专利名称：L-氨基酸的生产方法
技术领域：
本发明涉及使用微生物的L-氨基酸生产方法。L-氨基酸用于调味料、食品添加剂、饲料添加剂、化学制品、医药品等各个领域。
背景技术：
L-苏氨酸、L-赖氨酸等L-氨基酸，是使用具有所述L-氨基酸生产能力的埃希氏菌属细菌等L-氨基酸生产菌通过发酵方法来工业生产的。作为所述L-氨基酸生产菌，可以使用从自然界分离出来的菌株或该菌株的人工突变株、通过基因重组而增强了 L-氨基酸生物合成酶的重组体等。作为L-苏氨酸的生产方法，可以列举例如专利文献1 4中记载的方法。而作为L-赖氨酸的生产方法，可以列举例如专利文献5 8中记载的方法。目前在基于发酵法的L-氨基酸工业生产中使用糖类即葡萄糖、果糖、蔗糖、废糖蜜、淀粉水解物等作为碳源。L-氨基酸的发酵生产方法中经常使用的碳源是玉米、木薯等高等植物来源的淀粉的糖化物。它们的水分含量低且淀粉含量高，因而在工业上淀粉的获得是容易的。与此相对的是，虽然以单位干燥重量计，微型藻类中所含的淀粉的含量能够与玉米、木薯匹敌，但以单位藻类培养液计的干燥藻体重量不到1%。分离藻体、脱水、破碎细胞获取淀粉、再进行纯化等步骤繁杂且困难。专利文献9 10或非专利文献1中记载了使用微型藻类的淀粉来实施乙醇发酵，但未给出乙醇发酵的结果。此外，目前为止还没有报导对微型藻类的淀粉进行糖化来将其用于氨基酸生产的实例。已知作为代表性氨基酸生产菌的大肠杆菌能够以甘油为唯一碳源生长(非专利文献2、，并且还能够以碳链12以上的长链脂肪酸为唯一碳源生长(非专利文献幻。因此， 非专利文献4记载，大肠杆菌可以同化作为油脂水解物的长链脂肪酸和甘油中的任意一种，但其不具有脂肪酶活性，不能直接同化油脂。而且，已知通常长链脂肪酸的溶解度极低， 非专利文献5中记载的溶解度测定结果是月桂酸为0. lg/L以上，而油酸为0. 0003g/L以下，棕榈酸为0.00000003g/L以下。因此，同时同化水溶性高的甘油和脂肪酸是困难的，至今尚没有使用作为长链脂肪酸和甘油的混合物的油脂水解物作为碳源，通过直接发酵法来进行L-氨基酸生产的报导。作为通常用作食用油脂的油料植物，大豆的种子或油棕(oil palm)的果实中含有20%左右的油脂。而如非专利文献6报告的，已知微型藻类中有一些能够生产油脂，且单位面积的油脂产量大幅高于油料植物。然而，与淀粉一样，藻体分离、脱水、细胞破碎再纯化的步骤繁杂而困难。因此，至今尚无使用藻类来源的油脂作为碳源、通过直接发酵法进行 L-氨基酸生产的报导。专利文献1 日本特开平5-304969号公报专利文献2 国际公开第98/04715号小册子专利文献3 日本特开平05-227977号公报专利文献4 美国专利申请公开第2002/0110876号说明书专利文献5 日本特开平10-165180号公报
专利文献6 日本特开平11-192088号公报专利文献7 日本特开2000-253879号公报专利文献8 日本特开2001-057896号公报专利文献9 美国专利申请公开第2006/135308号说明书专利文献10 美国专利申请公开第2007/0202582号说明书非专利文献 1 =Matsumoto, M. et al. 2003. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108 247-254非专利文献2 :Lin，E. C. C. 1996. P. 307-342. In F. D. Neidhardt(ed.)， Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D. C.非专禾Ij文献 3 :Clark，D. P. and Cronan Jr.，J. Ε· 1996. p. 343-:357. h F. D. Neidhardt(ed. ), Escherichia coli and Salmonella Cellular and MolecularB iology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington,D.C.非专利文献 4 =Brenner, D. J. and Farmer III，J. J. Family I. 2005. p. 587-669. In :D. J. Brenner,N. R. Krieg and J. T. Staley,Editors,Bergey' sManual of Systematic Bacteriology, Volume Two :The Proteobacteria Part B :The Gammaproteobacteria, Springer, New York非专禾Ij文献 5 :Vorum，H. et al. 1992. Biochimica et Biophysica Acta, 1126 135-142.非专利文献6 =Chisti Y. 2007. Biotechnol. Adv. 25 :294-306.
