利用细胞治疗心脏组织的组合物和方法

专利名称：利用细胞治疗心脏组织的组合物和方法
利用细胞治疗心脏组织的组合物和方法相关申请交叉引用本申请要求于2008年5月27日提交的国际申请PCT/US2008/064895的优先权权 本发明涉及用于获得和使用心脏细胞的方法和材料。例如，本发明涉及用于向哺 乳动物心脏组织提供可作为功能性心肌细胞导入心脏组织的细胞(例如分化心肌祖细胞 (cardioprogenitor cell)或心脏修复细胞(cardiopoietic cell))的方法和材料。
背景技术：
尽管病人处理不断进步，心血管疾病还是世界范围内发病和死亡的主要因素。与 具有高度修复能力的组织相比，心脏组织容易受到无法修复的损伤。因此在临床环境中一 直在寻求基于细胞的再生心血管药物。最近出现的干细胞生物学将现有的实践模式的范围由传统的缓解扩展至治愈性 修复。通常而言，临床经验基于由自体来源收集并以未改变的状态进行输送的成体干细胞。 第一代生物制剂是天然人体干细胞，被认为是易得的细胞类型。已显示出经输送天然人体 干细胞使得特定患者得以改善。

发明内容
定义在本说明书的框架范围内，除非有相反指示，以下引号内的术语的定义如下。术语‘hMSCs，指人间充质干细胞。细胞的‘心生成潜力’是指该细胞在注入受损心脏后能成功产生心脏细胞例如心 肌的能力。‘心脏修复细胞’ (CP)是指处于由未分化细胞分化的途径中的细胞。“心脏修复细 胞”表现出由早期心转录因子Nkx2. 5和晚期心转录因子MEF2C的核转位所确定的心分化 (Behfar ^,Derivation ofa cardiopoietic population from human mesenchymal stem yields progeny, Nature Clinical Practice, Cardiovascular Medicine, March 2006 vol. 3 supplement l,pagesS78-S82) 能观察到心转录因子GATA4的核转位。心脏修复细 胞可缺少肌节并缺少肌节蛋白的表达。心脏修复细胞保留自身分裂的能力。因为心脏修复 细胞可以分化为心肌细胞，所以也称为“心肌细胞前体”或“心肌细胞祖细胞”。在本文的内 容中，心脏修复细胞可来源于人成体间充质干细胞(hMSC)。‘CP-hMSCs’则指那些来源于人 成体间充质干细胞的心脏修复细胞。‘鸡尾酒式混合物’或‘心源性鸡尾酒式混合物’指含有至少两种心源性物质的组 合物。‘心源性物质’是改善细胞的心生成潜力的物质。
‘鸡尾酒式混合物-引导细胞’或‘引导心脏修复的细胞’是已经与鸡尾酒式混合 物相接触并进而进入分化的细胞。‘分化’是较少特化细胞变为更加特化细胞的过程。‘射血分数’意指在一次心跳中泵出的血液的分数。未限定时，术语射血分数专指 左心室的射血分数(左心室射血分数或LVEF)。‘射血分数变化’指在指定时间后测量的经注射细胞至其梗塞心脏而治疗的动物 的心脏的射血分数与注射前测量的射血分数之间的差别。除非另外定义，本文中所使用的技术和科学术语均与本发明所属领域的普通技术 人员所通常理解的含义相同。虽然与本文所描述的方法和材料相似或者等价的方法和材料 也能用于实现本发明，但适宜的方法和材料如下所述。本文中提到的公报、专利申请、专利 和其他参考文献均以参考的方式整体引入。在矛盾的情况下，以本发明说明书包括定义为 准。此外，所述材料、方法和实例仅是描述性的，而不具有限制性。本发明涉及包含TGF β-1、ΒΜΡ4、α-凝血酶、选自心营养素(Cardiotrophin)和 IL-6的化合物、以及选自Cardiogenol C和视黄酸的化合物的组合物。在优选实施方式中， 本发明的组合物包含TGFii -1、ΒΜΡ4、α -凝血酶、心营养素和Cardiogenol C。本发明的组 合物可以包含选自 FGF-2、IGF-1、活化素-A (Activin-A)、TNF-α、FGF-4、LIF、VEGF-A 及其 组合的至少一种化合物。本发明的组合物还可以包含FGF-2、IGF-I和活化素-Α。本发明 的其他优选组合物包含活化素_A、FGF-2、IL-6、IGF-I和视黄酸。根据替代性实施方式，本 发明的组合物可以不包括选自TNF- α、FGF-4、LIF和VEGF-A的至少一种化合物。当在本发明的组合物中存在以下化合物中的一种时，其存在量如下所述 TGF^-I以lng/ml至5ng/ml的量存在，所述BMP4以lng/ml至10ng/ml的量存在，所述心 营养素以0. 5ng/ml至5ng/ml的量存在，所述α -凝血酶以0. 5单位/ml至5单位/ml的 量存在，所述Cardiogenol C以50nM至500nM的量存在，所述FGF-2以lng/ml至10ng/ml 的量存在，所述IGF-I以lOng/ml至lOOng/ml的量存在，所述活化素-A以lng/ml至50ng/ ml的量存在，所述TNF- α以lng/ml至50ng/ml的量存在，所述FGF-4以lng/ml至20ng/ml 的量存在，所述IL-6以lOng/ml至lOOng/ml的量存在，所述LIF以1单位/ml至10单位 /ml的量存在，所述VEGF-A以lng/ml至50ng/ml的量存在，所述视黄酸以每ml中0. 1 μ M 至Ι.ΟμΜ的量存在。本发明的优选组合物包含以组合方式使用的重组TGFii-I (2. 5ng/ml)、BMP4(5ng/ ml)、心营养素(lng/ml)、Cardiogenol C(K)Oy Μ)。本发明特别优选的组合物包含所述化 合物，并还包含 α -凝血酶(lU/ml)、FGF-2 (10ng/ml)、IGF-I (50ng/ml)和活化素 _A(5ng/ ml) ο本发明的其他优选组合物包含以组合方式使用的重组TGF β -1 0. 