专利名称：：作为癌症标志物的结肠癌相关的转录物1(ccat-1)的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及癌症标志物CCAT-I和CCAT-I在癌症诊断和成像中的用途。
背景技术：
：结肠和直肠的腺癌(CRC)是每年在世界范围内影响超过一百万人的常见疾病(1)。目前的CRC筛选主要是基于大便潜血检验，而诊断是基于结肠镜检查和组织活检。目前的筛选程序对于降低CRC-相关的死亡率具有一些作用(2)，但是需要更准确的筛选和诊断形式。化疗剂单独或与靶向治疗联合改善了转移性患者的中位数存活率，并降低了经历CRC的完全切除和处于复发的高风险的患者(具有淋巴结转移灶或不利的组织学的患者，(3))中的疾病复发。尽管CRC治疗有大的进展，但是约50%的诊断患有CRC的患者将在诊断后5年内死于疾病。在正常组织中不表达的CRC-特异性分子是用于治疗的潜在靶标。现在几乎没有在CRC中独特表达而在正常组织中不表达的分子标志物。使用cDNA阵列的普查没有鉴定可用于诊断和用作治疗靶标的CRC相关的分子标志物。发明概述本发明是基于在癌细胞特别是结肠、直肠癌中特异性表达的独特核酸转录物的鉴定、分离和测序。根据其独特表达谱，该分子被称为结肠癌相关的转录物1(CCAT-I)0该分子的完整序列公开于下文，并被命名为SEQIDNO:1。随后，还发现CCAT-I在肺癌中表达。因此，通过其第一方面，本发明提供诊断癌症或癌前病变的方法，包括测量生物样品中SEQIDNO.l(CCAT-l)或其片段的表达水平；其中生物样品中SEQIDNO.l(CCAT-l)或其片段的表达指示癌症或癌前病变。在一种实施方案中，所述方法还包括将在生物样品中测量的所述表达水平与标准进行比较，其中生物样品中SEQIDNO.l(CCAT-l)或其片段的更高的表达水平指示癌症或癌前病变。在一种实施方案中，本发明的方法包括(a)从获自受治疗者的生物样品中分离核酸；(b)将能够识别CCAT-I的探针与所述核酸在允许形成杂交复合体的条件下杂交；禾口(C)将杂交复合体形成与标准进行比较；其中生物样品中更高水平的杂交复合体指示癌症或癌前病变。在另一种实施方案中，本发明的方法包括(a)从获自受治疗者的生物样品中分离核酸；(b)在所述分离的核酸中扩增CCAT-I或其任何片段；(c)显现CCAT-I扩增产物；禾口(d)将CCAT-I扩增产物的量与标准进行比较；其中更高水平的CCAT-I扩增产物的存在指示癌症或癌前病变。在具体实施方案中，所述扩增通过使用CCAT-I特异性探针的聚合酶链式反应(PCR)进行。在优选的实施方案中，所述PCR是实时定量PCR。根据本发明的术语癌症或癌前病变的诊断还涵盖癌症或癌前病变的分期，以及体内成像。根据本发明的一种实施方案，所述标准是通过测量未患癌症的受治疗者中CCAT-I的表达水平而确定的。在另一种实施方案中，所述标准是通过测量所述同一受治疗者的非癌组织中CCAT-I的表达水平而确定的。根据本发明的某些实施方案，所述癌症选自以下组成的组结肠癌、直肠癌、肺癌和所述癌症的转移灶，包括微转移灶(micro-metastase)。根据另一种实施方案，本发明的方法诊断的癌前病变是腺瘤性息肉。根据本发明的某些实施方案，所述生物样品选自以下组成的组组织、血液、尿、粪便和骨髓样品。优选地所述生物样品是组织活检。组织活检可获自例如结肠、直肠、肝、肺和淋巴结。在另一种实施方案中，CCAT-I表达水平是通过原位杂交测量的。在另一方面，本发明提供一种分离的寡核苷酸，其包含SEQIDN0:I(CCAT-I)或其互补序列的至少8个连续核苷酸，优选地用作探针或引物。在一个具体实施方案中，寡核苷酸探针包含SEQIDNO:5。根据某些实施方案，本发明的分离的寡核苷酸意图用于检测生物样品中的CCAT-I表达。根据某些实施方案，本发明的分离的寡核苷酸意图用于诊断癌症。在另一方面，本发明提供一种用于检测生物样品中CCAT-I的表达的方法，包括(a)从所述生物样品分离核酸；(b)将本发明的寡核苷酸探针与所述核酸在允许形成杂交复合体的条件下杂交；禾口(c)将杂交复合体形成与标准进行比较，其中生物样品中更高水平的杂交复合体指示样品中CCAT-I的表达。在一种实施方案中，所述方法还包括在杂交之前扩增所述生物样品中转录的核酸。在另一方面，本发明提供一种分离的核酸，其包含与SEQIDNO:1具有至少85%同源性的CCAT-I或其片段。在一种实施方案中，所述分离的核酸包含SEQIDNO:1或其片段的核酸序列。在一种实施方案中，所述核酸是mRNA。在另一种实施方案中，所述核酸是cDNA。在另一方面，本发明提供组合物，包括药物组合物，其包含如上所述的本发明的分离的寡核苷酸、分离的寡核苷酸探针或分离的核酸。在具体实施方案中，所述组合物被连接至基质。本发明还包括包含本发明的分离的核酸的载体，以及包含所述载体的宿主细胞。在另一方面，本发明提供一种试剂盒，其被划分以容纳用于测量获自受治疗者的生物样品中的CCAT-I表达水平的至少一种试剂，所述至少一种试剂包含与CCAT-I转录物的至少一种片段杂交的至少一种寡核苷酸探针或引物。在又一方面，本发明提供一种阵列，其包含具有多种区段的基质，其中所述区段中的至少一种包含与CCAT-I或其片段杂交的探针。本发明还包括癌症或癌前病变的成像，所述癌症或癌前病变包括但不限于腺瘤性息肉、结肠或直肠的原发性腺癌、肺癌、淋巴结转移灶和远端转移灶，通过向受治疗者施用能够识别CCAT-I的探针，其中所述探针轭合至包括但不限于放射性同位素、荧光染料、可见染料(visibledye)或纳米颗粒的指示分子，并通过成像装置检测标记。附图简述为了理解本发明和查看其在实践中可如何被实施，下面将参考附图，仅通过非限制性实施例来描述实施方案，其中图1是显示商业可获得的来自正常组织的CDNA板中CCAT-I转录物水平的实时PCR定量分析的图。左侧的柱代表结肠癌细胞系SK-Co-IO中的CCAT-I转录物水平。图2是显示结肠癌(黑色条)和相邻的正常组织(白色条)中的CCAT-I转录物水平的实时PCR分析的图。样品编号显示在X-轴。C=对照/SK-CO-IO。图3是显示低浓度HT-29细胞中CCAT-I的校准曲线的图。扩增在获自未患结肠癌的受治疗者的外周血单核细胞(PBMC)中稀释的增加浓度的HT-29结肠癌细胞中的CCAT-1。扩增的CCAT-IcDNA的相对量(RQ)显示于y-轴，并使用单独获自未患结肠癌的受治疗者的PBMC作为参考样品进行计算。CCAT-IcDNA的相对量与HT-29肿瘤细胞浓度相关。最低剂量1XIO6个PBMC中5个肿瘤细胞至高达1XIO6个PBMC中500个肿瘤细胞(HT29)。图4是显示中间浓度的HT-29细胞的校准的图。扩增在获自未患结肠癌的受治疗者的PBMC中稀释的增加浓度的HT-29结肠癌细胞中的CCAT-I。扩增的CCAT-lcDNA的相对量(RQ)使用单独获自未患结肠癌的受治疗者的PBMC作为参考样品进行计算。