发明内容
本发明提供更高效的L-氨基酸生产方法，特别是，相对于传统的以主要是高等植物来源的糖类作为碳源的利用微生物的L-氨基酸发酵生产方法，通过使用微型藻类来源的碳源，提供更廉价的L-氨基酸生产方法。本发明人等为解决上述课题进行了深入研究，结果发现，通过在以下述未完全纯化的材料作为碳源的培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的细菌，能够高效地生产L-氨基酸通过用酶水解处理从微型藻类获得的淀粉而得到的糖化物、微型藻类的藻体破碎物、 其含油脂的提取物、或对该提取物的分级物进行水解而得到的水解物。本发明正是基于上述认识而完成的。本发明的方法是一种生产L-氨基酸的方法，其中，在包含微型藻类(microalga) 的处理物的培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的细菌，在培养物中生产并蓄积L-氨基酸，并从该培养物收集L-氨基酸，其中，该处理物促进所述细菌生产并蓄积L-氨基酸。所述处理物是例如(1)该微型藻类的培养物的破碎物；(2)该破碎物的提取物或分级物，其中包含来源于该微型藻类的有机物的混合物；或C3)该破碎物、该提取物或该分级物的水解物。所述处理物优选是对产生淀粉的微型藻类的藻体破碎物、或者所述藻体破碎物的含淀粉的提取物、或者所述提取物的分级物进行水解而得到的糖化物。所述糖化物优选是从微型藻类的藻体破碎物或所述藻体破碎物的含淀粉的分级物通过使用淀粉酶的酶反应而得到的反应产物。所述淀粉酶优选是葡糖淀粉酶。此外，所述处理物优选是对产生油脂的微型藻类的藻体破碎物、或者所述藻体破碎物的包含油脂的提取物、或者所述提取物的分级物进行水解而得到的水解物。所述水解物优选是从微型藻类的藻体破碎物或所述藻体破碎物的包含油脂的分级物使用脂肪酶进行酶反应而得到的反应产物。所述所述水解物可以是经过了乳化处理的。所述破碎物的获取方法是选自高温处理、有机溶剂处理、煮沸处理、强碱处理中的 1种以上方法。作为高温处理，可以列举例如在150°C以上的温度下进行处理。所述微型藻类优选为属于绿藻纲(Chlorophyceae)、Trebouxiophyceae或硅藻纲 (Bacillariophyceae)的藻类，更优选为属于绿藻纲(Chlorophyceae)的藻类。所述细菌优选为属于肠杆菌科的细菌或棒状杆菌型细菌，更优选为属于埃希氏菌属的细菌。所述L-氨基酸例如为选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酸中的1种或2种以上 L-氨基酸。当所述L-氨基酸为L-赖氨酸时，优选所述细菌的选自二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氨基庚二酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、 二氨基庚二酸差向异构酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、以及琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶中的1种或2种以上的酶的活性被增强，和/或赖氨酸脱羧酶的活性被弱化。当所述L-氨基酸为L-苏氨酸时，优选所述细菌的选自天冬氨酸半醛脱氢酶、thr 操纵子编码的天冬氨酸激酶I、高丝氨酸激酶、天冬氨酸氨基转移酶、以及苏氨酸合酶中的 1种或2种以上的酶的活性被增强。当所述L-氨基酸为L-谷氨酸时，优选所述细菌的选自谷氨酸脱氢酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、以及甲基柠檬酸合酶中的1种或2种以上的酶的活性被增强， 和/或α-酮戊二酸脱氢酶的活性被弱化。优选所述培养基包含所述处理物作为碳源。此外，本发明还提供一种生产L-氨基酸的方法，其特征在于该方法包括下述步骤(a)在培养基中培养微型藻类，采用选自破碎、提取、分级以及水解中的1种以上的方法对该培养物进行处理，制备促进具有L-氨基酸生产能力的细菌生产并蓄积L-氨基酸的该微型藻类的处理物；(b)在该包含微型藻类的处理物的培养基中培养该细菌，从而在培养物中生产并蓄积L-氨基酸；以及(c)从该培养物收集L-氨基酸。所述处理物是例如(1)该微型藻类的培养物的破碎物；(2)该破碎物的提取物或分级物，其中包含来源于该微型藻类的有机物的混合物；或者( 该破碎物、该提取物或该分级物的水解物。所述破碎的方法优选是选自高温处理、有机溶剂处理、煮沸处理和强碱处理中的1 种以上的方法。所述处理物制备步骤优选包括通过对产生淀粉的微型藻类进行破碎和/或提取和分级，并对所得处理物进行水解来进行糖化的步骤。所述进行糖化的步骤中优选使用淀粉酶实施酶反应。所述淀粉酶优选为葡糖淀粉酶。所述处理物制备步骤优选包括对产生油脂的微型藻类进行破碎和/或提取和分级，并对所得油处理物进行水解的步骤。所述水解步骤中优选实施使用脂肪酶的酶反应。所述水解物可以是经过乳化处理的。所述微型藻类优选是属于绿藻门、不等长鞭毛门的藻类；更优选是属于绿藻纲、Trebouxiophyceae或硅藻纲的藻类。所述微型藻类特别优选是属于绿藻纲 (Chlorophyceae)的藻类。所述细菌优选是属于肠杆菌科的细菌或棒状杆菌型细菌；更优选是大肠杆菌。根据本发明，能够更高效地生产L-氨基酸，特别是，通过使用微型藻类来源的廉价碳源，能够廉价地生产L-氨基酸。发明的
具体实施例方式以下，对本发明进行具体说明。<1>本发明中使用的微型藻类及其培养方法本发明中的微型藻类(microalgae)可以使用任何微型藻类，优选在藻体内蓄积淀粉和/或油脂的微型藻类。藻类(algae)是指进行产氧型光合成的生物中，除主要在陆上生活的苔癣植物、 蕨类植物、种子植物以外的全部生物。藻类中包括分类在从属于原核生物的蓝细菌(蓝藻) (cyanobacteria)到属于真核生物的灰藻门(Glaucophyta)、红藻门(红藻)(Rhodophyta)、 绿藻门(Chlorophyta)、隐藻门(隐藻)(Cryptophyta)、定鞭藻门(定鞭藻)(Haptophyta)、 不等长鞭毛门(Heterokontophyta)、甲藻门(甲藻)(Dinophyta)、裸藻门(Euglenophyta)、 Chlorarachniophyta的各种单细胞生物和多细胞生物。所谓微型藻类，是上述藻类中除了属于多细胞生物的海藻类以外的具有微观结构的藻类(才rMr λ ^y
⑶藻類O多樣性i系統千原光雄裳華房(1999))。
