专利名称：产生γ-氨基丁酸的方法
产生Y-氨基丁酸的方法本发明涉及通过培养表达具有谷氨酸脱羧酶活性的酶的重组微生物发酵产生 Y-氨基丁酸(GABA)的新方法。本发明还涉及对应的重组宿主、重组载体、适于制备此类宿 主的表达盒和核酸以及利用发酵产生获得的GABA制备聚酰胺的方法。
背景技术：
GABA(CAS号56_12_2)是在原核和真核生物中普遍存在的重要非蛋白质氨基酸。 其显示不同的生物机能，例如交感神经系统中代表性的抑制性神经递质，并且其有效降低 实验动物和人的血压。该化合物由谷氨酸脱羧酶(GAD ；EC 4. 1. 1. 15)从谷氨酸合成。GABA用于不同技术领域。例如，富含GABA的食品可用作食物添加物和营养剂来帮 助治疗失眠、抑郁和自主神经系统障碍、慢性酒精中毒相关症状以及激活免疫细胞。该化合 物还可用作生产聚酰胺和吡咯烷酮的原料。发酵产生该具有商业价值的化合物的合适方法尚未有记载。因此，本发明的目的是提供发酵产生GABA或其相应盐的合适方法。
图1显示来自马铃薯EST的叠连群(contig)与来自植物的GAD同源物的比较。图2显示本发明的嵌合GAD基因的示意图。图3显示pClik5aMCS克隆载体的质粒图。
发明内容
通过本发明教导GABA或其盐的发酵产生解决了上述问题，该发酵生产通过培养 表达GAD酶的重组谷氨酸产生微生物实现，该酶将该微生物中形成的谷氨酸转变为GABA。
具体实施例方式1.优选实施方案本发明涉及发酵产生Y-氨基丁酸(GABA)的方法，该方法包括培养优选衍生自具 有产生谷氨酸能力的亲本微生物的重组微生物，该重组微生物定性地或定量地保持该亲本 微生物的该能力，还具有表达异源谷氨酸脱羧酶(E. C. 4. 1. 1. 15)的能力，由此谷氨酸转变 为GABA ；以及该方法任选地包括将GABA从发酵液中分离。该经修饰微生物还可以或可以 不保持其产生谷氨酸的能力。特别地，该微生物是谷氨酸产生细菌，特别是棒杆菌，例如棒杆菌属 (Corynebacterium)的细菌，例如谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。该异源谷氨酸脱羧酶是原核或真核来源的。在一个具体实施方案中，该异源谷氨酸脱羧酶是植物谷氨酸脱羧酶或嵌合谷氨酸 脱羧酶，其包含至少一个来源于植物谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列部分。该“至少一个来源于 植物谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列部分”包含该植物酶的至少十个连续氨基酸残基。总计，可能有1至10个，特别地，1至5个，优选1或2个的氨基酸序列部分来源于该植物序列。该 部分的每一个可具有10至500、10至450、10至400、20至350、40至300、50至250、60至 200,70至150或80至100个该植物酶的连续氨基酸残基。特别地，该异源谷氨酸脱羧酶是茄属(Solanum)植物的脱羧酶，特别是马铃薯 (Solanum tuberosum)，即土豆。例如，该异源谷氨酸脱羧酶来自马铃薯，包含SEQ ID NO: 2的Thr94至Leu336的氨基酸序列，或者与其具有80%至小于100%同一性的序列，例如 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性。另外，该异源谷氨酸脱羧酶可以在N端和/或C-端添加来自马铃薯谷氨酸脱羧酶 的对应末端氨基酸序列，或者在N端和/或C端添加不同于马铃薯的第二植物的谷氨酸脱 羧酶的对应末端氨基酸序列。例如，该第二植物是番茄，即西红柿。