE4抑制剂(例如咯利普兰或ΙΒΜΧ)， PDE7 抑制剂(如 BMS 586353 或 BRL 50481 或 ΙΒΜΧ)，NRIPl (RIP140)抑制剂、PTEN 抑制剂 (例如双过氧化钟(双批淀)氧書凡酸盐(potassium bisperoxo (bipyridine) oxovanadate) 或双过氧化二钾(5-羟基吡啶-2-羧基)氧钒酸盐(dipotassium bisperoxo (5-hydroxy pyridine-2-carboxyl) oxovanadate)), α 1-肾上腺素能完全或部分激动剂(如苯福林或 西拉唑啉)，RXRa激活剂或调节剂(例如LGD 1069(塔革雷汀(Targretin))或9-顺式 视黄酸)，PGC_la激活剂；PGC-Ιβ抑制剂或激活剂，脂联素或脂联素受体AdipoRl和/或 AdipoR2激活剂，NOS抑制剂或激活剂(如2-乙基-2-异硫脲或NG-硝基-L-精氨酸甲基 酯(L-NAME)或腺苷)，Rho激酶-ROCK抑制剂(例如，法舒地尔)，BDNF,单胺氧化酶(MAO) A抑制剂和/或MAO B抑制剂(例如，异卡波胼、吗氯贝胺、司来吉兰)，SRC激活剂，EGFR 抑制剂(例如，埃罗替尼(erlotinib)或ZD1839-吉非替尼(gefinitib)或Argos蛋白)， FAAH 抑制剂(如，URB597)，MAPK 1 (如，PD98059)或 2 (如 PD98059)或4或5 或7 或8(如， PD98059)的抑制剂，CDK9抑制剂(如，1，5，6，7-四氢-2-(4-吡啶基)-4H-吡咯并[3，2_c] 吡啶-4-酮盐酸盐)，TGR5激动剂(如，齐墩果酸)，AMPK激活剂(如，AICAR)，BMP-7，mTOR 抑制剂(如，雷帕霉素)，腺苷酸环化酶激活剂(例如，毛喉素)，或上述任何药剂的组合。在一些实施方案中，用罗格列酮治疗受试者(包括人受试者)导致该受试者骨骼 肌中UCPlmRNA生成提高。在一些实施方案中，用罗格列酮治疗个体可在骨骼肌中诱导褐色 脂肪细胞的出现或分化，提高UCPl基因在骨骼肌中已有褐色脂肪细胞中的表达，或上述两 者。例如，在一些实施方案中，可在患代谢疾病的受试者中诱导骨骼肌中褐色脂肪细胞的出 现或分化。褐色脂肪细胞可提供葡萄糖消耗器，其具有高的线粒体和细胞呼吸作用以及脂 肪酸氧化速率，并以热能消耗能量(解偶联氧化磷酸化)。受试者的代谢速率可被提高，并 且可诱导体重减轻。诱导褐色脂肪细胞的出现或分化还可改善胰岛素敏感性、血糖的内稳 态以及心血管疾病风险因素。本公开内容还提供了可鉴定药剂(例如，化合物、蛋白质、生物制品等)的测定法， 所述药剂可在体外、体内或这两种情况下促使BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞和/或诱导UCPl基因的表达。该药剂可通过筛选化合物、蛋白质、生物制品等来鉴定。例如，在一些实 施方案中，分离的CD34+细胞可用于根据诱导UCPl基因表达和/或使CD34+细胞分化为褐 色脂肪细胞的能力来筛选药剂。以这种方式鉴定的药剂可用于多种研究、诊断和治疗目的， 例如包括治疗代谢疾病，如肥胖症、2型糖尿病、胰岛素抗性、异常脂肪血症等。在一些实施 方案中，可优化通过本公开内容的测定法鉴定的药剂以提高其物理化学和/或药代动力学 特性。可按照在本公开内容中提供的方法在体外和体内增强BAT祖细胞中UCPl、mtTFA、 PGC-I α和/或COX IV的表达。在一些实施方案中，可通过接触脂肪形成培养基来刺激BAT 祖细胞中UCPl、mtTFA、PGC-Ia和/或COX IV的表达增加。