以藻类为代表的植物多以淀粉作为储藏多糖(Ball，S. G. and Morel 1, Μ. K. 2003. Annual Review ofPlant Biology, 54 :207-233) 已知多种蓄积淀粉的藻类，其中代表性的藻类有属于绿藻门的葱绿藻纲(Prasinophyceae)、绿藻纲(Chlorophyceae)、 Trebouxiophyceae、石莼纲(Ulvophyceae)、轮藻纲(Charophyceae)等。这其中，属于绿藻纲(Chlorophyceae)以及"Trebouxiophyceae的藻类研究广泛。作为属于绿藻纲的藻类， 可以列举衣藻属(Chlamydomonas)；作为属于jTrebouxiophyceae的藻类，可以列举小球藻属(Chlorella)。具体地，作为衣藻属，可以列举莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii) (Ball, S. G. 1998.The Molecular Biology of Chloroplasts andMitochondria in Chlamydomonas, pp. 549—567. Rochaix J. -D. , Goldschmidt-Clermont Μ. , and Merchant S. (Eds) ,Kluwer AcademicPublishers)；作为小球藻属，可以列举Chlorella kessleri (旧称 Chlorellavulgaris) (Izumo，A. et al. 2007. Plant Science 172:1138-1147)。更具体地，作为莱茵衣藻，可以列举莱茵衣藻CC125株；作为Chlorella kessleri，可以列举 Chlorella kessleri Ilh株。所述藻株例如分别保藏在德克萨斯大学藻类培养物保藏中心(The University of Texas at Austin, The Culture Collection ofAlgae (UTEX),1
8University Station A6700, Austin, TX 78712-0183，USA)，受理号为 UTEx 2244 和 UTEX 沈3，可以从UTEX获得。Chlorella kessleri Ilh株先保藏在东京大学分子细胞生物学研究所IAM培养物保藏中心，保藏号C-531，然后转移至独立行政法人国立环境研究所微生物系统保存设施(NIES)。此外，该株还保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC、P. 0. Box 1549,Manassas, VA 20108, l,United States of America)，受理号ATCC11468，可以从ATCC 通过分售获得。而且，还已知微型藻类中有一些蓄积油脂作为储藏物质(Chisti，Y.2007. Biotechnol Adv. 25 :294-306)。作为这样的藻类，熟知的有属于绿藻门、不等长鞭毛门的藻类。绿藻门中，可以列举属于绿藻纲(Chlorophyceae)的藻类，作为属于绿藻纲的藻类，可以列举 Neochloris οleoabundans (Tornabene，T. G. et al. 1983. Enzyme and Microb. Technol. 5 :435-440) > 微球藻属禾中(Nannochloris sp.)(Takagi, M. et al. 2000. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54 :112-117)等。不等长鞭毛门分类成黄金 fe 藻 (Chrysophyceae) > IiI ^ (Dictyochophyceae)、Pelagophyceae> # Ifi ^ (Rhaphidophyceae)、5 (Bacillariophyceae)、！!藻 Β (Phaeophyceae)、黄參录藻 Β (Xanthophyceae)、大眼藻纲(Eustigmatophyceae)，作为常用的属于硅藻纲的藻类，可以 ^J^fiitM^lil^ (Thalassiosira pseudonana) (Tonon, T et al. 2002. Phytochemistry 61 :15-24) ο作为Neochloris oleoabundans,可以具体例举Neochloris οIeoabundansUTEX 1185 株，作为 Nannochloris sp.，可以列举 Nannochloris sp. UTEX LB1999 株，作为假微型海链藻，可以列举假微型海链藻UTEX LB FD2株。所述菌株可以从德克萨斯大学藻类培养物保藏中心(The University of Texas atAustin, The Culture Collection of Algae (UTEX), 1 University Station A6700, Austin, TX 78712-0183，USA)获得。关于微型藻类的培养已经取得了许多认识，小球藻属、螺旋藻属(Spirulina， Arthrospira)或者Dunaliella salina等，已经进行了大规模工业培养来用于食用 (Spolaore, P. et al. 2006. J. Biosci. Bioeng. 101 :87-96)。对于莱茵衣藻可以使用例如 0. 3XHSM 培养基(Oyama, Y. et al. 2006. Planta 224 :646-654)；对于 Chlorella kessleri 可以使用 0. 2 X Gamborg' s 培养基(Izumo，A. etal. 2007. Plant Science 172 1138-1147)等。Neochloris oleoabundans、微球藻属种可以使用改进NORO培养基 (Yamaberi, K. et al. 1998. J. Mar. Biotechnol. 6 :44-48 ；Takagi, Μ. et al. 2000. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54 :112-117)々 Bold ' s Basal Medium(Tornabene, T.G. et al.1983.Enzyme and Microb. Technol. 5 :435-440 ；Archibald, P.A. and Bold, H. C. 1970. Phytomorphology20 :383-389)来进行培养。