5ηg/m 1)、 BMP4(5ng/ml)、活化素 _A(5ng/ml)、FGF_2 (10ng/ml)、IL-6 (100ng/ml)、因子 IIa (h α -凝血 酶、lU/ml)、IGF-I (50ng/ml)和视黄酸(1 μ Μ)。优选的是，本发明的组合物包含在培养基中，所述培养基选自含有胎牛血清、人血 清、血小板裂解物及其混合物的培养基。本发明还涉及一种由最初的细胞获得分化细胞的方法，所述分化细胞以提高水 平表达选自 MEF2c mRNA、MESP-ImRNA, Tbx-5mRNA, GATA4mRNA、Flk-lmRNA、GATA6mRNA、Fog-ImRNA及其组合的至少一种mRNA，和/或具有选自Nkx2. 5多肽、MEF2C多肽、Tbx-5多 肽、F0G-2多肽、GATA-4多肽、MESP-I多肽及其组合的至少一种多肽，其中所述至少一种多 肽与所述分化细胞的细胞核相关，其中所述方法包括在本发明的组合物的存在下培养初始 细胞。在所述方法中，所述分化细胞优选表达提高水平的MEF2c mRNA和MESP-ImRNA。在本发明的优选实施方式中，所述初始细胞是间充质干细胞。这些细胞是骨髓来 源的干细胞。它们能在细胞表面表达⑶90、⑶105、⑶133、⑶166丄拟9和⑶44，并且在细胞 表面不表达CD14、CD34和CD45。最优选的是，所述分化细胞是心脏修复细胞。本发明另一方面是将分化细胞输送至哺乳动物的方法，其中所述方法包括(a)确定分化细胞群的细胞样品包含这样的细胞该细胞以提高水平表达选自 MEF2c mRNA、MESP-I mRNA,Tbx-5 mRNA、GATA4 mRNA,Flk-I mRNA、GATA6 mRNA、Fog-I mRNA 及其组合的至少一种mRNA，和/或具有选自Nkx2. 5多肽、MEF2C多肽、Tbx-5多肽、MESP-I 多肽、GATA-4多肽、F0G-2多肽及其组合的至少一种多肽，其中所述多肽与所述分化细胞的 细胞核相关，和(b)向所述哺乳动物施用来自所述分化细胞群的细胞。可以由在本发明的任何一 种所述组合物的存在下培养的所述初始细胞获得所述分化细胞群。在具体实施方式
中，所 述步骤(a)可以包括采用逆转录聚合酶链式反应或采用免疫细胞化学反应。所述施用步骤 包括通过选自全身施用、心内施用和冠脉内施用的施用进行所述细胞的施用。本发明的另一个方面是向心脏组织提供心肌细胞的方法，其中所述方法包括向所 述心脏组织施用通过与本发明的组合物相接触而得到的所述分化细胞。本发明的一个或多个实施方式的细节在附图和以下描述中进行阐述。本发明的其 他特征、目的和优点通过说明书和权利要求书是显而易见的。
具体实施例方式本说明书提供了涉及心脏细胞(例如，分化心肌祖细胞)的方法和材料。例如， 本说明书提供了具有作为功能性心肌细胞导入心脏组织的能力的细胞，制造这种细胞的方 法，制造这种细胞的组合物，以及确定细胞群(例如分化心肌祖细胞)是否包含具有作为功 能性心肌细胞并入心脏组织的能力的细胞。本说明书还提供了向心脏组织(例如人心脏组 织)提供功能性心肌细胞的方法和材料。本文所提供的分化心肌祖细胞可来自于任何物种，包括但不限于人、猴、马、狗、 猫、大鼠或小鼠。例如，分化心肌祖细胞可以是哺乳动物(例如人)分化心肌祖细胞。在一些情况下，本文提供的分化心肌祖细胞具有作为功能性心肌细胞并入心脏组 织的能力。可以采用任何适宜的方法获得分化心肌祖细胞。例如，分化心肌祖细胞可来源于 干细胞，诸如哺乳动物(例如，人)干细胞。在一些情况下，分化心肌祖细胞可来源于胚胎干细胞。在一些情况下，分化心肌祖 细胞可来源于间充质干细胞。间充质干细胞可由任何来源获得。例如，间充质干细胞可由 哺乳动物(例如人)组织，如骨髓和骨小梁获得。间充质干细胞可以体外培养。例如，间充 质干细胞可以在体外增加数量。间充质干细胞可在细胞表面表达或者不表达多肽标记物。例如，间充质干细胞可在细胞表面表达⑶133、⑶90、⑶105、⑶166、⑶四和⑶44，并且可在 细胞表面不表达⑶14、⑶34和⑶45。可以采用任何合适的方法由干细胞(例如间充质干细胞)得到分化心肌祖细胞。 例如，可以通过将间充质干细胞与组合物(例如培养基)进行温育从而由所述间充质干细 胞得到分化心肌祖细胞。所述组合物可以是含有一种或多种因子的任何合适的组合物。所 述因子可以是任何类型的因子，如多肽、类固醇、荷尔蒙和小分子。这些因子的例子包括但 不限于TGF β、BMP、FGF-2、IGF-1、活化素-Α、心营养素、α -凝血酶和CardiogenolC。在一个实施方式中，可以采用含有TGFi3、BMP、心营养素、α-凝血酶和 Cardiogenol C的培养基由干细胞(例如间充质干细胞)得到分化心肌祖细胞。在这些情 况下，可以在使用含有TGF β、ΒΜΡ、心营养素、α -凝血酶和Cardiogenol C的培养基进行的 最初培养期(例如一天或两天)之后，在所述培养基中加入FGF-2、IGF-1、活化素-A或其 组合。TGF β可以是任何具有TGF β活性的多肽，诸如人TGF β。例如，TGF β可以是重 组TGFii或合成TGFii。在一个实施方式中，TGFii可以是TGFi3_l。可以使用任何适宜浓 度的TGF β。例如，可以使用lng/ml至10ng/ml的TGF-β (例如，约2. 5ng/ml的TGF β 1)。BMP可以是任何具有BMP活性的多肽，诸如人BMP。例如，BMP可以是重组BMP或 合成BMP。在一个实施方式中，BMP可以是BMP4。可以使用任何浓度的BMP。例如，可以使 用 lng/ml 至 20ng/ml 的 BMP (例如，约 5ng/ml 的 BMP4)。