CCAT-lcDNA的相对量(y-轴)与HT-29肿瘤细胞浓度相关。最低剂量1XIO6个PBMC中500个肿瘤细胞(HT29)至高达1XIO6个PBMC中10,000个肿瘤细胞(HT29)。右侧的柱是仅PBMC的对照。图5是显示高浓度的HT-29细胞的校准的图。扩增在获自未患结肠癌的受治疗者的PBMC中稀释的增加浓度的HT-29结肠癌细胞中的CCAT-I。扩增的CCAT-lcDNA的相对量(RQ)显示于y_轴，并使用单独获自未患结肠癌的受治疗者的PBMC作为参考样品进行计算。CCAT-lcDNA的相对量与HT-29肿瘤细胞浓度相关。最低剂量IXlO6个PBMC中1,000个肿瘤细胞至高达1XIO6个PBMC中1,000,000个肿瘤细胞(HT29)。右侧的柱是对照样品，其仅含有获自未患结肠癌的受治疗者的PMBC。图6是显示结肠腺瘤(腺瘤性息肉)和衍生自结肠腺癌的肝转移灶中的CCAT-I表达的图。410TCO-肿瘤组织、316TCO-肿瘤组织、NN=获自具有结肠癌以外的疾病的患者的正常结肠粘膜。Pl和P2=获自结肠的腺瘤性息肉的组织。M=获自肝转移灶(转移性结肠癌)的组织。图7是显示通过不同的检测方法鉴定的哨兵淋巴结(SLN)的百分比的图，所述检测方法包括苏木精和伊红染色(H&E)、免疫组织化学(IHC)和聚合酶链式反应(PCR)。图8是显示通过实时定量PCR的细胞角蛋白-20(CK20)扩增曲线的图。图9是显示通过实时定量PCR(qPCR)的CCAT-I扩增曲线的图。图10是显示粪便样品中CCAT-I的qPCR结果的图。结果显示为CCAT-1和看家基因(GAPDH)的表达之间的关系。每个柱代表与从同一样品扩增的GAPDHcDNA的量相比的CCAT-lcDNA的相对量(RQ)。NTC(左侧的柱)显示内部阴性对照_获自未患结肠癌的受治疗者的外周血淋巴细胞。没有CCAT-lcDNA存在。样品t391和t374是阳性对照-结肠组织的原发性腺癌。这些样品显示CCAT-I的高表达。来自健康志愿者的粪便样品(C46-C8)。任何样品(η=9)中都没有CCAT-I表达。患有结肠或直肠腺癌的患者的粪便样品(Ρ25-Ρ1)。在4/12样品中发现了CCAT-I表达。图11是显示通过实时PCR定量分析测量的、九个阴性对照的外周血(健康志愿者)和两个结肠腺癌样品(左侧的柱)中的CCAT-I表达的图。图12是显示结肠癌患者的外周血样品中的CCAT-I表达的图。扩增的CCAT-lcDNA的相对量(RQ；显示于y_轴)是与获自未患结肠癌的受治疗者(NC)的PBMC的对照样品相比。图13是显示与HT-29相比的18个结肠直肠癌细胞系中的相对CCAT-1表达的图。表达水平通过实时(定量)PCR确定。任何给定样品中的相对CCAT-I表达是与HT-29结肠癌细胞系(=1)中的CCAT-I表达相比。图14是显示与HT-29相比的16个肺癌细胞系中的相对CCAT-1表达的图。表达水平通过实时(定量)PCR确定。任何给定样品中的相对CCAT-I表达是与HT-29结肠癌细胞系(=1)中的CCAT-I表达相比。图15A显示用作原位探针的165bp核酸序列(SEQIDNOX)；图15B是显示pBluescript载体的RNA印迹分析的照片。泳道1序列梯。泳道2pBluescript载体和插入序列。图16是基于筛选的原位杂交的范例。结肠腺癌(a)和相邻的正常粘膜(b)中的CCAT-I的比较染色。在肿瘤组织(a)中观察到更强的CCAT-I染色，相比之下，相邻的正常粘膜中的CCAT-I染色的强度较低。图17是显示健康志愿者的外周血样品中的CCAT-I表达的图。实施方案详述^X如本文所用，术语“CCAT-1”指结肠癌相关的转录物l(ColonCancerAssociatedTranscript1)。如本文所用，术语“CCAT-1的片段”或“CCAT-1转录物的片段”指CCAT-I基因转录物的片段，其可用作寡核苷酸或核酸探针、引物或反义寡核苷酸。如本文所用，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并包括任何长度的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。以下是多核苷酸的非限制性实例基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、具有任何序列的分离的DNA、具有任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸的序列可被非核苷酸组分中断。多核苷酸还可在聚合后修饰，诸如通过与标记组分轭合。该术语还包括双链和单链分子二者。CCAT-I的“互补转录物”或“探针”指与CCAT-I互补的、用于检测CCAT-I的cDNA或mRNA的至少一部分的存在的核酸分子或序列。检测通过鉴定探针和测定的序列之间的杂交复合体进行。探针可被连接至固体支持物或可检测的标记。探针一般是单链的。探针通常包含10至200个核苷酸。探针的特定性质将取决于特定的用途，并且其确定在本领域技术人员的能力范围之内。一般而言，探针将在高严格性条件下与CCAT-I的cDNA或mRNA的至少一部分杂交。如本文所用，“引物”指通过与靶标杂交而结合感兴趣的样品中存在的靶标或“模板”靶标，然后促进与靶标互补的多核苷酸的聚合的短的多核苷酸。“聚合酶链式反应”(PCR)是其中复制拷贝是由靶标多核苷酸使用由正向引物和反向引物组成的一组引物，通常是一对引物，和作为聚合催化剂的DNA聚合酶生成的反应。应理解，引物也可用作杂交反应，诸如DNA或RNA印迹分析中的探针，例如，如SambrookJ.等人ALaboratoryManual(实验室手册).第2版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989中所述。如本文所用，术语“cDNA”指互补DNA。“cDNA”指分离的多核苷酸、核酸分子或其任何片段或互补序列。它可通过重组技术或合成方法起源，是双链或单链，代表编码和/或非编码5’和3’序列。如本文所用，“结肠直肠癌”或“CRC”指特征为包括盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠和直肠的肠道细胞的癌症的医学病症。如本文所用，“癌前病变”或“腺瘤性息肉”指特征为结肠粘膜的恶性转化但没有侵入基底膜的组织学证据的医学病症。如本文所用，“肺癌”指特征为肺细胞的癌症的医学病症。“载体”包括将插入的多核苷酸转入宿主细胞的自我复制的核酸分子。该术语意图包括主要功能是将核酸分子插入细胞的载体、主要功能是核酸复制的复制载体和功能为DNA或RNA的转录和/或翻译的表达载体。还意图包括提供多于一种上述功能的载体。术语“宿主细胞”涵盖充当载体或掺入外源核酸分子诸如多核苷酸的接受者的任何单独的细胞或细胞培养物。