作为属于硅藻纲的藻类，假微型海链藻适合使用 F/2 培养基(Lie, C. -P. and Lin, L. -P. 2001. Bot. Bull. Acad. Sin. 42 :207-214)等。此外，对于微型藻类的培养，还可以使用光生物反应器(W02003/094598号小册子)。培养中大多添加相对于主培养的体积1-50%的前培养液来进行。初始pH优选为7-9的中性附近，培养中大多不进行pH调整，但有时视需要也可进行。培养温度优选为 25-35°C，特别是附近是一般经常采用的温度，但培养温度只要是适合于所使用的藻类的温度即可。培养液中大多通入空气，经常采用的通气量是单位培养液体积的每1分钟的通气量为0. l-2vvm(volume per volume per minute,体积每体积每分钟)。而且，为了力口快生长，也会通入CO2，优选通入通气量的0. 5-5%左右。光照射强度的最佳条件也因微型藻类的种类而异，经常采用的是1，000-10，OOOlux左右。光源通常是在室内使用白色荧光灯， 但并不限于此。也可以在室外利用太阳光来进行培养。视需要，还可以以适当强度搅拌或循环培养液。此外，已知如果氮源枯竭，藻类会在藻体内蓄积油脂(Thompson GA Jr. 1996. Biochim.Biophys.Acta 1302 :17-45)，可以在主培养中使用进一步限制了氮源浓度的培养基。本发明中，微型藻类的培养物包括包含藻体的培养液、从培养液回收的藻体。从培养液回收藻体的方法可以采用常规的离心分离、过滤或者使用絮凝剂 (flocculant)的借助重力的沉降等方法(Grima, E. M. et al. 2003. Biotechnol. Advances 20 :491-515)。<2>微型藻类的处理方法和微型藻类的处理物在本发明中，微型藻类的处理物是指这样的处理物，其包含来源于破碎的微型藻类的细胞的有机物的混合物，可促进具有L-氨基酸生产能力的细菌生产并蓄积L-氨基酸； 这样的处理物具体地可以列举(1)该微型藻类的培养物的破碎物，( 该破碎物的包含来源于该微型藻类的有机物的混合物的提取物或分级物，或C3)该破碎物、该提取物或该分级物的水解物。“促进生产并蓄积L-氨基酸”或“促进L-氨基酸的生产和蓄积”是指处理物中所包含的、来源于破碎的微型藻类细胞的有机物混合物，在细菌增殖和L-氨基酸生产中，作为构成菌体成分和L-氨基酸的碳的供给源实质性地做出贡献，只要是能够做出这样的贡献的处理物，就包含在本发明的“促进对L-氨基酸的生产蓄积量有作用的处理物”之中。处理物是否促进L-氨基酸的生产和蓄积，可以通过在只是有无处理物不同、而其它均相同的条件下培养该细菌，并比较培养物中的L-氨基酸的生产蓄积量来确认。只要与未添加处理物的培养物中的L-氨基酸蓄积相比有所提高即可，优选与未添加培养物相比，L-氨基酸蓄积提高10%以上，优选20%以上，更优选30%以上。通过添加处理物，微生物的生长速度提高、培养基中的微生物菌体量增加，也属于本发明的“促进生产并蓄积L-氨基酸”，与未添加的培养物相比，生长速度和菌体量优选增加10%以上，优选20%以上，更优选30%以上。此外，当处理物包含碳源时，只要能够在细菌增殖及L-氨基酸生产中作为构成菌体成分和L-氨基酸的碳的供给源做出实质性贡献，就属于本发明的对L-氨基酸的生产蓄积量有促进作用的处理物。因此，与未添加处理物的条件相比L-氨基酸的生产蓄积量增加的情况，也包含在本发明的处理物中，优选与添加包含与所含碳源等量的纯化物质的碳源相比，L-氨基酸生
产蓄积量更高。此外，与使用包含纯化物质的碳源相比，纯化碳源的处理步骤的缩短也可以说是 L-氨基酸生产蓄积提高。处理步骤的缩短时间优选缩短10%以上、优选20%以上、更优选 30%以上。作为处理物，除了上述的例子以外，可以以促进L-氨基酸生产蓄积为指标，通过破碎、提取、分级、水解及其任意组合，来获得目的处理物。破碎培养物的方法只要是能够充分破碎藻体的方法即可，可以是任何方法，例如， 优选采用高温处理(例如在100°c以上的温度(优选150°C以上、更优选175 215°C)条件下进行处理)、有机溶剂处理(例如利用甲醇氯仿混合溶剂进行处理)、煮沸处理、强碱处理、超声波处理、弗氏细胞压碎器处理等方法以及这些方法的任意组合。高温处理还包括在称为水热反应这样的条件下的高温高压反应。此外，还可以在对藻体进行干燥后，采用物理方法进行破碎。破碎的藻类来源的有机物溶液，可以直接以粗提取物的形式使用或者用于水解反应，也可以通过过滤、离心分离等除去细胞壁等不溶物，或者通过冷冻干燥等来进行浓缩。而且，也可以使用包含进行过某种程度的分级的淀粉的溶液。从藻体破碎物中进行淀粉的分级，可以基于比重差异例如通过在悬浮液中的沉降速度等，来分离回收蛋白级分。此外，还可以从藻体破碎物中进行油脂的分级。通过在藻体的破碎物或该破碎物的浓缩物中加入例如80%甲醇或80%丙酮，并使用已烷、氯仿等溶剂对其中的不溶性油脂进行提取，可以以粗脂溶性级分的形式提取油脂。本发明的微型藻类来源的有机物的混合物中，优选包含可以作为碳源利用的物质。这种情况下，可以减少或省略向用于氨基酸发酵的培养基中另行添加的碳源。作为可作为碳源利用的物质，可以列举淀粉和/或油脂的水解物。在本发明的微型藻类来源的有机物的混合物中包含微型藻类生产的淀粉的情况下，可以将该糖化物添加到培养基中作为碳源。淀粉的糖化物例如可以从微型藻类来源的有机物溶液或其包含淀粉的分级物，通过酸水解等化学方法或使用淀粉酶的酶反应来获得。淀粉是由直链淀粉和支链淀粉组成的高分子多糖类，所述直链淀粉由葡萄糖通过α-1，4-葡糖苷键键合成直链状而成，所述支链淀粉在其分枝上具有α-1，4-葡糖苷键和α-1，6-葡糖苷键这两者的直链。淀粉酶(amylase)是水解淀粉等的葡糖苷键的酶的总称。根据作用部位的不同，大致分为α-淀粉酶(a-amylase EC3. 2. 1. 1)、β -淀粉酶 (β -amylase EC3. 2. 1. 2)和葡糖淀粉酶(glucoamylase EC3. 2. 1. 3)。α -淀粉酶是随机切断淀粉、糖原等α-1，4-葡糖苷键的内切型酶。淀粉酶是从淀粉的非还原性末端以麦芽糖为单位依次分解α-1，4-葡糖苷键的外切型酶。葡糖淀粉酶(也称淀粉葡糖苷酶)是从淀粉的非还原性末端以葡萄糖为单位依次分解α -1,4-葡糖苷键的外切型酶，其也分解支链淀粉中所含的α-1，6_键。葡糖淀粉酶能够从淀粉直接生成葡萄糖，因而在葡萄糖的生产中有广泛应用，在本发明中它是优选的酶。