FGF-2可以是任何具有FGF-2活性的多肽，诸如人FGF-2。例如，FGF-2可以是重 组FGF-2或合成FGF-2。可以使用任何浓度的FGF-2。例如，可以使用lng/ml至20ng/ml 的 FGF-2 (例如，约 5ng/ml 的 FGF-2)。IGF-I可以是任何具有IGF-I活性的多肽，诸如人IGF-1。例如，IGF-1可以是重 组IGF-I或合成IGF-1。可以使用任何浓度的IGF-1。例如，可以使用lOng/ml至lOOng/ml 的 IGF-I (例如，约 50ng/ml 的 IGF-1)。活化素-A可以是任何具有活化素-A活性的多肽，诸如人活化素-A。例如，活化 素-A可以是重组活化素-A或合成活化素-A。可以使用任何浓度的活化素-A。例如，可以 使用lng/ml至50ng/ml的活化素-A (例如，约10ng/ml的活化素-A)。α -凝血酶可以是任何具有α -凝血酶活性的多肽，诸如人α -凝血酶。例如， α-凝血酶可以是重组α-凝血酶或合成α-凝血酶。可以使用任何浓度的α-凝血酶。 例如，可以使用0. 5单位/ml至10单位/ml的α -凝血酶(例如，约1单位/ml的α -凝 血酶)。心营养素可以是任何具有心营养素活性的多肽，诸如人心营养素-1。例如，心营养 素可以是重组心营养素或合成心营养素。可以使用任何浓度的心营养素。例如，可以使用 0. 5ng/ml至10ng/ml的心营养素(例如，约lng/ml的心营养素_1)。IL-6可以是任何具有IL-6活性的多肽，诸如人IL_6。例如，IL_6可以是重组IL_6 或合成IL-6。可以使用任何浓度的IL-6。例如，可以使用100ng/ml至200ng/ml的IL-6。可以使用任何浓度的Cardiogenol C或其可药用盐(例如盐酸Cardiogenol C)。 例如，可以使用 IOnM 至 IOOOnM 的 Cardiogenol C(例如，约 IOOnM 的 Cardiogenol C)。视黄酸可以是任何具有视黄酸活性分子，诸如合成视黄酸、天然视黄酸、维生素A代谢物、维生素A的天然衍生物或维生素A的合成衍生物。可以使用任何浓度的视黄酸。例 如，可以使用1 X ΙΟ— μ M至2 X 10_6 μ M的视黄酸。在一些情况下，可以使用补充有TGF^-I (例如，2. 5ng/ml)、BMP4 (例如，5ng/ml)、 FGF-2 (例如，5ng/ml)、IGF-I (例如，50ng/ml)、活化素-A (例如，10ng/ml)、心营养素(例 如，lng/ml)、α -凝血酶(例如，1单位/ml)和Cardiogenol C (例如，IOOnM)的含有血清 或不含有血清的培养基由干细胞(例如，间充质干细胞)得到分化心肌祖细胞。在一些情 况下，所述培养基(例如含有血清或不含有血清的培养基)可含有血小板裂解物(例如，人 血小板裂解物)。在一些情况下，用以由间充质干细胞获得分化心肌祖细胞的组合物可含有其他可 选的因子，诸如TNF- α、LIF和VEGF-A。TNF- α可以是任何具有TNF- α活性的多肽，诸如人TNF- α。例如，TNF- α可以 是重组TNF-α或合成TNF-α。可以使用任何浓度的TNF-α。例如，可以使用5ng/ml至 50ng/ml 的 TNF- α。LIF可以是任何具有LIF活性的多肽，诸如人LIF。例如，LIF可以是重组LIF或 合成LIF0可以使用任何浓度的LIF0例如，可以使用2. 5ng/ml至100ng/ml的LIF0VEGF-A可以是任何具有VEGF-A活性的多肽，诸如人VEGF-A。例如，VEGF-A可以 是重组VEGF-A或合成VEGF-A。可以使用任何浓度的VEGF-A。例如，可以使用5ng/ml至 200ng/ml 的 VEGF-A。本文提供的组合物可含有任意组合的因子。例如，本文提供的组合物可含有 TGF β -1、ΒΜΡ4、活化素-Α、心营养素、α -凝血酶和CardiogenolC。在一些情况下，本文提 供的组合物可含有TGF3 -1、BMP4、FGF-2、IGF-1、心营养素、α -凝血酶和Cardiogenol C。 在一些情况下，本文提供的组合物可含有TGFii -1、ΒΜΡ4、FGF-2、IGF-1、心营养素、α -凝 血酶和Cardiogenol C。在一些情况下，本文提供的组合物可不含有TNF-α、IL_6、LIF、 VEGF-A、视黄酸或其任何组合(例如，IL-6、LIF、VEGF-A和视黄酸；LIF、VEGF-A和视黄酸； 或 TNF- α、IL-6、LIF 禾口 VEGF-A)。本文提供的组合物可以采用任何适宜的方法进行制备。例如，可以使用商售因子 制备本文提供的组合物。在一些情况下，本文提供的组合物经制备可包含细胞裂解物(例 如血小板裂解物)或来自诸如心肌细胞或TNF-α刺激的内胚层细胞等细胞的条件培养基。 例如，可以使用补充有商售因子的血小板裂解物制备本文提供的组合物。在一些情况下，可 以使用分离自条件培养基的因子制备本发明提供的组合物。在一些情况下，所述因子可以 溶解于培养基，如含有血清或者不含有血清的细胞培养基。可以使用任何合适的方法将干细胞(例如，间充质干细胞)与本文提供的组合物 进行温育，从而得到具有作为功能性心肌细胞并入心脏组织的能力的分化心肌祖细胞。例 如，间充质干细胞可以与本文提供的组合物共同温育1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45 或 50 天。在一些情况下，本文所提 供的用以与间充质干细胞共同温育的组合物可以每天或者每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45 或 50 天更换。