可用如以下的药剂刺激BAT 祖细胞中UCPl、mtTFA、PGC-I α和/或COX IV的表达的增加PPAR γ激活剂、调节剂或抑 制剂(例如罗格列酮)，PPARa激活剂或调节剂(例如，GW9578)，PPAR δ激活剂或调节剂 (例如GW501516或GW0742)，PPAR α和PPAR δ双激活剂或调节剂，泛PPAR (α、δ、γ )激 活剂或调节剂(例如，GW4148)，PDE4抑制剂(例如咯利普兰或IBMX)，PDE7抑制剂(如BMS 586353或BRL 50481或IBMX)，NRIPl (RIP140)抑制剂、PTEN抑制剂(例如双过氧化钾(双 吡啶)氧钒酸盐或双过氧化二钾(5-羟基吡啶-2-羧基)氧钒酸盐)，Ci1-肾上腺素能完 全或部分激动剂(如苯福林或西拉唑啉)，RXRa激活剂或调节剂(例如LGD 1069(塔革 雷汀)或9-顺式视黄酸)，PGC-I α激活剂；PGC-I β抑制剂或激活剂，脂联素或脂联素受 体AdipoRl和/或AdipoR2激活剂，NOS抑制剂或激活剂(如2-乙基-2-异硫脲或NG-硝 基-L-精氨酸甲基酯(L-NAME)或腺苷)，诎0激酶-ROCK抑制剂(例如，法舒地尔)，BDNF， 单胺氧化酶(MAO) A抑制剂和/或MAO B抑制剂(例如，异卡波胼、吗氯贝胺、司来吉兰)， SRC激活剂，EGFR抑制剂(例如，埃罗替尼或ZD1839-吉非替尼或Argos蛋白)，FAAH抑制剂 (如，URB597)，MAPK 1 (如，PD98059)或 2 (如 PD98059)或4 或5 或 7 或8(如，PD98059)抑 制剂，CDK9抑制剂(如，1，5，6，7-四氢-2-(4-吡啶基)-4H-吡咯并[3,2-c]吡啶_4_酮盐 酸盐)，TGR5激动剂(如，齐墩果酸)，AMPK激活剂(如，AICAR)，BMP-7，mTOR抑制剂(如， 雷帕霉素)，腺苷酸环化酶激活剂(例如，毛喉素)，或上述任何药剂的组合。
实施例本教导内容的方面可在以下实施例的帮助下得到更好的理解，不应将所述实施例 看作在任何形式上对本教导内容范围的限制。实施例1 分选和分化肌肉血管细胞通过免疫组织化学，发现在胎儿骨骼肌中⑶34和⑶146分别在内皮细胞和周细胞 表面表达，但CD34也在分散在肌原纤维间的细胞中表达。图I(A)显示了小血管的纵切面， 其中CD146+周细胞(绿色)环绕着CD34+内皮细胞(红色)。在成体骨骼肌中也观察到类 似的⑶34+和⑶146+细胞的分布。用多色荧光激活细胞分选(FACS)对来自7份独立的胎儿肌肉(怀孕1614周)的 血管细胞进行了分选。首先对造血(⑶45+)细胞设置门控，还有成肌祖细胞(⑶56+)。而后 分选出内皮细胞(CD34+/CD146-)和周细胞(CD34-/CD146+)。此后将 CD34+/CD146-/CD45-/ CD56-指定为 CD34+ 细胞，将 CD34-/CD146+/CD45-/CD56-指定为 CD146+ 细胞。图 1 (B)显 示了⑶34+/⑶146-和⑶34-/⑶146+细胞的纯化。将分离的细胞用PE-抗⑶34、FITC-抗CD146、PE-Cy7-抗CD56和APC-Cy7-抗CD45抗体染色，并在FACS Aria细胞分选仪上运行。 在排除⑶45+和⑶56+细胞(左图)后，分离在⑶34+或⑶146+门控之内的细胞。⑶34+ 细胞占初始胎儿肌细胞群的8 士 1 %。图 I(C)显示 了 CD34+/CD146-/CD45-/CD56-(CD34)、CD34-/CD146+/CD45-/ ⑶56-(⑶146)以及未分选的总细胞的RT-PCR分析。测量了肌动蛋白的mRNA作为对照。结 果显示⑶34+细胞未被可检测到的⑶45+造血细胞或⑶56+肌原细胞污染。将分选的细胞在EGM2培养基中培养4_6天，并在材料与方法部分表述的脂肪生成 培养基中培养8-12天。这些条件在WAT原代培养中维持了白色脂肪细胞的分化。图2显 示了原代培养物(PC)的CDiM+(图2(A))和CD146+(图2(B)，图2(C))细胞，以及扩增多至 3代(P； )的CD34+(图2(D))细胞。基本上所有分选的胎儿肌肉CD34+细胞都分化为脂肪 细胞样的多室(multilocular)细胞(图2 (A)、2 (D))。值得注意的是，在细胞培养物中，多 室结构是白色和褐色脂肪细胞共有的。