谷物来源的淀粉的糖化反应在工业上也有着许多实施的实例(Robertson，G. H. et al. 2006. J. Agric. Food Chem. 54 :353-365)。按照与这些实例相同的方式，可以从藻体通过酶反应而得到糖化物。在对包含破碎藻体的溶液进行酶处理时，作为前处理，优选组合使用煮沸、超声波处理、碱处理等(Izumo, A. et al. 2007. Plant Science 172:1138-1147)。酶反应的条件可以根据所使用的酶的性质适宜设定。例如，对于淀粉葡糖苷酶 (Sigma-Aldrich 公司 A-9228)，优选酶浓度 2 20U/mL、温度 40 60°C、pH4 6。而且， 如果在PH的制备中使用能够被用于L-氨基酸生产的细菌所同化的有机酸作为缓冲液，则该有机酸可以与淀粉的糖化物一起作为碳源使用。例如，可以直接将酶反应产物添加到培养基中。在本发明中，由微型藻类生产的淀粉的糖化物是指如上述地，对淀粉进行水解， 生成细菌能够同化的诸如麦芽糖或葡萄糖的寡糖或单糖而得到的物质。此外，由微型藻类生产的淀粉的糖化物可以是基本上全部的淀粉均被糖化，也可以一部分被糖化。优选地，淀粉的50重量％以上、更优选70重量％以上、特别优选90重量％以上转化为葡萄糖。而且， 由微型藻类生产的淀粉的糖化物可以包含微型藻类生产的淀粉以外的碳水化合物物或其糖化物。在本发明的微型藻类来源的有机物的混合物中包含微型藻类生产的油脂的情况下，也可以将其水解物添加到培养基中作为碳源。可以将通过热处理等对微型藻类的藻体进行破碎而得到的粗提取液直接进行水解，也可以对使用乙醇、甲醇-氯仿的混合物或丙酮等溶剂提取得到的有机物的混合溶液进行水解。所述溶液可以直接使用，也可以通过冷冻干燥、旋转蒸发等处理进行浓缩。该溶液包含氨基酸等可作为有机氮源利用的成分、以及金属类等对具有氨基酸生产能力的细菌的生长有效的成分，而且该溶液也可以作为非碳源的培养基成分使用。在本发明中，微型藻类产生的油脂可以是任何形态，只要能够进行油脂水解、优选利用酶进行油脂水解即可，具体地可以列举藻体破碎物、菌体破碎物的含油脂的提取物、从该提取物获得的含油脂的分级物等。此外，所述提取物或分级物优选包含油脂以外的对氨基酸发酵有效的有机物。油脂是脂肪酸与甘油的酯，也称为甘油三酯。作为微型藻类产生的油脂，优选其水解产生的脂肪酸的种类能够被本发明的方法中使用的细菌作为碳源而同化，更优选这样的脂肪酸的含量高。作为具有L-氨基酸生产能力的细菌能够同化的长链脂肪酸的种类，可以列举月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸等。此外，通常，除油脂以外，生物会包含通过水解而游离出脂肪酸的脂质(lipid)，脂质水解产生的脂肪酸也可以作为碳源使用。作为脂质，可以列举简单脂质(Simple Lipid)例如蜡(wax)、神经酰胺(Ceramide)，或者复合脂质例如磷脂(Wiospholipid)、糖脂(Glycolipid)等。在本发明中，油脂的水解物是指通过化学方法或酶方法等对上述微型藻类油脂进行水解而得到的水解物。作为化学水解法，通常采用在高温O50-260°C )、高压(5-6MPa) 条件下使油脂和水对向流动接触的连续高温水解法。此外，已知在强酸存在下或酸催化剂存在下会发生油脂水解(美国专利第4，218，386号)。此外，工业上还使用酶在低温(30°C 左右)下进行反应(Jaeger, K. Ε. et al. 1994. FEMS Microbiol. Rev. 15 :29-63)。作为所述酶，可以使用催化油脂水解反应的酶——脂肪酶。具体地，例如通过在小型压力容器中加入等量的油脂和水，并于200°C加热搅拌1 小时左右，可以获得70-80%左右的水解率。工业上，采用高温Q50-260°C)、高压(5_6MPa) 条件。另一方面，采用酶法可以在更温和的条件下进行水解。对水和油脂进行搅拌、同时在适合脂肪酶反应的温度下进行酶反应，这对本领域技术人员而言是容易的。脂肪酶是工业上重要的酶,有着各种各样的产业应用(Hasan, F. et al. 2006. Enzyme and Microbiol. Technol. 39 :235-251)。所使用的酶可以是1种，也可以是2种以上。脂肪酶是将油脂水解成脂肪酸和甘油的酶，也称作三酰甘油脂肪酶 (triacylglycerol lipase)、三酉先甘油酉旨月旨肪醇(triacylglyceride lipase)。脂肪酶见于各种生物，只要是催化上述反应的脂肪酶即可，可以使用任何物种来源的脂肪酶。近年来，进行了许多尝试来使用脂肪酶从油脂和醇生产作为脂肪酸酯的生物柴油燃料(Fukuda，H.，Kondo, A.，and Noda, H. 2001. J. Biosci. Bioeng. 92，405-416)。作为微生物来源的代表性脂肪酶，已知芽胞杆菌属(Bacillus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)来源的多
12种月旨肪酶(Jaeger, K. Ε.，and Eggert, Τ. 2002. Curr. Opin. Biotechnol. 13 :390-397)。作为例子，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的LipA(GenBank登录号 M74010)的编码基因的碱基序列示于SEQ ID NO :1，氨基酸序列示于SEQlD NO :2。荚壳伯克霍尔德氏菌(Burkholderia glumae)来源的LipA (GenBank登录号 X70354)的编码基因的碱基序列示于SEQ ID NO :3，氨基酸序列示于SEQID NO :4。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来源的 LipA(GenBank 登录号 D50587) 的编码基因的碱基序列示于SEQ ID NO :5，氨基酸序列示于SEQ IDNO :6。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)来源的脂肪酶(GenBank登录号 M12715)的碱基序列示于SEQ ID NO :7，氨基酸序列示于SEQ ID NO :8。此外，作为酵母的南极假丝酵母(Candida antarctica)来源的脂肪酶(GenBank 登录号Z30645)也是广为利用的一种脂肪酶(Breivik, H.，Haraldsson, G. G. and Kristinsson,B. 1997. J. Am. Oil Chem. Soc. 74 :1425-1429)。