在一些情况下，可以在血清存在或不存在的情况下，将间充质干细胞与本文提供 的组合物一起温育。当将干细胞与本文提供的组合物进行温育时，可以采用任何适宜的细胞密度。例如，可以将约1000个至2000个间充质干细胞/cm2 (例如，约1500个至2000个 细胞/cm2)与本文提供的组合物共同温育，从而得到分化心肌祖细胞。一旦干细胞(例如，间充质干细胞)已经与本文提供的组合物一起温育或相反地 与分化因子一起温育，可以监测分化状态以确定所述干细胞是否分化为具有作为功能性心 肌细胞并入心脏组织的能力的分化心肌祖细胞。例如，可以收集细胞样品并采用诸如蛋白 印迹、荧光激活细胞分选(FACS)、免疫染色、激光共聚焦显微镜和逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)技术(例如，定量RT-PCR)等技术进行评估。在一些情况下，可以选择经发现表达 提高水平的 MEF2c、MESP-I、Tbx-5、Nkx2. 5、GATA6、Flk_l、Fog 1 和！7Og 2 多肽或 mRNA 的细 胞，以施用到哺乳动物中从而治疗心脏组织。如本文所述，由用含有TGF3 -1、BMP4、FGF_2、IGF-1、活化素-A、心营养素、α -凝 血酶和Cardiogenol C的血小板裂解物培养的间充质干细胞产生的分化心肌祖细胞的 MEF2c mRNA、MESP-ImRNA、Tbx-5mRNA、GATA6 mRNA、Flk_l 或 Fogl mRNA 的水平，与处理前的 间充质干细胞中观察到的水平相比，表现出2至5倍的提高。这些分化心肌祖细胞在进行心 肌内、皮下或血管内注射时也表现出作为功能性心肌细胞并入心脏组织的能力，以及与缺 血环境和非缺血环境中结构修复均直接相关的心泵功能改善。活体超声心动图和通过人类 特定蛋白染色进行的组织学尸检均证实了功能性益处。还如本文所述，由用含有TGFii -1、 BMP4、FGF-2、IGF-1、活化素-A、心营养素、α -凝血酶和Cardiogenol C的血清培养的间充 质干细胞所产生的分化心肌祖细胞的MEF2c mRNA、MESP-I mRNA、Tbx_5 mRNA的水平，与处 理前的间充质干细胞中观察到的水平相比，表现出5至10倍的提高。这些分化心肌祖细胞在进行心肌内注射(例如，通过心内膜或心外膜途径)、向冠 状动脉内注射、灌输到心脏中或者全身施用(例如，皮下施用)时还表现出作为功能性心肌 细胞并入心脏组织的能力，以及与缺血环境和非缺血环境中结构修复均直接相关的心泵功 能改善。活体心超声和通过人类特定蛋白染色进行的组织学尸检均证实了功能性益处。因 此，在施用至哺乳动物之前，可以采用诸如MEF2c、MESP-I、Tbx-5、GATA6、Flk-I、Fog 1、FOG 2或其组合的多肽或mRNA水平提高等释放标准来评估细胞。关于细胞种群中MEF2c、MESP-I、Tbx-5、GATA6、Flk-I 或!7Og (例如对 mRNA 而言为 FOG 1，对多肽而言为FOG 2)的多肽或mRNA水平，在本文中使用的术语“提高水平”是指高 于该多肽或mRNA的基准水平的任何水平。关于细胞种群中MEF2c、MESP-I、Tbx-5、GATA6、Flk-I 或!7Og (例如对 mRNA 而言为 FOG 1，对肽而言为FOG 2)的多肽或mRNA水平，在本文中使用的术语“基准水平”是指通常 在处理前的细胞(例如处理前的间充质干细胞)中发现的水平。例如，MEF2c mRNA基准水 平、MESP-ImRNA基准水平、Tbx-5 mRNA基准水平、GATA6 mRNA基准水平和FOGl mRNA基准 水平可以分别是在未用本文提供的组合物处理的或用分化因子处理的间充质干细胞的随 机取样中存在的MEF2c、MESP-I、 3χ-5、6ΑΤΑ6、Flk-I和FOG 1 mRNA的平均水平。应当理 解的是，在确定特定水平是否为提高水平时，可以采用可比样品的水平。MEF2c、MESP-I、Tbx-5、GATA 4、GATA6、Flk-1、Fog 2 或 FOG 1 的多肽和 / 或 mRNA 的提高水平可以是任何水平，只要该水平大于相应的基准水平即可。例如，Tbx-5 mRNA的提高水平可以比在未经处理的间充质干细胞中观察到的 Tbx-5 mRNA的基准水平高1. 5、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多倍。应注意，基准水平可以是任何量。例如，Tbx-5 mRNA的基准水平可以是零。在此情况下，任何大于零的Tbx_5 mRNA水 平都是提高水平。在一些情况下，鉴别标准可以包括向哺乳动物施用前的细胞显微分析。该显微分 析可以包括针对与细胞核相关的转录因子多肽对细胞进行评估。例如，可以在释放进入哺 乳动物前，通过与细胞核相关的Nkx2. 5、MEF2c、GATA4、MESP-l、F0G 2,Tbx-5或其任意组合 的存在，而评估适于释放进入哺乳动物的细胞。可以使用任何适宜的方法向心脏组织提供具有作为功能性心肌细胞而并入心脏 组织的能力的分化心肌祖细胞。例如，分化心肌祖细胞可以心肌内注射(例如，通过心内膜 或心外膜途径)、向冠状动脉内注射、灌输到心脏中或者全身施用(例如，皮下施用)。可以向任何心脏组织提供分化心肌祖细胞。例如，可以向哺乳动物(例如人)心 脏组织提供分化心肌祖细胞。在一些情况下，可以向受缺血性心肌病、心肌梗塞或心力衰竭 损害的心脏组织提供分化心肌祖细胞。可以向心脏组织施用任何类型的分化心肌祖细胞。例如，可以向心脏组织施用自 体或异源分化心肌祖细胞。在一些情况下，可以向心脏组织施用与本文提供的组合物共同 温育过的干细胞(例如，间充质干细胞)。