在一个特别实施方案中，该异源谷氨酸脱羧酶包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列， 或者与其具有80%至小于100%同一性的序列，例如85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的序列。根据本发明的另一个实施方案，该异源谷氨酸脱羧酶是细菌谷氨酸脱羧酶，例如 来自埃希氏菌属(Escherichia)的细菌，特别是大肠杆菌(E. coli)。该大肠杆菌谷氨酸脱羧酶可选自SEQ ID NO 6的GadA，包含SEQ IDNO 8的GadB 以及SEQ ID NO :9的GadC的GadBC复合物，以及分别与GadA或GadBC具有80%至小于 100%同一性的序列。合适序列可具有，例如85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%或99%的同一性。在另一个实施方案中，具有谷氨酸脱羧酶活性的酶由核酸序列编码，其经调整适 于具有产生谷氨酸能力的该亲本微生物的密码子使用。特别地，具有谷氨酸脱羧酶活性的酶可由包含选自下列的编码序列的核酸序列所 编码a)根据 SEQ ID NO 1 的 472 至 1200 位或者根据 SEQ ID NO 1 的 193 至 1605 位；b)SEQ ID NO 5 ；c)SEQ ID NO 7 ；d)或者编码如上定义的谷氨酸脱羧酶的任何编码序列。本发明还涉及如上定义的谷氨酸脱羧酶；以及包含此类谷氨酸脱羧酶编码序列的 核酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供了表达盒，其包含至少一种如上定义的核酸序 列，其序列与至少一个调控核酸序列有效连接；以及包含至少一个此类表达盒的重组载体。本发明还涉及原核或真核宿主，其由至少一个如上定义载体转化；特别地涉及选 自重组棒杆菌的宿主，特别是重组棒杆菌属，例如重组谷氨酸棒杆菌。最后，本发明涉及制备聚合物，特别是聚酰胺的方法，该方法包括a)由如上该方法制备GABA ；b)分离 GABAjPc)聚合该GABA，任选地在至少一种其他的合适多价可共聚共聚用单体存在下进 行，该共聚用单体例如选自氨基羧酸和羟基羧酸。2.特定术语的说明
除非另有说明，认为表述“ Y-氨基丁酸”和“GABA”是同义的。本发明得到的GABA 产物可以是游离酸的形式，该酸性与碱性官能团的部分或完全盐的形式，或者非带电酸和 其任何盐混合物的形式或者混合物。GABA “盐”包括例如金属盐，例如GABA的单-或二-碱金属盐，如单钠或二钠、单 钾和二钾盐，以及碱土金属盐，例如钙盐或镁盐或者质子化形式的GABA。“失调”理解为其广义形式，包括通过本领域技术人员公知的不同方式使得酶(目 标酶)活性完全关闭的增加或减少。合适方法包括例如生物体中基因和/或酶分子拷贝 数的增加或减少，或者影响其酶活性的酶另一个特征的修饰，随后其导致对所研究代谢途 径的预期效应，特别是谷氨酸生物合成途径或者与其偶联的任何途径或酶促反应。合适的 基因操作还可包括但不限于改变或修饰与特定基因表达相关的调控序列或位点(例如通 过除去强启动子、可诱导启动子或多个启动子)、修饰特定基因的染色体定位(location)、 改变邻近于特定基因(例如核糖体结合位点或转录终止子)的核酸序列、减少特定基因的 拷贝数、修饰参与特定基因转录和/或特定基因产物翻译的蛋白质(例如调节蛋白、阻抑基 因、增强子、转录激活物等)，或者本领域技术中常规的任何其他失调特定基因表达的传统 方法(包括但不限于使用反义核酸分子或敲除或阻断靶蛋白表达的其他方法)。术语“异源”或“外源”指引入或通过本文定义的遗传操纵微生物产生(转录或翻 译)的本文该蛋白质、核酸和对应序列，该微生物在该操纵之前不含有或不产生该序列。