具体地，宿主细胞涵盖能够充当包含CCAT-I的至少一部分的载体的接受者的细胞。它还涵盖由于天然的、偶然的或有意的突变而有时可能未必与原始的亲代细胞在基因型或表型上相同的细胞后代。原核细胞或真核细胞适于充当本发明中的宿主细胞。宿主细胞包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞，包括哺乳动物细胞，如鼠、大鼠、猿猴或人类细胞。如本文所用，“差异表达”指增加的、更高(上调的或存在的)或降低的(下调的或不存在的)基因表达，如通过生物样品中转录的寡核苷酸(如mRNA)的不存在、存在或量的变化所检测的。“更高的表达水平”涵盖比对照样品中检测的表达水平或标准高至少2倍、2.5倍、3倍、5倍、10倍或更高的表达水平。该术语还指细胞或组织中有核苷酸序列的表达，而对照细胞中未检测到表达。如本文所用，“杂交”指其中至少一种多核苷酸反应以形成经由核苷酸残基的碱基之间的氢键稳定的复合体的反应。氢键可通过Watson-Crick碱基配对、以任何其他序列特异性方式发生。杂交反应可构成更广泛过程中的步骤，诸如PCR反应的起始。杂交反应可在不同严格性的条件下进行。在严格性条件下，彼此具有至少60%,65%,70%,75%同一性的核酸分子保持互相杂交。高严格性杂交条件的非限制性实例是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在大约45°C下杂交，然后在0.2XSSC和0.1%SDS中在50°C、在55°C或在约60°C或更高温度下漂洗一次或多次。当杂交在两个单链多核苷酸之间以反平行构型发生时，这些多核苷酸被描述为互补。能够与本发明的核酸分子SEQNO1(CCAT)杂交的分子还包括能够与其杂交的多核苷酸片段。在本文中，片段被理解为意指长度足以与CCAT-I转录物杂交的核酸分子的部分。因此，术语片段意指这些分子的序列与CCAT-I转录物的序列在一个或多个位置不同但仍显示与这些序列或其部分的高度同源性。在此语境中，同源性意指至少40%的序列同一性、特别地至少60%、至少80%、至少85%、至少90%或超过95%的同一性。优选地，同源性的程度是通过将相应序列与SEQIDNO1的核苷酸序列进行比较而确定的。在被比较的序列不具有相同长度的此类情形中，同源性的程度优选地指较短的序列中与较长的序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。同源性或同一性的程度可通过例如已知的基于计算机比对的程序诸如ClustalW来评估，ClustalW由EuropeanBioinformaticsInstitute(EBI)禾口EuropeanMolecularBiologyLaboratory(EMBL)分发。ClustalW可以从各种来源诸如例如www.ebi.ac.uk/clustalw下载。当使用ClustalW软件包2.0版本来确定特定的序列是否与根据本发明的SEQNO1具有例如85%同一性时，比较可通过其中提供的默认设置进行。“生物样品”在本文使用其广泛含义，并可包括体液；细胞制品的可溶级分或培养细胞的培养基的等份；从细胞中分离或提取的染色体、细胞器或细胞膜；溶解或结合至基质的基因组DNA、RNA或cDNA；细胞；活检，组织包括肿瘤组织、结肠直肠样品和非结肠直肠样品；组织印迹(tissueprint)；指纹、口腔细胞(buccalcell)、皮肤或毛发；和类似样品。“基质”指结合核酸的任何硬质或半硬质支持物，并包括膜、过滤器、芯片、载玻片、干胶片、纤维、磁性或非磁性珠、凝胶、毛细管或其他管、平板、聚合物、纳米颗粒和微颗粒，其具有多种表面形式，包括孔(well)、沟(trench)、针(pin)、槽(channel)禾口小孑L(pore)。本发明是基于对结肠癌相关的转录物-I(CCAT-I)的鉴定，CCAT-I是长2528碱基对(bp)并且位于染色体8q24.21上的新的非编码RNA。发明人发现CCAT-I存在于多种癌组织和细胞系包括结肠癌、直肠癌、肺癌中和结肠的癌前病变(腺瘤性息肉)中，但在正常组织中如果有的话，以非常低的水平被检测到，如本文所公开的。因此，CCAT-I可充当癌细胞的标志物，并且尤其可用于生物样品中的结肠直肠癌、肺癌和癌前病变(腺瘤性息肉)的鉴定。因此，本发明提供CCAT-I或其序列的任何部分作为用于对患有结肠直肠癌(CRC)、癌前病变(腺瘤性息肉)和肺癌的患者进行诊断、分期(病理学评估)、成像和术后监测的特异性分子诊断标志物的用途。这些活动可在体外，或通过递送用于患者中的肿瘤成像的组合物而在体内进行。检测可使用聚合酶链式反应(PCR)、原位杂交技术或本领域已知的任何检测技术实现。根据本发明的一些实施方案，提供用于筛选、诊断和分析患者和/或患者样品以检测CCAT-I表达的证据的组合物和方法。CCAT-I的表达暗示原发性或转移的结肠直肠癌或原发性或转移性肺癌。在本发明的另一方面，提供可用于显现原发性或转移的结肠直肠癌或原发性或转移性肺癌细胞的组合物和方法。筛选和诊断组合物和方法可用于监测处于直肠结肠癌或肺癌的高风险组的个体，诸如那些过去已被诊断患有局部性疾病、转移的疾病的个体，或那些在遗传上与所述疾病关联的个体，或那些具有过去被诊断患有癌症的一级和二级家族成员的个体。具有结肠炎性病症诸如溃疡性结肠炎或克隆氏结肠炎病史的个体和具有吸烟史的个体也将被视为处于结肠直肠癌或肺癌的高风险组的个体。体外筛选和诊断组合物和方法可用于监测正在经历或已经接受结肠直肠癌或肺癌治疗的个体以确定癌症是否被除去。筛选和诊断组合物和方法可用于监测诸如通过遗传筛选和/或家族史被鉴定为有遗传素因的个体。因此，可鉴定处于发展结肠直肠癌和肺癌风险的个体，并可从此类个体中分离样品。本发明可用于诊断显示至少一种癌症症状或特征，如在相关组织中存在息肉的个体。本发明尤其可用于监测被鉴定为具有包括亲属曾患有结肠直肠癌或肺癌的家族病史的个体。同样地，本发明尤其可用于监测接受治疗并除去肿瘤或以其他方式被缓解的个体。根据本发明，提供结合CCAT-I基因转录物的化合物。结肠癌、直肠癌或肺癌的检测可使用获自癌症患者或怀疑患有癌症的个体的任何生物样品进行，所述生物样品包括但不限于，组织、血液、骨髓、粪便、尿、淋巴结或任何体液。在特异性实施方案中，所述生物样品是取自怀疑为癌性的组织的活检(如针吸活检或结肠镜检查中取出的组织)。在具体的实施方案中，所述样品是粪便样品。组织样品可通过外科技术获得。本领域技术人员将理解可获得用于根据本发明的分析和检查的测试样品的多样性。另外，本领域技术人员将理解，对于获得组织样品目的，本发明可使用另外的程序。在一种实施方案中，使用血液作为生物样品。如果是这种情况，可通过例如离心从血液样品中分离其中包含的细胞。在优选的实施方案中，生物样品获自人类。在任何生物样品中检测到CCAT-I基因转录物的存在表明该生物样品含有肿瘤细胞。组织样品任选地通过标准技术如超声处理、机械破碎或化学裂解勻浆。