可以将干细胞与本文提供的组合物共同温育任意长的时间，然后施用至心脏组 织。例如，可以将干细胞与本文提供的组合物共同温育6小时至M小时(例如8、10、12、18 或 22 小时)或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、30、35、40、45或50天，然后施用至心脏组织。在一些情况下，可以将已经与本文提供的 组合物共同温育的干细胞与本文提供的组合物一起施用于心脏组织。可以将干细胞与本文提供的组合物共同温育任意长的时间，然后与本文提供的组 合物一起施用至心脏组织。例如，可以将干细胞与本文提供的组合物共同温育6小时至M 小时(例如 8、10、12、18 或 22 小时)或者 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、M、25、30、35、40、45或50天，然后与本文提供的组合物一起施用至心 脏组织。在一些情况下，可以在施用至哺乳动物之前评估分化心肌祖细胞以确定它们是否 符合具体释放标准。例如，可以利用RT-PCR评估分化心肌祖细胞以确定所述分化心肌祖细 胞在施用于哺乳动物之前表达提高水平的MEF2c、MESP-I、Tbx-5、GATA6、Flk-I、(例如 对mRNA而言为FOG 1，对肽而言为FOG 2)或其组合的多肽或mRNA。在以下实施例中对进一步对本发明进行描述，所述实施例并不限制权利要求书中 所述的本发明的范围。


图1表示在用来源于11名冠状动脉疾病患者的骨髓的天然人间充质干细胞 (hMSC)治疗之前和之后以％表示的射血分数变化(AEF)。图2是在用DAPI免疫染色后通过共聚焦显微镜获得的，显示了治疗之后未表现出 正射血分数变化的患者2 (左图)和表现出正射血分数变化的患者9 (右图)的心肌转录因 子含量的蛋白表达。图3显示了 11名患者的hMSC中两种重要的心肌转录因子mRNA的mRNA表达。
图4显示了以任意单位(A. U.)表示的未经处理的天然hMSC(左侧)和用心源性 鸡尾酒式混合物处理的CP-hMSC (右侧)中分别为Nkx2. 5mRNA、GATA-6 mRNA和Fog-I mRNA 的心肌转录因子的mRNA表达。图5所示的通过共聚焦显微镜获得的图像显示，与天然hMSC (左侧)相比较，用心 源性鸡尾酒式混合物处理的CP-hMSC (右侧)中的Nkx2. 5、MEF2C、F0G-2和GATA4多肽的核 转位。图6描述了由天然hMSC向“鸡尾酒式混合物引导的” CP-hMSC的渐进转变(于DO 天、D5天、D15天和D20天)，并最终转化为心肌细胞(CM)。图7显示了天然hMSC和鸡尾酒式混合物引导的心肌细胞的透射电子显微镜超微结构。图8显示了光学显微镜下的鸡尾酒式混合物引导的心肌细胞。图9中左侧第一幅图表示来自于图1各患者的天然hMSC和CP-hMSC的Tbx_5 mRNA 表达(AU)，天然细胞的结果位于直方图右侧，CP细胞的结构位于直方图左侧。位于中间的 第二幅图表示MEF2C mRNA表达，位于右侧的第三幅图表示MESP-I mRNA表达。所有患者的 天然细胞的平均值和所有患者的CP细胞的平均值在直方图背景中给出。图10表示在用不同量的天然hMSC(十二名患者中的各患者直方图的右侧部分) 进行心脏治疗后，与用CP-hMSC，即鸡尾酒式混合物引导的hMSC(CP-hMSC)进行心脏治疗后 相比的射血分数变化(Δ射血分数)。图11表示未治疗的(左图)和用心脏修复细胞治疗(右图)的梗塞心脏的超声 心动图，显示了经CP-hMSC治疗后好得多的前壁恢复。图12是与图5相似的图，显示了在梗塞心肌膜中注入天然细胞(左侧)和心脏修 复细胞(右侧)之后射血分数变化(AEF)。假治疗组没有细胞的注入。图13显示了治疗开始的六个月以后用天然hMSC和CP-hMSC治疗的鼠梗塞心脏。 动脉瘤和瘢痕在天然hMSC治疗的心脏中未得到修复，而在诱导了重新肌化的CP-hMSC治疗 中都得到消解。图14显示了共聚焦解析所揭示的，通过人特异性核纤层蛋白免疫染色验证，在心 脏修复hMSC治疗的鼠心肌中，广泛存在对人类物种具有特异性的h-ALU DNA序列为正染色 的人源性细胞，所有这些在梗塞对照中均不存在。图15显示了在经心脏修复hMSC治疗的心脏中通过人心肌肌钙蛋白-I和α -辅 肌动蛋白共定位来追踪的人源的心肌细胞。在经天然hMSC治疗的心脏中不存在人源的心 肌细胞。梗塞前壁内的量化揭示了经天然hMSC治疗的心脏相比经CP-hMSC治疗的心脏中 心肌细胞核为3士2%和25士5%，意味着经心脏修复hMSC治疗可增强移植并入。图16包含针对人肌钙蛋白、心室肌球蛋白轻链mlC2V和DAPI染色的天然和CP hMSC的照片。通过经修复的前壁中心室肌球蛋白轻链mlC2V免疫染色对人类肌钙蛋白阳性 细胞的进行的对比染色(如图15所示)，或者如图17中所示的消解的瘢痕，从而证实了心 室细胞表型。图17是针对人肌钙蛋白、心室肌球蛋白轻链mlC2V和DAPI染色的的残余瘢痕的 照片。图18包含经CP-hMSC治疗的再生心肌的照片，这证实了堵塞冠状血管远端的血管生成。图19通过心肌脉管系统中人PECAM-I (⑶-31)的表达证实了 CP_hMSC有助于新血管生成。图20是描绘了在细胞输送之后相对于假治疗组的Δ射血分数(％ )对比时间 (以月计)的图。跟踪CP-hMSC治疗的长期影响超过1年，或者鼠寿命的三分之一，可换算 为25年的人类寿命。相对于假治疗组，天然hMSC的治疗在6个月和12个月时分别显示了 5%和2. 5%射血分数效果。相比而言，心脏修复hMSC治疗的梗塞小鼠于6个月和12个月 时表现出相对于假治疗组25%的显著射血分数提高。