该脂肪酶的编码基因的碱基序列示于SEQ ID NO :9，氨基酸序列示于SEQ ID NO :10。而且，已知酵母皱褶假丝酵母(Candida rugosa)(即柱状假丝酵母 (Candidacylindracea))中存在由不同基因编码的5种以上的脂肪酶(Alberghina， L. andLotti，M. 1997. Methods Enzymo 1. 284 :246-260)。作为主要的脂肪酶，已知有 LIPl 和 LIP2，编码LIPl的Iipl (GenBank登录号)(64703)基因的碱基序列示于SEQ ID NO :11,LIP1 的氨基酸序列示于SEQ ID NO :12ο编码LIP2的lip2 (GenBank登录号X64703)基因的碱基序列示于SEQ ID N0:13，LIP2的氨基酸序列示于SEQ ID N0:14。而且，已知在Candida cylindracea等假丝酵母属(Candida)酵母中，在常规编码中编码亮氨酸的CTG密码子编码 ^.UM (Kawaguchi, Y. et al. 1989. Nature 341 :164-166 ；Ohama, T. et al. 1993. Nucleic Acids Res. 21 :4039-404 。在SEQ ID NO :11 14中，为了方便起见，将CTG对应的氨基酸记载为Leu，而实际上是kr。所使用的上述脂肪酶可以从上述微生物的菌体或培养物制备得到，也可以使用编码各脂肪酶的基因，利用基因工程技术，通过在其它宿主微生物中表达来制备。当将皱褶假丝酵母(柱状假丝酵母)等CTG密码子编码丝氨酸的酵母来源的基因在其它宿主中进行表达时，有必要将CTG变更为编码丝氨酸的其它常规密码子(Schmidt-Dannert，C. 1999. Bioorg. Med. Chem. 7 :2123-2130)。作为脂肪酶的序列方面的特点包括，例如在活性中心Ser周围具有称为脂肪酶盒(lipase box)的GXSXG基序，以及脂肪酶、酯酶、丝氨酸蛋白酶中均可见的称为催化三联体(catalytic traid)的kr、Asp、His这3个残基的保守性。例如，在SEQ ID NO :2所示的枯草芽孢杆菌来源的LipA的氨基酸序列中，脂肪酶盒子相当于第106位 110位，催化三联体相当于第108位的kr、第164位的Asp以及第187位的His这3个残基。已知油脂的水解物是脂肪酸与甘油的混合物，通常的油脂水解物中所含的甘油 /脂肪酸的重量比是10%左右。水解物可以是水解反应后的反应产物本身，但只要包含脂质来源的脂肪酸、甘油等能够被细菌同化的碳源即可，也可以是对反应产物进行分级或纯化而得到的物质。当水解物包含脂肪酸和甘油时，甘油/脂肪酸的重量比优选为2 50 100，更优选为5 20 100。在室温附近的温度下，油脂的水解物通常会分离成包含甘油的下层(水相)和包含脂肪酸的上层(油相)。如果收集下层，则可以获得主要包含甘油的级分。如果收集上层， 则可以获得主要包含脂肪酸的级分。在本发明中，可以使用它们中的任意一种作为碳源，但优选使用甘油和脂肪酸这两者。当以水解物的形式使用包含甘油和脂肪酸这两者的物质时，优选对水解物进行乳化处理。作为乳化处理，可以列举添加乳化促进剂、搅拌、勻浆或超声波处理等。可以认为通过乳化处理，细菌易于同化甘油和脂肪酸，L-氨基酸发酵效率更高。乳化处理只要是使得具有L-氨基酸生产能力的细菌更容易同化脂肪酸与甘油的混合物的处理即可，可以是任何的乳化处理。例如，作为乳化方法，可以考虑添加乳化促进剂、表面活性剂等。这里，作为乳化促进剂，可以列举磷脂、留醇。此外，作为表面活性剂，非离子表面活性剂方面包括例如聚(氧化乙烯)去水山梨糖醇单油酸酯(Tween 80)等聚氧化乙烯去水山梨糖醇脂肪酸酯、正辛基β-D-葡糖苷等烷基葡糖苷、蔗糖硬脂酸酯等蔗糖脂肪酸酯、聚甘油硬脂酸酯等聚甘油脂肪酸酯等。作为两性离子表面活性剂，可以列举属于烷基甜菜碱的N，N-二甲基-N-月桂基甘氨酸甜菜碱等。除此以外，还可以使用Triton X-100、 聚氧化乙烯00)十六烷基醚(Brij-58)、壬基苯酚乙氧化物(Tergitol NP-40)等生物学领域通常使用的表面活性剂。而且，用于促进诸如脂肪酸的难溶性物质的乳化、均一化的操作也是有效的。该操作只要是促进脂肪酸与甘油的混合物的乳化、均一化的操作即可，可以是任何操作。具体地，可以列举搅拌处理、勻浆器处理、均勻混合器处理、超声波处理、高压处理、高温处理等， 更优选搅拌处理、勻浆器处理、超声波处理以及它们的组合。将上述的利用乳化促进剂进行的处理与搅拌处理、勻浆器处理和/或超声波处理相组合是特别优选的，所述处理理想的是在脂肪酸更为稳定的碱性条件下进行。作为碱性条件，优选PH9以上，更优选pHIO以上。甘油的浓度可以利用F-Kit Glycerol (Roche Diagnostics公司)这样的试剂盒或各种生物传感器来测定。此外，脂肪酸或油脂的浓度可以利用气相色谱(Hashimoto， K. et al. 1996. Biosci. Biotechnol. Biochem. 70 :22-30)々 HPLC(Lin, J. Τ. et al. 1998. J. Chromatogr. Α. 808 :43-49)来测定。<4>本发明中使用的细菌在本发明中，使用具有L-氨基酸生产能力的细菌。对于细菌没有特殊限制，只要其能够高效地从由微型藻类生产的有机物、特别是淀粉的糖化物或者油脂的水解物生产 L-氨基酸即可，可以列举例如埃希氏菌属、泛菌属、肠杆菌属等属于肠杆菌科的细菌，以及属于短杆菌属、棒杆菌属、微杆菌属的称为棒状杆菌型细菌等，但不限于此。可以对本发明中的L-氨基酸生产菌进行修饰，使得油脂水解物的同化能力提高。 这样的修饰包括，例如，编码在肠杆菌科细菌群中发现的转录因子i^adR(该因子调节脂肪酸代谢且具有DNA结合能力)的基因的缺损(DiRusso，C. C. et al. 1992. J. Biol. Chem. 267 8685-8691 ；DiRusso, C. C. et al. 1993. Mol. Microbiol. 7 :311-322)。具体地，大肠杆菌 (Escherichia coli)的fadR基因位于以Genbank登录号U00096登录的大肠杆菌MG1655 株的基因组序列上的碱基编号1，234，161 1，234，880，该基因编码以GenBank登录号 AAC74271登录的蛋白质。fadR基因序列示于SEQ ID N0:15。本发明的L-氨基酸生产菌中，与甘油代谢相关的基因可以是经修饰的。