10用于外科病理学的组织切片制品可以冷冻并使用标准技术制备。对组织切片的原位杂交测定对固定的细胞进行。CCAT-I基因转录物的存在可使用本领域已知的多种技术来确定，例如使用特异性引物的基因转录物或其片段的聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物的检测，以及与CCAT-I特异性探针的杂交。CCAT-I基因转录物的存在还可使用诸如原位杂交等技术在组织切片中确定。为此，本发明提供用来在本发明的程序中鉴定CCAT-I的寡核苷酸探针和寡核苷酸引物。在另一方面，本发明提供试剂盒，其包含诸如寡核苷酸探针和寡核苷酸引物等组分。应理解，本文提供的实例不意图限制本发明的范围。如上文指出的，生物样品中的CCAT-I基因转录物的检测可使用聚合酶链式反应(PCR)技术进行。PCR是本领域已知的，并且被常规地实践于诊断和研究两方面。它公开于例如美国专利第4,683,202和5,075,216号。简要而言，PCR通过提供与待扩增的靶标核苷酸序列杂交的引物来提供DNA/RNA序列的扩增。引物组通常含有两个引物(+正向和-反向)。该反应还采用核苷酸和聚合酶。聚合酶根据与杂交的引物相邻的序列填充互补的核苷酸。扩增循环造成所需产物的指数扩增。PCR引物是基于序列信息根据常规的方案设计的。CCAT-I转录物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所列。对于PCR，通常从生物样品中的细胞提取RNA并分析，或可选地，将RNA转化为cDNA。此类转化也是标准做法。当CCAT-I转录物存在于生物样品中时，PCR将得到包含CCAT-I转录物的原始mRNA的指数拷贝。如果CCAT-I不存在，PCR将不会得到可检测的扩增产物。适于PCR的引物一般为8-25个核苷酸长、15-30个核苷酸长或18-50个核苷酸长。典型的引物包含15-25个核苷酸。这些引物与CCAT-I转录物或其对应cDNA的序列相同或互补。这是这些引物与CCAT-I转录物或其片段杂交的原因。将之前获自生物样品的mRNA或其对应cDNA与引物、核苷酸和聚合酶按照已知的PCR方案混合。混合物经历一系列温度循环。当CCAT-I转录物或其对应的cDNA存在于混合物时，引物将杂交，CCAT-I转录物将以指数扩增。当CCAT-I转录物不存在时，则不会观察到可检测的扩增。扩增产物可通过本领域熟知的许多程序检测，例如，通过凝胶电泳。当从生物样品中回收到小量转录的多核苷酸时，PCR是有利的。本发明还提供适于旨在扩增CCAT-I转录物的PCR反应的多核苷酸引物。根据本发明，可以组装用于检测生物样品中CCAT-I转录物的存在的诊断试剂盒。此类诊断试剂盒包含适于检测CCAT-I的试剂。作为非限制性实例，此类试剂盒包含至少一种寡核苷酸探针和/或至少一种寡核苷酸引物。通常，本发明的试剂盒还包含所用试剂的容器。另外，这些试剂盒可包含核苷酸大小标志物以用于凝胶分析中来确定检测的核酸的大小。本发明的试剂盒可另外包括进行测定的说明和方案。还可提供阳性对照和阴性对照作为试剂盒组件的一部分。在另一种实施方案中，确定样品中是否含有表达CCAT-I的细胞是通过对从生物样品中提取的mRNA进行RNA印迹分析。RNA印迹分析是本领域技术人员已知的方法。参见，如Sambrook等人，(1989)MolecularCloningALaboratoryManual(分子克隆实验室手册)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.另外，mRNA提取、通过电泳的mRNA分离、印迹分析、探针和引物制备和杂交技术是已知的，并且进行这些技术的材料是商业可获得的。信使RNA可通过例如使用polydT柱来提取，并且材料通过电泳分离，并，例如，转移到硝酸纤维素纸上。标记的探针通常用于显现固定于所述纸上的mRNA的存在。这些探针具有与CCAT-I转录物或其片段互补的核苷酸序列。为此，SEQIDNO:1中的序列信息可用于制备探针或分离和克隆CCAT_1转录物。此类探针为至少8、15、30、40或100个核苷酸的段。探针可以是DNA或RNA，它优选地为单链，并且通常应与SEQIDNO:1的相应片段具有至少65%的序列同源性。探针可在报道子分子的存在下使用寡标记或PCR扩增产生。含有CCAT-I的cDNA或其片段的载体可用于产生信使RNA探针，例如通过加入RNA聚合酶和标记的核苷酸。本领域技术人员可用商业可获得的试剂盒和材料来进行这些过程。杂交的严格性通过许多因素诸如探针内的GC含量、温度和盐浓度确定。特别地，严格性可通过降低盐浓度或提高杂交温度而增加。在高严格性下，杂交复合体将仅在核酸高度互补时保持稳定。杂交的条件是本领域技术人员熟知的，如参见Sambrook等人，如上所述。本发明的试剂盒可因此含有有用的试剂来实施RNA印迹技术以检测生物样品中CCAT-I转录物的存在。该试剂盒任选地包含可用作探针以与转录的CCAT-I或其片段杂交的寡核苷酸。探针可以被放射性标记。还可任选地提供阳性对照和阴性对照以及适当的大小标志物。用于检测CCAT-I转录物的存在的另一技术是通过寡核苷酸杂交。多核苷酸的杂交是本领域技术人员已知的。此方法也采用含有与CCAT-I转录物的核苷酸序列杂交的特异性核苷酸序列的可检测的探针。来自生物样品的RNA通常被固定于滤纸或类似材料。加入探针并保持在仅当探针适当地与固定的材料互补时允许杂交的条件下。这些条件应具有足够的严格性以洗掉与固定的材料部分杂交的探针。在滤纸上检测到探针表明CCAT-I转录物的存在。用于杂交测定的探针包含与CCAT-I基因转录物的序列互补的至少8、12、15、20、30、50或100个核苷酸。SEQIDNO1中公开的序列信息可被本领域技术人员用于制备本发明的探针。可优化杂交过程的条件以使样品中不完全互补的多核苷酸造成的背景信号最小。本发明因此还包括可用作寡核苷酸杂交的探针的标记的寡核苷酸。标记的探针涵盖放射标记的核苷酸或通过可容易获得的系统以其它方式可检测的探针。标记的探针通常包括通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可测量的标记。作为非限制性实例，此类标记可包含放射性物质(32P、35s、3H、125I)、荧光染料(洋地黄毒苷、荧光素、5-溴脱氧尿苷(bromodesoxyuridin)、乙酰氨基芴)、生物素、纳米颗粒和类似标记。此类寡核苷酸通常在其3’和5’端标记。特别地，与CCAT-I或其序列的任何部分互补的转录物(例如SEQIDNo4)可被轭合至荧光探针，包括但不限于可见范围内的荧光标签(例如€￥3.0或€￥5.0)或近红外范围的探针(例如Cy5.5)，以用于体外或体内检测或成像结肠癌或直肠癌和肺癌。另夕卜，与CCAT-I或其序列的任何部分互补的转录物可被轭合至或掺入到纳米颗粒、微颗粒或脂质体以检测或成像癌症。