图21是描绘了细胞移植后Δ射血分数(％ )对比时间(以月计)的图。将梗塞 组分类以评价在干预时患有经证实的明显心力衰竭(射血分数<45%)的小组中的效力。 尽管治疗前射血分数均相等为35%，但仅有心脏修复hMSC治疗于6个月和12个月时使绝 对射血分数提高10%，相比之下在天然hMSC治疗组中射血分数下降5%。图22是描绘了所标明小组的小鼠的存活率(％ )的柱状图。在后续400天时，明 显心力衰竭小组中，在假治疗组中没有存活者，用天然hMSC进行的治疗经记录有>50%的 死亡率。相反，利用心脏修复hMSC治疗得到> 80%的存活率。图23描述了用病理检查和心电图确定的CP-hMSC治疗的安全性。实施例随机选择针对缺血性心脏病进行冠状动脉搭桥术的患者进行骨髓采集。他们提供 了告知同意书，研究方案也得到相关伦理委员会和动物管理使用委员会的批准。值得注意 的是未对患者进行注射而仅仅对小鼠进行了注射。实施例1间充质干细胞来源于抽取自18至45周岁的健康个体的骨盆的后髂嵴的人类骨髓 (Cambrex, East Rutherford, New Jersey)。基于流式细胞术分析，所述间充质干细胞表达 CD90、CD133、CD105、CD166、CD29 和 CD44，并且不表达 CD14、CD34 和 CD45。人骨髓来源的间充质干细胞在补充有TGF β -1 (2. 5ng/ml)、BMP4 (5ng/ml)、 FGF-2 (5ng/ml)、IGF-I (50ng/ml)、活化素-A(10ng/ml)、心营养素(lng/ml)、α -凝血酶(1 单位/ml)和Cardiogenol C(IOOnM)的血小板裂解物或血清中培养。以约1000个至2000 个细胞/cm2的密度在含有血小板裂解物的培养基中4天至10天后，发现所述细胞表达的 MEF2cmRNA、MESP-l mRNA、Tbx_5 mRNA、GATA6 mRNA、Flk_l 或 FOG ImRNA 比未经处理的间充 质干细胞多2倍至5倍。以约1000个至2000个细胞/cm2的密度在含有血清的培养基中5天至15天后，发 现所述细胞表达的 MEF2c mRNA、MESP-l mRNA、Tbx_5mRNA、GATA 4 mRNA、GATA6 mRNA、Flk_l 或FOG 1 mRNA比未经处理的间充质干细胞多5倍至10倍。用于RT-PCR分析的引物对是商购自Applied Biosystems的标准引物。于跳动的心脏内得到的体内结果和随后尸检得到的体外结果均证实所述分化心 肌祖细胞具有作为功能性心肌细胞并入心脏组织的能力。经过伴随长轴上的二维M-模式 探测的短轴上的超声心动图、多普勒脉冲波分析和12导联心电图的监测，异氟烷麻醉下活 体内将心肌祖细胞直接心肌输送至患病心脏改善了心功能。收集的心脏组织在3%多聚甲醛中固定，切片并进行针对人类细胞示踪的免疫探测。在用满足释放标准(艮口 MEF2c mRNA、MESP-I mRNA、Tbx-5 mRNA、GATA 4 mRNA、GATA6 mRNA、Flk-l或FOG 1 mRNA的提高表达水平)的心肌祖细胞治疗的小鼠中的分析则证实了 新生的人类来源心肌细胞和脉管系统，伴随功能改善和瘢痕消解，相比之下，利用未达到释 放标准的细胞没能获得益处。为了扩大用于患者自体注射的心脏修复细胞的生产规模，由于免疫荧光耗时、定 性并且可能依赖于操作者，因此考虑其他替代方法。一种供选择的方法是实时定量逆转录 聚合酶链式反应(RT-qPCR)。该方法更快地(一天之内)给出不依赖于操作者且相对于基 准标准定量的结果。此外，当需要对免疫染色样品一个接一个地进行荧光显微评价时，使用 96孔板可以通过RT-qPCR —式两份地测试多达48个不同的样品(或条件)。为了鉴别RT-qPCR的适宜标记物，由获得自心脏病患者(n = 7)的骨髓样品获得 心脏修复细胞。通过针对MEF2C和Nkx2. 5的免疫荧光染色评价细胞。由这些细胞提取RNA， 通过实时定量PCR测量Nkx2. 5和MEF2C的表达。基准标准由来自于相同批但并未在心源鸡尾酒式混合物存在下进行培养的细胞 构成。采用双Δ-Ct方法计算结果，将由经处理的细胞获得的数据对由未经处理的细胞 得到的数据进行标准化。当与天然细胞相比时，qPCR和免疫荧光(核转位)均将MEF2C鉴别为心脏修复细 胞的适宜标记。相反，通过免疫荧光(核转位)于蛋白水平看到的Nkx2. 5的定性变化并未 初始地转变为相对于未经处理的细胞的RNA水平的定量变化。随后研究了 Nkx2. 5下游的 基因，因为它们的表达的诱导将依赖于Nxk2. 5的核转位。这导致将MESP-l、Flk-l和Tbx5 鉴别为可用于QPCR鉴别的其他适宜的基因。在胸骨切开术之后的冠状动脉搭桥术过程中获得人骨髓抽出物(15ml至20ml)。 骨髓低温保存在基于DMSO的不含有血清的冷冻溶液中。通过将原骨髓置于塑料盘中，并且 于12h时洗涤选择粘附细胞从而募集间充质干细胞，并且通过使用⑶347⑶457⑶133+标 记物组的荧光激活细胞分选(FACS)分析进行了确认。细胞于37°C在补充有5%人血小板 裂解物的 DMEM(Mayo Clinic Blood Bank, Rochester, MN)中培养。在免疫功能不全的裸鼠(Harlan，Indianapolis, IN)中制造心肌梗塞。根据盲法 设计，在梗塞后一个月，将悬浮在12. 5μ 1增殖培养基中的总数600，000的天然hMSC或心 脏修复引导的hMSC在显微镜观察下注入左心室前壁上的五个心外膜位点。假治疗组进行 相同的手术过程但没有细胞注入。对该慢性梗塞模型进行的骨髓hMSC的心肌注入证实了 细胞移植结果的异质性，11个研究个体中仅有2个在超声心动图中改善了射血分数。