与之相反，胎儿肌肉CD146+细胞在上述条件下生长 非常缓慢。它们未达到细胞汇合并且表现出周细胞样外观，其特征为尺寸大，形状伸展并且 边界不规则(图2(B)和(C))。可偶尔检测到多室细胞(图2(C))。在上述条件下在培养 物中扩增3代0周)的CD34+细胞的形态与在原代培养物中观察到的类似，尽管成熟脂肪 细胞更小(图2(D))。实施例2 培养的⑶34+细胞中UCPl的表达胎儿肌肉CD34+细胞的显著脂肪细胞样分化促使我们对其进行进一步表征。惊人 的是，定量RT-PCR显示在这些细胞中有高水平的UCPlmRNA。图2 (E)显示了原代培养或扩 增3代(P3)的⑶34+细胞中UCPl (空心柱)和瘦素(灰色柱)mRNA表达的定量RT-PCR测 定。用亲环素A归一化的平均UCPlmRNA水平为1797士510主观单位(即用对应的亲环素 A的值标准化的的主观值士标准误；η = 4-7)，在此测定中对应于25ng cDNA的循环阈值 (Ct)为 22。相比之下，在培养物中分化的小鼠褐色脂肪细胞的平均UCPlmRNA水平(用亲环素 A归一化化)为7715±^49(n= 10)主观单位。因此，人⑶34+细胞中的UCPlmRNA水平 达到了培养的小鼠褐色脂肪细胞的近四分之一。由于妊娠终止后经过的时间造成RNA降解 的风险很高，所以未以人胎儿BAT作为定量RT-PCR分析的阳性对照。克隆扩增子并测序， 发现其与人UCP1100%相同。在培养多至3代的胎儿肌肉CD34+细胞中，仍观察到了高的 UCPlmRNA表达，为原代培养细胞中检测到的43%。在未分化的胎儿肌肉CD34+细胞或原代 培养的CD146+细胞中未检测到UCPlmRNA的表达。在原代培养和扩增的细胞中瘦素mRNA 的水平分别为9. 9 士 5. 5和71 士 52主观单位(图2E)。实施例3 ⑶34+的其他表型为了更好地表征在培养物中扩增的胎儿肌肉CD34+细胞的基因表达模式，进行了 基因芯片分析。在表1中显示了有显著检测P值(P <0.01)的若干代表性基因的mRNA 表达水平，并与人肌肉活检中的进行比较。选择了以下蛋白的mRNA :UCP1作为参考基因， 参与热产生和线粒体发生的控制的线粒体转录因子A(mtTFA)以及过氧化物酶体增殖剂 激活受体(PPAR Y )和PPAR γ共激活子1 α (PGC-1 α )，线粒体呼吸链的酶琥珀酸脱氢酶 (SDH)和细胞色素氧化酶IV(COXIV)，脂肪酸降解途径的酶，肉碱棕榈酰转移酶IB(CPTlB)， 长链(ACAD)和C-4至C-12直链(ACADM)的酰基辅酶A脱氢酶，以及骨骼肌标志物成肌素(myogenin)、生肌因子5(Myf5)和生肌分化因子1 (MyoDl)。将在BAT中高表达并可能为 UCPl活性抑制剂的Cidea[16]作为BAT标志物。这些基因的Genbank登记号在补充数据中显不。表 权利要求
1.一种用于鉴定细胞群体中的BAT祖细胞的方法，其包括 提供至少两个细胞；使所述至少两个细胞与抗体接触，其中所述抗体对与内皮细胞相关而不与造血细胞、 成肌细胞或周细胞相关的标志物具有特异性，并且 确定与所述抗体结合的细胞； 其中将与该抗体结合的细胞鉴定为BAT祖细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述抗体对CD34具有特异性。
3.权利要求1的方法，其中所述接触步骤还包括，在将所述细胞与对内皮细胞相关标 志物具有特异性的抗体接触前将所述细胞与抗体接触，所述抗体对与造血细胞、成肌细胞和周细胞中至少之一相关 的标志物具有特异性；并且去除与所述抗体结合的细胞，所述抗体对与造血细胞、成肌细胞和周细胞中至少之一 相关的标志物具有特异性。
4.权利要求1的方法，其还包括分离被鉴定为BAT祖细胞的细胞。
5.用于诱导BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞的方法，其包括 提供BAT祖细胞；并且使所述BAT祖细胞接触分化培养基；其中所述分化培养基诱导BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞。