特 别地，该微生物在该操纵之前可不含有或表达该异源酶活性，或者可含有或表达具有相当 活性或特异性的内源酶，其由不同的编码序列或者由不同氨基酸序列的酶编码，该内源酶 可转化与该外源酶相同的一个或多个底物。本发明的“亲本”微生物是具有产生谷氨酸能力的任何微生物。“来源于亲本微生物”的微生物指通过任何类型的操纵修饰的微生物，该操纵选自 的、生物化学的或微生物学的方法，特别是遗传工程方法。该操纵导致该亲本微生物的生物 学特征发生至少一种变化。例如，可将异源酶的编码序列引入该生物体。通过该变化，可将 至少一种特征加入该亲本微生物、将其替换或除去。该变化可以，例如，导致该微生物的改 变的代谢特征，使得，例如，该微生物表达的酶(其底物完全不被该亲本微生物所利用或者 以不同效率利用)以特征性方式代谢(例如，与亲本微生物相比时以不同的量、比例或者不 同的效率)，和/或该修饰微生物以特征性方式(例如，与亲本微生物相比时以不同的量、比 例或者不同的效率)形成代谢终产物或中间产物。“中间产物”应理解为在化学或生物化学过程中以不一定可在分析中直接检出的 浓度暂时或连续形成的产物。该“中间产物”可通过第二化学或生化反应从该生物化学过 程中除去，特别地通过由本文定义的“谷氨酸脱羧酶”催化的反应。术语“谷氨酸脱羧酶”指具有将谷氨酸转变为GABA能力的任何来源的任何酶。这 些酶归类于EC. 4. 1. 1. 15。“重组宿主”可以是任何原核或真核细胞，其含有克隆载体或表达载体。此术 语也意为包括已经遗传改造在宿主细胞的染色体或基因组中含有一个或多个克隆基因 的原核或真核细胞。合适的宿主细胞，例如可见于Sambrook等人，MOLE⑶LAR CLONING A LABORATORYMANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)。
术语“重组微生物”包括微生物(例如细菌、酵母、真菌等)或微生物菌株，其已经 遗传改变、修饰或改造(例如遗传改造)使得相比于天然微生物或其来源的“亲本”微生物 显示出改变的、修饰的或不同的基因型和/或表型(例如在遗传修饰影响微生物的编码核 酸序列时)。本文使用的“基本上纯的”蛋白质或酶表示所需纯化的蛋白质基本上不含杂质细 胞组分，通过聚丙烯酰胺-十二烷基硫酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)的单条带证实。术语“基本 上纯的”还意在描述本领域技术人员所用的一种或多种纯度或均一性特性是均勻的分子。 例如，基本上纯的谷氨酸脱羧酶对于例如下列的参数会显示在标准实验偏差之内的恒定和 可重现特征分子量、色谱迁移、氨基酸组成、氨基酸序列、封闭或未封闭的N端、HPLC洗脱 特征、生物学活性以及其他此类参数。但是，该术语不意为排除谷氨酸脱羧酶与其他化合物 的人工或合成混合物。另外，该术语不意为排除任选地从重组宿主分离的谷氨酸脱羧酶融 合蛋白质。3.本发明的其他实施方案3.1其他基因的失调如果与如下所列至少一种其他基因的失调相组合，使用表达谷氨酸脱羧酶的重组 棒杆菌属谷氨酸产生者的GABA发酵产生可进一步改进。
权利要求
发酵产生γ 氨基丁酸(GABA)的方法，所述方法包括培养重组微生物，所述重组微生物来自于具有产生谷氨酸的能力，并且还具有表达异源谷氨酸脱羧酶(E.C.4.1.1.15)能力的亲本微生物，由此将谷氨酸转化为GABA。
2.权利要求1的方法，其中所述微生物是谷氨酸产生细菌。
3.权利要求2的方法，其中所述谷氨酸产生细菌是棒杆菌。
4.权利要求3的方法，其中所述细菌是棒杆菌属细菌。
5.权利要求4的方法，其中所述细菌是谷氨酸棒杆菌。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述异源谷氨酸脱羧酶是原核或真核来源的。