作为与甘油代谢相关的基因，为了提高甘油同化性能，可以弱化glpR基因(EP1715056)的表达，或者强化 glpA、glpB、glpC、glpD、glpE、glpF、glpG、glpK、glpQ、glpT、 glpX、tpiA、gldA、dhaK、dhaL、dhaM、dhaR、fsa 以及 talC 基因等甘油代谢基因(EP1715055A) 的表达。特别是，为了提高甘油同化性能，优选组合强化甘油脱氢酶基因(gldA)与PEP依赖型二羟基丙酮激酶基因(dhaKLM)基因或者ATP依赖型二羟基丙酮激酶基因(dak)。而且，还可以进一步强化果糖-6-磷酸醛缩酶(fsaB)的表达(W02008/102861)。此外，在甘油激酶(glpK)方面，优选使用解除了果糖-1，6-磷酸反馈抑制的脱敏型 glpK 基因(W02008/081959，W02008/107277)。肠杆菌科中包括属于埃希氏菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属、 光杆菌属(Photorhabdus)、普罗威登斯菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、摩根氏菌属、耶尔森菌属等属的细菌。特别优选通过NCBI (National Center for Biotechnology Information)的数据库(http://www, ncbi. nlm. nih. Rov/Taxonomy/Browser/wwwtax. CgiYYid = 91347)中采用的分类方法分类在肠杆菌科中的细菌。对于可在本发明中使用的属于埃希氏菌属的细菌没有特殊限制，包括例如 Neidhardt 等的著作(Neidhardt, F.C. Ed. 1996. Escherichia coli andSalmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition pp.2477-2483. Table 1. American Society for Microbiology Press, Washington, D. C.)中表述的系统。具体地,可以列举原型野生株K12株来源的大肠杆菌W3110(ATCC27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)等。这些菌株可以从例如美国典型培养物保藏中心(地址P.O. Box 1549Manassas，VA 20108,United States ofAmerica)通过分售获得。即，对各菌株赋予了对应的登录号，可以利用该登录号通过分售获得。对应于各菌株的登录号见美国典型培养物保藏中心的目录。 这一点对于以下的附有ATCC号的菌株而言也是一样的。所谓属于泛菌属的细菌，是指该细菌通过微生物学专家知晓的分类被分类在泛菌属。成团肠杆菌的某些种，最近基于16S rRNA碱基序列分析等被重新分类为成团泛菌 (Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis、斯氏泛菌((Pantoea stewartii))等(Int. J. Syst. Bacteriol. 1993. 43 162-173)。在本发明中，属于泛菌属的细菌也包含这样重新分类在泛菌属的细菌。作为泛菌属细菌的代表性菌株，可以列举Pantoea ananatis、斯氏泛菌、成团泛菌、柠檬泛菌(Pantoea citrea)。具体地，可以列举下述菌株。Pantoea ananatis AJ13355株(FERM BP-6614)(欧洲专利申请公开0952221 号说明书)Pantoea ananatis AJ13356株(FERM BP-6615)(欧洲专利申请公开0952221 号说明书)此外，这些菌株在欧洲专利申请公开0952221号说明书中被描述为成团肠杆菌。 但是现在，如上所述，这些菌株通过16S rRNA的碱基序列解析等被重新分类为Pantoea ananatis。肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、产气肠杆菌 (Enterobacter aerogenes)等。具体地，可以使用欧洲专利申请公开952221号说明书示例的菌株。作为肠杆菌属的代表性菌株，可以列举成团肠杆菌ATCC12287株。
作为欧文氏菌属细菌，可以列举解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)；作为克雷伯氏菌属细菌，可以列举植生克雷伯氏菌 (Klebsiella planticola)。具体地，可以列举下述菌株。解淀粉欧文氏菌ATCC15580株胡萝卜软腐欧文氏菌ATCC15713株植生克雷伯氏菌AJ13399株(FERM BP-6600)(欧洲专利申请公开955368号说明书)植生克雷伯氏菌AJ13410株(FERM BP-6617)(欧洲专利申请公开955368号说明书)在本发明中，“棒状杆菌型细菌”还包括传统上被分类为短杆菌属，而现在被分类为棒杆菌属的细菌(Liebl, W. et al. 1991. Int. J. Syst. Bacteriol. ,41 :255-260)，以及与棒杆菌属亲缘关系非常近的短杆菌属细菌。作为这样的棒状杆菌型细菌的例子，可以列举以下细菌。嗜乙酰乙酸棒杆菌醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)；^醇棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)美棒Iflif (Corynebacterium callunae)谷氨酸棒杆菌百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes) (Corynebacteriumefficiens)力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)—I^feilf lif (Brevibacterium divaricatum)黄色短杆菌Brevibacterium immariophilum乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒杆菌)玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)角军H短杆菌(Brevibacterium saccharoIyticum)生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)/feMfeiIflii (Corynebacterium ammoniagenes)白fe棒杆菌(Brevibacterium album)赌状短杆菌(Brevibacterium cerinum)嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)具体地，可以示例出诸如下述的菌株。嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870木干胃(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC15806@酉享_木干胃(Corynebacterium a 1 kano 1 yticum) ATCC21511美棒杆菌(Corynebacterium callunae)ATCC15991