与CCAT-I或其序列的任何部分互补的转录物可被轭合至放射性同位素以检测或成像癌症。与CCAT-I或其序列的任何部分互补的转录物可被轭合至合成的聚合物以检测或成像癌症。与CCAT-I或其序列的任何部分互补的转录物可被轭合至其它生物剂，包括但不限于抗体、毒素或其它肽，以检测或成像癌症。可装配对进行本发明的杂交方法有用的试剂盒。这些试剂盒还提供与CCAT-I转录物杂交的标记的寡核苷酸。在一种实施方案中，所述标记的探针是放射标记的。还可在所述试剂盒中包括阳性对照和阴性对照以及大小标志物，诸如多核苷酸序列梯。这些试剂盒还可包含用于进行所述测定的说明。本发明的杂交技术还涵盖原位杂交以检测生物样品诸如组织切片中表达CCAT-I的细胞。因此，本发明还涉及可用于进行原位杂交的探针。这些探针被设计为与生物样品中存在的互补核酸序列杂交。可使用荧光显微镜来显现荧光标志物标记的探针。为此，本发明还提供用于进行原位杂交的试剂盒。原位杂交可用于检测组织切片中CCAT-I的mRNA序列。可使用荧光标志物来检测对应于CCAT-I转录物或其互补序列的序列。本发明还涉及重组载体，包括包含CCAT-I基因转录物、其片段或互补序列的表达载体。本发明还涉及包含此类载体的宿主细胞，并涉及使用此类重组细胞表达CCAT-I的方法。宿主细胞的实例包括酵母细胞诸如酿酒酵母(S.cerevisiae)、昆虫细胞诸如草地贪夜蛾(S.frugiperda)、细菌诸如大肠杆菌(E.coli)和哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。本发明还提供一种分离的寡核苷酸，其包含CCAT-I基因转录物(SEQIDNO1)或其片段的序列。特别地，本发明涉及与SEQIDNO:1具有至少85%同源性的分离的寡核苷酸。本发明涉及分离的CCAT-1，包括其片段。本发明的重组表达载体可用于转化宿主以制备用于制备本发明的分离的寡核苷酸的重组表达系统。表达载体可含有转录控制元件(如启动子和增强子)。这些元件可选自多种来源，其根据它们在特定宿主中的效率选择。使用重组DNA技术或合成技术将载体、cDNA和调节元件合并在一起。本领域技术人员可通过使用商业可获得的表达载体引入此类包含本发明的CCAT-I多核苷酸的分子，以用于熟知的表达系统，诸如本文描述的那些。除了通过重组技术产生这些多核苷酸分子之外，还可采用自动化核酸合成仪来生产CCAT-I或其片段。此类技术是本领域技术人员熟知的。CCAT-I转录物、相应于CCAT-I的cDNA、其片段、寡核苷酸、以上任何的互补RNA和DNA分子以及PNA可用于检测或测量差异的CCAT-I表达、增加的表达水平。这些测量可监测治疗干预过程中的mRNA水平。其还可用于本发明的诊断程序或实际的预后确定。这些测量还可用于分期癌症组织诸如CRC或肺癌。与差异表达相关的癌症包括特异性结肠癌或直肠癌以及肺癌。诊断测定可使用如上文所述的杂交或扩增技术。它们可用于比较获自患者的生物样品与标准样品中的基因表达，以检测CCAT-I的差异基因表达或增加的表达水平。用于此比较的定量方法是本领域技术人员熟知的。特别地，可使用定量PCR(qPCR)或实时定量PCR(RT-qPCR)分析来定量生物样品中的CCAT-I表达水平。简要而言，实时定量PCR在扩增过程中提供同步的监测。随着扩增产物随程序继续而积累，其被连续地检测。定量PCR和RT-qPCR是本领域技术人员已知的程序。作为非限制性实例，标记的探针可与从获自患者的生物样品制备的核酸混合。将混合物保持在形成杂交复合体的条件下。特定的培养之后，漂洗样品，并定量杂交复合体的信号量。还可将信号与标准值进行比较。与正常标准相比获自个体的生物样品中更高的CCAT-I信号指示癌症(如CRC或肺癌)。为了提供用于建立CCAT-I的差异表达或增加的表达的标准，评估了正常和疾病的表达水平。使取自正常受治疗者的核酸样品和与CCAT-I互补的寡核苷酸探针在允许杂交的条件下反应。然后测量杂交复合体的量。可将以此方式获得的标准值与获自受测试个体的生物样品的值进行比较。标准水平可通过测量未患癌症的个体(称为“正常受治疗者”)中的CCAT-I表达确定。可选地，标准水平可根据生物样品中的参考基因的表达水平确定，所述生物样品任选地为受测试个体的生物样品。参考基因可以是看家基因，诸如本文中示例的看家基因(如GAPDH)。因此可通过与参考基因的表达水平相比的CCAT-I表达比值的增加或以其它方式标准化的CCAT-I表达测量值的增加来鉴定生物样品中的差异CCAT-I表达。标准还可通过比较组织与视为没有癌症的周围组织(也称为“非癌组织”或“正常组织”)中的CCAT-I水平来确定。在一些实施方案中，本发明的CCAT-I引物和/或探针可配制成多种形式，包括溶液、悬浮液、乳液或冻干粉末。制剂通过通常使用的技术灭菌。在另一方面，本发明提供一种寡核苷酸的阵列，其包含具有多个区段的基质，其中至少一个所述区段包含与CCAT-I或其片段杂交的探针。在特异性实施方案中，阵列包含本发明的探针，如SEQIDNO:5。实施例本文下面提供的实施例例证了本发明，但不意图限制本发明的范围。实施例1CCAT-I的发现患者、细胞系、组织和RNA结肠癌细胞系HT-29和SK-CO-IO获自ATCC(Manassas，VA)。HT29用于制备代表性差异分析(Representationaldifferenceanalysis,RDA)实验的待测RNA。结肠癌和相邻的正常组织样本获自由LudwigInstitute维持的组织库(#4至29)或Hadassah-Hebrew大学医学中心的组织库(#96-218)。所有样品来自经历外科肿瘤切除并签署经设施内伦理委员会(InstitutionalReviewBoard(IRB))批准的书面知情同意书的患者。总RNA通过异硫氰酸胍/CsCl梯度纯化方法或Trizol试剂(Sigma-Aldrich，St丄ouis，MO)获得。正常组织RNA板获自Clontech(Mountainview,CA)。RDA和cDNA克隆代表性差异分析(RDA)如先前所述地进行(4)。HT29构成待测RNA。对于驱动RNA(driver)，RNA汇集自三种正常的结肠组织。利用Tsp509I或DpnII作为限制性内切核酸酶进行三轮扩增。分离和测序第二和第三扩增循环后产生的片段。使用通过RDA鉴定的部分长度CCAT-I转录物在λ-ZAPII载体系统(Stratagene，LaJolla,CA)中筛选HT29cDNA文库，由此获得全长cDNA。CCAT-I基因转录物和表达从HT29cDNA文库克隆的全长CCAT-IcDNA长2528bp。该转录物对应于跨越nt.1-194和195-2528的两个外显子，如通过针对两个带有约9kb的长内含子的染色体_8基因组克隆(AC027531和AC020688)的BLAST分析所揭示的。该cDNA与在畸胎癌(5)中鉴定的AK125310相同。