6.权利要求4的方法，其中分化培养基包含以下一种或多种=PPARy激活剂、调节剂或 抑制剂；PPAR α激活剂或调节剂；PPAR δ激活剂或调节剂；PPAR α和PPAR δ双激活剂或调 节剂；泛PPAR(a、δ、γ)激活剂或调节剂；PDE4抑制剂；PDE7抑制剂；NRIPl (RIP140)抑制 剂；PTEN抑制剂；a r肾上腺素能完全或部分激动剂；RXR α激活剂或调节剂；PGC-1 α激 活剂；PGC-I β抑制剂或激活剂；脂联素或者脂联素受体AdipoIU和/或AdipoR2激活剂； NOS抑制剂或激活剂；Mio激酶-ROCK抑制剂；BDNF ；单胺氧化酶(MAO) A抑制剂和/或MAO B抑制剂；SRC激活剂；EGFR抑制剂；FAAH激活剂；MAPK 1或2或4或5或7或8的抑制剂； ⑶K9抑制剂；TGR5激动剂；AMPK激活剂；BMP-7 ；mTOR抑制剂；腺苷酸环化酶激活剂；或上 述的任何组合。
7.权利要求4的方法，其中所述分化培养基包含罗格列酮。
8.用于治疗患者中代谢疾病或病症的方法，其包括在该患者中诱导BAT祖细胞分化为 褐色脂肪细胞。
9.权利要求8的方法，其中所述代谢疾病为以下之一肥胖症、超重、葡萄糖耐量受损、 胰岛素抗性、2型糖尿病、异常脂肪血症、高血压、心血管疾病或代谢综合征。
10.用于鉴定诱导BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞之药剂的方法，其包括 提供BAT祖细胞；使所述BAT祖细胞与药剂接触；确定所述BAT祖细胞是否显示出分化成褐色脂肪细胞的指标。
11.权利要求10的方法，其中分化的指标为以下一种或多种的提高UCP1蛋白或mRNA 的表达、mtTFA蛋白或mRNA的表达、PGC-I α蛋白或mRNA的表达、解偶联呼吸作用、代谢率、 葡萄糖利用速率、脂肪酸氧化速率，以及任何以上的组合。
12.用于鉴定诱导UCPl表达或活性水平之药剂的方法，其包括 提供BAT祖细胞；使所述BAT祖细胞与药剂接触；确定所述BAT祖细胞是否显示出UCPl表达或活性的提高。
13.权利要求12的方法，其中所述UCPl表达或活性的提高是由于以下一种或多种提 高UCP1基因的转录、使UCPImRNA稳定、提高UCPImRNA的翻译、使UCP1蛋白稳定、活化UCP1 蛋白、降低对UCPl基因表达的抑制、降低对UCPl活性的抑制。
14.用权利要求10的方法或权利要求12的方法鉴定的药剂用于制造治疗患者代谢疾 病之药物的用途。
15.权利要求12的方法，其中所述代谢疾病为以下之一肥胖症、超重、葡萄糖耐量受 损、胰岛素抗性、2型糖尿病、异常脂肪血症、高血压、心血管疾病或代谢综合征。
16.用权利要求10的方法或权利要求12的方法鉴定的药剂用于制造预防体温过低之 药物的用途。
全文摘要
本发明涉及褐色脂肪组织(“BAT”)祖细胞以及用于在给定的细胞群中鉴定BAT祖细胞的方法。本发明还提供了用于以下的方法诱导BAT祖细胞分化成已分化褐色脂肪细胞、诱导BAT解偶联蛋白1(“UCP1”)表达或提高其活性水平，以及鉴定能诱导BAT祖细胞分化为褐色脂肪细胞和/或诱导UCP1表达或提高其活性水平之药剂的方法。已分化的褐色脂肪细胞以及诱导BAT祖细胞分化的药剂和方法可用于治疗患者的代谢疾病或病症(如肥胖症、超重、葡萄糖耐量受损、胰岛素抗性、2型糖尿病、异常脂肪血症、高血压、心血管疾病、代谢综合征等)，或用于制造治疗上述疾病的药物。已分化的褐色脂肪细胞以及诱导BAT祖细胞分化的药剂和方法可用于预防体温过低。
文档编号C12N5/077GK102105789SQ200980129427
公开日2011年6月22日 申请日期2009年5月27日 优先权日2008年5月27日
发明者奥列弗·D·博斯, 让-保罗·贾科比诺 申请人:奥列弗·D·博斯, 让-保罗·贾科比诺