患者3和9经鉴别为具有高心生成潜力的个体。首先由图1观察到用分别来自于 患者3和9的hMSC治疗的小鼠(n = 3)中射血分数的变化是显著阳性的，而其他各患者的 变化则不是。如图2所示，用共聚焦显微镜在hMSC中观察到心肌转录因子的蛋白表达。代表性 地对于所有图，条棒对应于20 μ m。在3%多聚甲醛中固定并用Triton X_100透化，之后以对下述分子特异性 的抗体进行免疫染色MEF2C(1 400，Cell Signaling Technologies, Danvers, ΜΑ), Nkx2. 5(1 : 150, Santa Cruz Biotechnology Inc. , Santa Cruz, CA)、GATA4(Santa CruzBiotechnology Inc. ) > Phospho-AKTser473 ( 1 100, Cell Signaling Technologies)、 Tbx5(l 5000, Abeam, Cambridge, MA) > Mesp-I (1 250, Novus Bio, Littleton, CO) > Fog-2(l 100，Santa Cruz Biotechnology)、肌节蛋白 α -辅肌动蛋白(1 500， Sigma-Aldrich)和人特异性肌钙蛋白-1(1 100，Abeam)、mlC2v(1 500，Synaptic Systems, Gottigen, Germany)> Sca-I (1 : 100, R&D Systems, Minneapolis, MN)、CD-31/ PECAM-I (1 500，Beckman Coulter，Fullerton，CA)、α-平滑肌肌动蛋白(Abeam)、人特 异性肌钙蛋白-1(1 100，Abeam)、人核纤层蛋白 A/C(l 50, Novacastra, New Castle, UK)和Ki67 (1 500，Abeam)，并进行DAPI染色以使细胞核在用LSM 510激光扫描共聚焦 显微镜(Carl Zeiss Inc. , Jena, Germany)进行的共聚焦显微术中可见。在DAPI染色下观察到早期心肌转录因子Nkx 2. 5、Tbx_5和MESP1，晚期心肌转录 因子MEF2C。患者2的结果位于左侧，患者9的结果位于右侧。所得图像显示，对于来自患 者2的hMSC，心肌转录因子的表达较弱，而对于来自患者9的则较强。这证实了来自患者9 的hMSC给出有效治疗益处而来自患者2的hMSC则不能给出有效治疗益处的事实。DAPI提 供的颜色为蓝色。在图2中，针对Nkx2. 5的第一系列图像显示了对于患者2的hMSC (左图)，细胞核 仅被DAPI染为蓝色(左图)。还出现了对应于在细胞质中存在的Nkx 2. 5的弱绿色染色。 患者9的相应图像(右图)显示了 Nkx2. 5在细胞质中以及在细胞核中更高地表达(绿色)。第二系列图像显示了患者2的心肌转录因子Tbx_5(绿色)和MESP-I (红色)，细 胞核经DAPI染为蓝色，没有见到绿色或红色，这对应于没有表达TbX-5和MESP-I。对于患 者2，细胞质染为红色，细胞核为绿色，这对应于两种心肌转录因子的强表达和Tbx-5核转 位至细胞核。第三系列图像给出了与Nkx 2. 5相似的MEF2C的结果。图3显示了在qPCR中研究的mRNA表达，揭示了对于本研究的11名患者的hMSC 的心肌转录因子表达(MEF2C和Tbx-5)。使用TaqMan PCR 试剂盒，通过 Applied Biosystems 7，900HT 序列检测系统 (Applied Biosystems, Foster City, CA)进行定量聚合酶链式反应(qPCR)。TaqMan 基因 表达反应在96孔板中温育，并一式三份地进行。循环阈值(Ct)定义为荧光超过固定阈值 时的循环分数。TaqMan Ct值换算为用2_Δ 法确定的相对变化倍数，标准化为GAPDH(P/ Ν435, 2662-0506003)表达。评价了表1中所列的基因，它们代表性地具有心肌转录活性。在用含有人重组TGF0-K2.5ng/ml)、BMP4(5ng/ml)、心营养素(lng/ml)、α-凝 血酶(lU/ml)和Cardiogenol C(IOOyM)的心源性鸡尾酒式混合物进行5天刺激之前和之 后，在mRNA和蛋白水平上评价细胞。患者2和9的hMSC的MEF2C mRNA和Tbx_5 mRNA表 达(任意单位AU)，比任一个其他患者，都要高得多。表权利要求
1.一种组合物，所述组合物包含TGFii -1、BMP4、α -凝血酶、选自由心营养素和IL-6 组成的组的化合物、以及选自由Cardiogenol C和视黄酸组成的组的化合物。
2.如权利要求1所述的组合物，所述组合物包含TGFii-1、ΒΜΡ4、α -凝血酶、心营养素 禾口 Cardiogenol C0
3.如权利要求1所述的组合物，所述组合物包含选自由FGF-2、IGF-1、活化素-Α、 TNF- α、FGF-4、LIF、VEGF-A及其组合组成的组的至少一种化合物。
4.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物包含FGF-2、IGF-I和活化 素-A。
5.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物包含活化素-A、FGF-2、IL-6、 IGF-I和视黄酸。
6.如权利要求1所述的组合物，所述组合物不包含选自由TNF-α、FGF-4、LIF和 VEGF-A组成的组的至少一种化合物。