与AK125310相比，CCAT-I缺乏其5，-端的86个核苷酸，并在3’具有附加的313个核苷酸。CCAT-I(SEQIDNO.1)的完整序列为GCCTTAATAGCTAGCTGGATGAATGTTTAACTTCTAGGCCAGGCACTACTCTGTCCCAACAATAAGCCCTGTACATTGGGAAAGGTGCCGAGACATGAACTTTGGTCTTCTCTGCAATCCATCTGGAGCATTCACTGACAACATCGACTTTGAAGTTGCACTGACCTGGCCAGCCCTGCCACTTACCAGGTTGGCTCTGTATGGCTAAGCGTTTTCTCCTAAAATCCCTTGAAAACTGTGAGAAGACCATAAGAAGATCATATCTTTAATTCTATTTCACAAGTCACACAATATTCCAATCAAATACAGATGGTTGAGAAAAGTCATCCATCTTCCCTCCCCACCCTCCCACAGCCCCTCAACCACTGCCCTGAAACTTATATGCTGTTATCCGCAGCTCCATCTGGAGCATCACAGCTACTGTCAACCCTGACGCTCTTTCTGAAAAAACACCGGATGGACATCAGAACTATTTCTTTAAGGATGTTACTGAGCCACACAGGAAAACTTGCCTTATGATTTTGAATGCACGGATCTGATTTGACTAAACATGATAACTAGAGAATCACCCAATCTACTCCCATTTTCAACTCTAAATCATCAGAGTGTCTCAAATCCAAAGCACACACAGACCAGCCTGGCCAACACGGTGAAACTCCACCCCTACTAAAAGTATAAAAATTATCCAGGTGTGGTGGCGGGCGCCTGTAATCCAAGCTACTTGGGAGTCTGGAGGCAGGAGAATCCCTTGAACCTGGGAGATGGAGGTTGCAGTGAGCAGAGATCACACCACCGCACTCTAGCCTGGGCCACAAATCAACAACAACAACAACAACAAAAAACAAAGCGCACACAGAGACTGAGGTCCTCTTTGGCATTGAGAAGATGGCTATGCAAGTCCCAACTAGCAAGTGCAAACTTCCCAGCTTCACTTCTGCCAGTGTCCCTTCACCCCTTCTCAACCCCACTGGGAGGCAGGAGGGTGCTTGACAATAACAGCCTTGGCATCACTCTGCCAGGGTGTAATAGGAACTGTTACAATTCTGAGATTCTGTGTAAGCACTGGCCTTTCTGCCTAGAATGCCTTCTCCTCTCTTTTTTAACTGCATGCTCCTATTTATCTTTCAAAGCCCGGAAAAAATAACACTGCACACGGGAAATGCTCCCTTCCTACTGCAGTCATTTAGATGACTCTATGCCATTCCATTCATTTCTCTTTCCTACCACAGAAGTGCTTTGAGATTTTGGAGTCAGACTGCTTGAACTTGAATCCTGGCCCTCTCATCAGAGACTTGACTTATTTTAGGCAAGTTATATAACCAATTTTACCTCAGTTCCTTACCCATAAAATGGGTCTAATGAGAGTACCTACCACACAGAATTTTGATGAAAACTGAATGAGATGAAGGCCTTTAAGGCAGTGGTCCCCAACCCTGGGGACACAGACAGGTACCATTTTGTGGCCTGTTAGGAACTGGGCCACACAGCAGGAGGTGAGCAGTGGGTGAGTGAGATCAGCGTTATTTACAGCTGCTCCCCATTGCTCACCTTACTGCCTGAGCTCCACCTCCTGTCAGATCAGCAGTGGCATTAAATTCTCATAGCAGCACAAACCCTGTCATGAACTGCACATGCGAGGGATCTAGGTTGTGCGCTCCTTATGAGAATCTAATGCCTAATGACCTGTCACCGTCTCCCATCACCCCTAGATGGGAGTGTCTAGTTGCAGGAAACAAGCTCAGGGCTTCCACTGATTCTACATTATGGTGAGTTGTATAATTATTTCATTATATAATACAATGTAATAATAATAGAAACACAGTGCACAACAAATGTAATGTGCTTGAATCATCCCCAAACCATCCCAGTCCACGGTCTTCCACATTTTGTCTTTTCACAAAATTGTCTTCCACAAAACTGGTCCCTGGTGCCAAAAAGGCTTGGGACCACTGCTTTAAAGCCTTTGCATAGTGCTTAGAATTGAGGGGGAAAAAAAAAACAAAAACAATGTAGCTAGTTGCTACAATCACTATATTGGTGAGTTTCAAAAGGAAAAGAATTCTGTCCCATTTATGCTTGAGCCTTGAGTTGCTAACCAAGCCTGACACAAAATTACTGTTGAAGGGATGTGTGAGTCCTAATTGAAATGAGGCCTCTTAAGGGAATTGTGGACCAAACCCCAAGCAGGCAGAAAGCCGTATCTTAATTATTGCAAGTATTTCAGGCAAGGTGTGGATGGCCATTTGAATTCAAGCAGACTAGGACCTGGGATGAGAAAGAAGGTGTGTACGTGACTTGATCTTTGAACTTTAGCTCACCATCTGGAAGAAGGCTGAGTATTCTCTGCACTCACATAGTAGCTAATGCCTACTCCCCAGCCACCCACAATTCTTTCTGTAGGAAGGCTCGCTAGAATACTTTGTGATATTGGATATTAGTTCCATATTCTACTGTGTATCTTAGTTCAACCAAATTGTAATCATCTGATATTTATTTCTTTTAATATAAATATAAGTATATTAAGTCTTAAAAAAAAAAAAAAAA实时RT-PCRIyg总RNA用于10μ反应中的反转录，其中2μ1用于PCR。所有实验进行两个重复或三个重复。PCR使用以下引物进行45个循环(变性95°C，15秒钟；退火/延伸60°C，1分钟)正向引物5，-TCACTGACAACATCGACTTTGAAG(SEQIDNO:2)；反向引物5，-GGAGAAAACGCTTAGCCATACAG(SEQIDNO3)；探针(SEQIDNO4)6Fam-CTGGCCAGCCCTGCCACTTACCA_Tamra。根据生产商的说明进行绝对定量(PEBiosystems,UserManual2(用户手册2))。GAPDH基因用作参考基因。相应地，每个样品根据其GAPDH含量(表达水平)以及针对校准物(SK-CO-IO)被标准化。