7.权利要求6的方法，其中所述异源谷氨酸脱羧酶是植物谷氨酸脱羧酶或者包含来自 植物谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列的部分的嵌合谷氨酸脱羧酶。
8.权利要求6或7的方法，其中所述异源谷氨酸脱羧酶是茄属植物的脱羧酶，特别是马 铃薯的脱羧酶。
9.权利要求6至8中任一项的方法，其中异源谷氨酸脱羧酶来自马铃薯，其包含SEQID NO 2的Thr94至Leu336的氨基酸序列，或者与其具有至少80%同一性的序列。
10.权利要求9的方法，其中异源谷氨酸脱羧酶在N端和/或C端补充了来自马铃薯的 谷氨酸脱羧酶的对应末端氨基酸序列。
11.权利要求9的方法，其中异源谷氨酸脱羧酶在N端和/或C端补充了的不同于马铃 薯的第二植物的谷氨酸脱羧酶的对应末端氨基酸序列。
12.权利要求11的方法，其中所述第二植物是番茄。
13.权利要求12的方法，其中所述谷氨酸脱羧酶包含SEQID NO :2的氨基酸序列或者 与其具有至少80%同一性的序列。
14.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述异源谷氨酸脱羧酶是细菌谷氨酸脱羧酶。
15.权利要求14的方法，其中所述细菌谷氨酸脱羧酶来自埃希氏菌属的细菌，特别是 来自大肠杆菌。
16.权利要求15的方法，其中所述大肠杆菌谷氨酸脱羧酶选自SEQIDNO 6的Gad A、 包含SEQ ID NO :8的Gad B序列和SEQ ID NO :9的GadC序列的Gad BC复合物，以及与Gad A或Gad BC具有至少80%同一性的序列。
17.前述权利要求中任一项的方法，其中具有谷氨酸脱羧酶活性的酶由下述核酸序列 编码，所述核酸序列适应于具有产生谷氨酸能力的所述亲本微生物的密码子使用。
18.前述权利要求中任一项的方法，其中具有谷氨酸脱羧酶活性的酶由包含选自下列 的编码序列的核酸序列编码a)根据SEQID NO 1的472至1200位，或者根据SEQ ID NO 1的193至1605位；b)SEQID NO 5 ；c)SEQID NO 7 ；d)或者编码权利要求6至17中任一项所定义的谷氨酸脱羧酶的任何编码序列。
19.权利要求8至13中任一项定义的谷氨酸脱羧酶。
20.核酸序列，其包含权利要求19的谷氨酸脱羧酶的编码序列。
21.表达盒，其包含至少一个权利要求20的核酸序列，所述序列有效连接至少一个调控核酸序列。
22.重组载体，其包含至少一个权利要求21的表达盒。
23.原核或真核宿主，其转化了至少一个权利要求22的载体。
24.权利要求23的宿主，其选自重组棒杆菌，特别是重组棒杆菌属细菌。
25.权利要求24的宿主，其为重组谷氨酸棒杆菌。
26.权利要求1至18中任一项的方法，其中由此产生的GABA分离自发酵液。
27.制备聚酰胺的方法，所述方法包括a)通过权利要求1至18中任一项的方法制备GABA；b)分离GABA；禾口c)聚合所述GABA，任选在至少一种另外的合适多价共聚用单体存在下进行，所述共聚 用单体选自氨基羧酸和羟基羧酸。
全文摘要
本发明涉及通过培养表达具有谷氨酸脱羧酶活性的酶的重组微生物发酵产生γ-氨基丁酸(GABA)的新方法。本发明还涉及相应的重组宿主、重组载体、表达盒和适于制备这些宿主的核酸以及利用发酵产生获得的GABA用于制备聚酰胺的方法。
文档编号C12N15/60GK101945997SQ200980105702
公开日2011年1月12日 申请日期2009年2月20日 优先权日2008年2月21日
发明者A·赫罗尔德, C·克洛普罗格, H·施罗德, O·策尔德尔, W·K·郑 申请人:巴斯夫欧洲公司