7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中当一种化合物存在于所述组合物中 时，其存在量为所述TGF β -1以lng/ml至5ng/ml的量存在，所述BMP4以lng/ml至IOng/ ml的量存在，所述心营养素以0. 5ng/ml至5ng/ml的量存在，所述α -凝血酶以0. 5单位/ ml至5单位/ml的量存在，所述Cardiogenol C以50nM至500nM的量存在，所述FGF-2以 lng/ml至10ng/ml的量存在，所述IGF-1以10ng/ml至100ng/ml的量存在，所述活化素-A 以lng/ml至50ng/ml的量存在，所述TNF- α以lng/ml至50ng/ml的量存在，所述FGF-4 以lng/ml至20ng/ml的量存在，所述IL-6以10ng/ml至100ng/ml的量存在，所述LIF以1 单位/ml至10单位/ml的量存在，所述VEGF-A以lng/ml至50ng/ml的量存在，所述视黄 酸以每ml中0. 1 μ M至1. O μ M的量存在。
8.如权利要求1所述的组合物，所述组合物包含以组合方式使用的重组 TGF β -1 (2. 5ng/ml)、BMP4 (5ng/ml)、心营养素(lng/ml)、Cardiogenol C (100 μ Μ)。
9.如权利要求8所述的组合物，所述组合物还包含α-凝血酶(lU/ml)、FGF-2 (lOng/ ml)、IGF-1 (50ng/ml)和活化素 _A(5ng/ml)。
10.如权利要求1所述的组合物，所述组合物包含以组合方式使用的重组 TGF β -1 (2. 5ng/ml)、BMP4 (5ng/ml)、活化素-A (5ng/ml)、FGF-2 (10ng/ml)、IL-6 (lOOng/ ml)、因子 11&010-凝血酶、川/1111)、16卩-1(50叫/1111)和视黄酸(1 μ Μ)。
11.如权利要求1至10中任一项所述的组合物，所述组合物包含在培养基中，所述培养 基选自由含有胎牛血清、人血清、血小板裂解物及其混合物的培养基组成的组。
12.—种由初始细胞获得分化细胞的方法，所述分化细胞以提高水平表达选自由MEF2c mRNA、MESP-I mRNA、Tbx-5 mRNA、GATA4mRNA、Flk-I mRNA、GATA6 mRNA、Fog-I mRNA 及其 组合组成的组的至少一种mRNA，和/或具有选自由Nkx2. 5多肽、MEF2C多肽、Tbx-5多肽、 F0G-2多肽、GATA-4多肽、MESP-I多肽及其组合组成的组的至少一种多肽，其中所述至少一 种多肽与所述分化细胞的细胞核相关，其中所述方法包括在权利要求1至11中任一项的组 合物的存在下培养初始细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述分化细胞表达提高水平的MEF2cmRNA和 MESP-I mRNAο
14.如权利要求12和13中任一项所述的方法，其中所述初始细胞是间充质干细胞。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述间充质干细胞是骨髓来源的干细胞。
16.如权利要求14和15中任一项所述的方法，其中所述间充质干细胞在细胞表面表达 CD90、CD105、CD133、CD166、CD29 和 CD44，并且在细胞表面不表达 CD14、CD34 和 CD45。
17.如权利要求12至16中任一项所述的方法，其中所述分化细胞是心脏修复细胞。
18.通过权利要求12至17中任一项所述的方法获得的细胞。
19.如权利要求18所述的细胞，其中所述细胞是心脏修复细胞。
20.将分化细胞输入哺乳动物的方法，其中所述方法包括(a)确定来自分化细胞群的细胞样品包含这样的细胞该细胞以提高水平表达选自由 MEF2c mRNA、MESP-I mRNA、Tbx_5 mRNA、GATA4 mRNA、Flk_l mRNA、GATA6 mRNA、Fog-I mRNA 及其组合组成的组的至少一种mRNA，和/或具有选自由Nkx2. 5多肽、MEF2C多肽、Tbx_5多 肽、MESP-I多肽、GATA-4多肽、F0G-2多肽及其组合组成的组的至少一种多肽，其中所述多 肽与所述分化细胞的细胞核相关，和(b)向所述哺乳动物施用来自所述分化细胞群的细胞。
21.如权利要求20所述的方法，其中由在权利要求1至11中任一项所述的组合物存在 下培养的权利要求12至16中任一项所述的初始细胞获得所述分化细胞群。
22.如权利要求20和21中任一项所述的方法，其中所述步骤(a)包括采用逆转录聚合 酶链式反应。
23.如权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括通过选自由全身 施用、心脏内施用和冠脉内施用组成的组的施用对所述细胞进行施用。
24.如权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所述步骤(a)包括采用免疫细胞化学反应。
25.向心脏组织提供心肌细胞的方法，其中所述方法包括向所述心脏组织施用通过与 权利要求1至11中任一项所述的组合物相接触而得到的权利要求12至16中任一项所述 的分化细胞。
全文摘要
本发明涉及含有心源性因子的组合物，还涉及通过在这些因子的存在下培养初始细胞从而获得细胞的方法，以及将所获得的细胞施用于心脏组织的方法。
文档编号C12N5/077GK102046193SQ200980118954
公开日2011年5月4日 申请日期2009年5月20日 优先权日2008年5月27日
发明者安德烈·泰尔齐奇, 阿塔·贝法尔 申请人:梅奥医学教育和研究基金会