相对量通过下式确定2(AC1ccat.i-AC:1sk.cxmo)。绘制相应于含有CCAT-lcDNA的质粒DNA的稀释液的标准曲线，并使用该曲线确定SK-CO-IO中CCAT-ImRNA的量。将此因子乘以各样品的相对量以获得作为fg/lOOngcDNA的CCAT-I量。所有实验使用ABIPrism7000系统(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)进行。实施例2正常组织以及结肠和直肠的腺癌中的CCAT-I表达通过定量实时PCR检验了一组18种正常组织中CCAT-I的表达(图1)。CCAT-I表达在0.008fg(骨骼肌)至肾中的402fg范围内。与SK-CO-IO相比，正常组织中的CCAT-I水平低20-倍(肾)至超过350-倍(结肠)。相反，肿瘤组织中的平均CCAT-ImRNA水平为2090fg(p<0.0001,与正常的结肠相比)，并在280fg(27)至超过8000fg(ll)范围内，图2。在与肿瘤相邻的正常组织中，平均CCAT-ImRNA水平为587fg(p=0.04，与正常的结肠相比)，并在0.1fg(N29)至6631fg(N14)范围内，图2。在图2中，研究了肿瘤和相邻的正常组织的配对样品。实施例3外周血单核细胞(PBMC)中的CCAT-I校准曲线此研究部分的所有实验使用ABIPrism7500系统(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)进行。为了对给定样品中的CCAT-I含量定量测量，生成了校准曲线。结肠癌细胞系HT-29和COLO-205获自ATCC(Manassas，VA)。外周血单核细胞(PBMC)获自10位健康志愿者的外周血。PBMC通过菲可(Ficole)梯度方法分离，并在_70°C储存。将PBMC和结肠癌细胞以结肠癌细胞的增加的浓度混合(1IXlO6,15X105、1IXlO5,15X10\1IXlO4,15X103、1IXlO3,1500、1100、150、110、11，和纯的结肠癌细胞)。提取RNA并进行CCAT-I的实时PCR。为了研究CCAT-1的RT_PCR对检测小群体癌细胞的敏感性，我们生成了校准曲线(图3-5)。将增加的浓度的结肠癌细胞系(HT29)细胞与IO6个PBMC混合。癌细胞检测的最低阈值为IO6个PBMC中5个癌细胞的浓度(图3)。实施例4:正常结肠粘膜、前恶性(pre-malignant)粘膜、腺瘤性息肉、结肠原发性腺癌和远端转移灶中的CCAT-I表达将获自由于良性疾患经历结肠切除的患者的正常结肠粘膜样品、与结肠腺癌位点相邻的正常粘膜样品、腺瘤性息肉样品、结肠或直肠的原发性腺癌样品以及来自肝或腹膜转移灶的样品在液氮中急速冷冻。从所有组织样品中按照先前所述提取RNA并进行CCAT-I的实时定量PCR(图6)。实施例5:结肠癌患者的血液和淋巴结中隐性转移疾病的检测患者年龄超过18岁的具有组织学证实的结肠原发性腺癌的患者被提供参与此研究。具有远端转移灶的患者或者接受在先放疗或化疗的患者被排除在研究外。研究方案得到InstitutionalReviewBoard(IRB,HelsinkiCommittee)Hadassah-Hebrew大学医学中心的批准。获得了所有研究参与人员的书面知情同意书。哨兵淋巴结定位和收获患者经历包括含有引流淋巴系统的正常楔形肠系膜的结肠腺癌的标准外科切除。取出外科样本(结肠和肠系膜)之后，立即使用结核菌素注射器和针头在肿瘤周围的四个象限浆膜下注射(活体外)2-5ml异舒泛蓝染料(PatentBlueV，France)然后在后桌(backtable)上评估肿瘤和淋巴结的总体切除，并解剖肠系膜的所有蓝色结。活体外鉴定SLN之后，将沿着结的纵轴通过门(hihim)划分的一半SLN在液氮中急速冷冻。原发性肿瘤的一小部分(整个肿瘤体积的25%)和正常粘膜的少量样品(0.5克)相似地急速冷冻。使用单独的仪器进行活体外SLN和原发性肿瘤切除，以使结的肿瘤细胞污染最小。病理学处理和细胞角蛋白免疫组织化学带有附着的肠系膜的原发性肿瘤样本和剩余的一半SLN作为分别标记的样本被提交至Hadassah-Hebrew大学医学中心病理学系。一旦证实结肠腺癌的诊断，福尔马林固定、石蜡包埋的蓝色结即经受大约40μm厚度的四个水平(level)的连续步骤切片，并用H&E染色。此外，在块的第二和第四水平制备两个未染色的载玻片以用于免疫组织化学染色，一个用于细胞角蛋白抗体染色，另一个充当阴性对照。使用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物方法对福尔马林固定和石蜡包埋的SLN切片进行免疫组织化学。商业获得的细胞角蛋白抗体混合物用于此研究(广谱角蛋白(Pan-keratin)AE1/AE3，CAM5.2，35bHll,VentanaMedicalSystems,Tucson,AZ)。内源过氧化物酶通过与过氧化氢一起培养来抑制。二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB，Biogenex,SanRamon,CA)用作色原体。福尔马林固定、石蜡包埋的扁桃体切片用作阳性对照，并将来自SLN块的一个切片与阴性对照缓冲液一起培养。对来自SLN的每个组织块检查了总计四个H&E和两个细胞角蛋白免疫染色切片。如果鉴定了展示结肠癌细胞的解剖学和细胞学特征的强烈阳性的单个细胞或细胞群集，则细胞角蛋白免疫染色被视为阳性。实施例6哨兵淋巴结中的细胞角蛋白-20、CCAT-I的RT-PCRRNA提取所有样品(肿瘤、淋巴结、血液和正常组织)的总RNA提取通过TriReiigent方法进行。在合成cDNA之前，在凝胶上运行产物以评估RNA质量。将冷冻样品在干冰中粉碎，使用Polytron勻浆机在Trireiigent(molecularresearchcenter,inc.,Cincinnati,oh,usa)中勻浆，并根据生产商的说明进行处理。实时RT-PCRIyg总RNA用于20μ1反应中使用随机引物的反转录，其中2μ1用于PCR。所有实验进行两个重复。PCR进行40个循环(变性95°C，15秒钟；退火/延伸60°C，1分钟)，使用CK20特异性引物和Taqrnan探针(AppliedBiosystems，如所需地测定)。对于CCAT-I表达分析，使用的引物如上文所述。每种样品根据其GAPDH含量进行标准化。针对CK20表达计算对校准物的相对定量。因为在淋巴结和外周血淋巴细胞中，CCAT-I阴性样品即使通过实时PCR在绝对量上也是不可检测的，所以相对量确定是无关的，并且分析的样品仅评估为此转录物表达的阳性或阴性。这部分研究的所有实验使用ABIPrism7500系统(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)进对亍。提取RNA，并对CCAT-I进行实时PCR。结肠癌患者的哨兵淋巴结中的CCAT1表达对所有肿瘤和SLN组织以及获自无恶性肿瘤患者的2个正常淋巴结和获自健康个体的3个PBMC样品进行实时PCR。所有五个阴性对照中无CCAT-I的表达并且仅有痕量CK20。因此，对于CK-20值，“阳性”PCR被设置为与阴性对照值相比RNA含量高50倍，并且因为阴性对照没有CCAT-I的扩增，我们使用具有CCAT-I含量的每个SLN作为阳性。通过H&E在7/44患者中、通过CK的IHC在14/44患者中(通过卡方检验，与H&E相比ρ<0.0001)和通过PCR在23/44患者中(通过卡方检验，与H&E相比ρ=0.006,图6，表1)鉴定了具有CRC转移灶的哨兵淋巴结。所有H&E阳性SLN通过CK的IHC和通过PCR也是阳性。但是，在仅通过CK的IHC为阳性的七个SLN18中，四个还是通过PCR阳性的。通过H&E和IHC为阴性的另外12个SLN通过PCR为阳性(图7)。呈现了CK-20和CCAT-I的qPCR扩增曲线(图8_9)。与CCAT-1相比，通过CK-20扩增了更高量的cDNA。表1通过检测方法，SLN中CRC转移灶的存在权利要求1.一种诊断癌症或癌前病变的方法，包括测量生物样品中SEQIDNO.l(CCAT-I)或其片段的表达水平；其中所述生物样品中SEQIDNO.l(CCAT-l)或其片段的表达指示癌症或癌前病变。2.根据权利要求1所述的诊断癌症或癌前病变的方法，其中所述方法还包括将在所述生物样品中测量的所述表达水平与标准进行比较，其中所述生物样品中SEQIDNO.l(CCAT-I)或其片段的更高的表达水平指示癌症或癌前病变。3.根据权利要求2所述的诊断癌症或癌前病变的方法，包括(a)从获自受治疗者的生物样品中分离核酸；(b)将能够识别CCAT-I的探针与所述核酸在允许形成杂交复合体的条件下杂交；和(c)将杂交复合体形成与标准进行比较；其中所述生物样品中更高水平的杂交复合体指示癌症或癌前病变。4.根据权利要求2所述的诊断癌症或癌前病变的方法，包括(a)从获自受治疗者的生物样品中分离核酸；(b)在所述分离的核酸中扩增CCAT-I或其任何片段；(c)显现CCAT-I扩增产物；和(d)将CCAT-I扩增产物的量与标准进行比较；其中更高水平的CCAT-I扩增产物的存在指示癌症或癌前病变。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述扩增通过使用CCAT-I特异性探针的聚合酶链式反应(PCR)进行。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述PCR是实时定量PCR。7.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述标准是通过测量未患癌症的受治疗者中CCAT-I的表达水平而确定的。8.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述标准是通过测量所述同一受治疗者的非癌组织中CCAT-I的表达水平而确定的。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症选自以下组成的组结肠癌、直肠癌、肺癌和所述癌症的转移灶。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌前病变是腺瘤性息肉。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自以下组成的组组织、血液、尿、粪便和骨髓样品。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物样品是组织活检。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达水平是通过原位杂交测量的。14.一种分离的寡核苷酸，包含SEQIDNO:1(CCAT-I)或其互补序列的至少8个连续核苷酸。15.根据权利要求14所述的分离的寡核苷酸，其用作探针或引物。16.根据权利要求15所述的寡核苷酸探针，其中所述探针包含SEQIDNO:5。17.根据权利要求14-16中任一项所述的分离的寡核苷酸，其用于检测生物样品中的CCAT-I表达。18.根据权利要求14-16所述的分离的寡核苷酸，其用于诊断癌症。19.一种用于检测生物样品中CCAT-I的表达的方法，包括(a)从所述生物样品分离核酸；(b)将权利要求15或权利要求16所述的寡核苷酸探针与所述核酸在允许形成杂交复合体的条件下杂交；和(c)将杂交复合体形成与标准进行比较，其中生物样品中更高水平的杂交复合体指示样品中CCAT-I的表达。20.根据权利要求19所述的方法，还包括在杂交之前扩增所述生物样品中转录的核酸。21.—种分离的核酸，包含与SEQIDNO:1具有至少85%同源性的CCAT-I或其片段。22.根据权利要求21所述的分离的核酸，包含SEQIDNO:1或其片段的核酸序列。23.—种组合物，包含权利要求14、15、17或18所述的分离的寡核苷酸、权利要求16所述的分离的寡核苷酸探针、或者权利要求21或22所述的分离的核酸。24.一种载体，包含权利要求21或22所述的分离的核酸。25.—种宿主细胞，包含权利要求24所述的载体。26.根据权利要求23所述的组合物，其中所述组合物被连接至基质。27.—种试剂盒，被划分以容纳用于测量获自受治疗者的生物样品中的CCAT-I表达水平的至少一种试剂，所述至少一种试剂包含与CCAT-I转录物的至少一种片段杂交的至少一种寡核苷酸探针或引物。28.—种阵列，包含具有多种区段的基质，其中所述区段中的至少一种包含与CCAT-I或其片段杂交的探针。29.—种癌症或癌前病变的成像方法，包括(a)向受治疗者施用根据权利要求15或16所述的探针；其中所述探针轭合至指示分子；和(b)通过成像装置检测轭合至所述探针的指示分子。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述指示分子选自以下组成的组放射性同位素、荧光染料、可见染料或纳米颗粒。全文摘要本发明涉及在癌细胞中，特别是在结肠癌、直肠癌和肺癌中以及在癌前病变中，特异性表达的称为结肠癌相关的转录物1(CCAT-1)的独特核酸转录物的鉴定、分离和测序。本发明由此提供通过检测CCAT-1的表达而诊断癌症的方法，以及用于本发明的检测方法的分离的多核苷酸、组合物和试剂盒。文档编号C12Q1/68GK102027128SQ200980107452公开日2011年4月20日申请日期2009年2月11日优先权日2008年2月11日发明者A·O·古雷,A·尼桑,G·里特,H·R·弗罗因德,L·J·欧德,M·罗斯泰彻尔,S·麦翠尼-罗森鲍姆,T·佩雷茨-亚布隆斯基申请人:哈达斯特医学服务与开发有限公司,路德维格癌症研究所