16
谷氨酸棒杆菌ATCC13020，ATCC13032, ATCC13060百合花棒杆菌(Corynebacteriumlilium)ATCC15990栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)ATCC17965嗜热产氨棒杆菌AJ12340(FERM BP-1539)力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)ATCC13868二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC14020黄色短杆菌ATCC13826，ATCC14067Brevibacterium immariophilum ATCC14068乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869 (谷氨酸棒杆菌 ATCC13869)玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum) ATCC13825解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)ATCC19240产氨短杆菌(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC6871、ATCC6872白色棒杆菌(Brevibacterium album)ATCC15111蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum) ATCC15112嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC 15354在本发明中，具有氨基酸生产能力的细菌，是指具有在培养基中进行培养时生产 L-氨基酸并将L-氨基酸分泌至培养基中的能力的细菌。此外，优选地，是指能够在培养基中蓄积优选0. 5g/L以上、更优选1. 0g/L以上的量的目的L-氨基酸的细菌。L-氨基酸包括 L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、 L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸以及L-缬氨酸。特别优选L-苏氨酸、L-赖氨酸以及L-谷氨酸。以下，针对赋予如上所述的细菌L-氨基酸生产能力的方法、或者增强如上所述的细菌的L-氨基酸生产能力的方法进行说明。为了赋予L-氨基酸生产能力，可以使用在棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌等 L-氨基酸生产菌的选育中沿用至今的方法，如获取营养缺陷突变体、L-氨基酸类似物抗性菌株或代谢调节突变菌株，创建L-氨基酸生物合成系统统酶表达增强的重组菌株等等(参见《7 $ )酸発酵》，(株)学会出版七 > 夕一，1986年5月30日首次出版发行，第77-100 页)。这里，在L-氨基酸生产菌的选育中，所赋予的营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变等性质可以是单独一种，也可以是两种或者三种以上。此外，表达被增强的L-氨基酸生物合成系统酶可以是单独一种，也可以是两种或三种以上。另外，可以将营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变等性质的赋予与生物合成系统酶的增强组合进行。具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷突变体菌株、类似物抗性菌株或代谢调节突变菌株可如下获得对亲本菌株或野生型菌株施以常规突变处理，即X-射线或UV照射或用诱变剂例如N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍等处理；其后，从所得的突变菌株中选择显示营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变并且还具有L-氨基酸生产能力的菌株。此外，L-氨基酸生产能力的赋予或增强也可以通过利用基因重组增强酶活性来进行。在酶活性的增强方面，可以例举对细菌进行修饰而增强参与L-氨基酸生物合成的酶的编码基因的表达的方法。作为增强基因的表达的方法，可以这样来实现将包含基因的DNA 片段导入适当的质粒，例如至少包含负责质粒在微生物内的复制增殖功能的基因的质粒载体，而得到扩增质粒，导入这样的扩增质粒；或者，通过接合、基因转移等使所述基因在染色体上多拷贝化；抑或在所述基因的启动子区域导入突变(参照国际公开小册子W095/34672 号)。当向上述扩增质粒或者染色体上导入目的基因时，用于表达所述基因的启动子可以是能够在棒状杆菌型细菌中发挥功能的任何启动子，可以是所使用的基因自身的启动子，也可以是经修饰的启动子。也可以通过适宜地选择在棒状杆菌型细菌中强力发挥功能的启动子，或者通过使启动子的-35、-10区域与共有序列接近，来进行基因表达量的调节。 诸如上述的增强酶基因表达的方法，记载于国际公开第00/18935号小册子、欧洲专利申请公开1010755号说明书等。以下，针对赋予细菌L-氨基酸生产能力的方法、以及被赋予了 L-氨基酸生产能力的细菌进行示例。L-苏氨酸生产菌作为优选的具有L-苏氨酸生产能力的微生物，可以列举增强了 L-苏氨酸生物合成系统酶中的1种或2种以上活性的细菌。作为L-苏氨酸生物合成系统酶，可以列举天冬氨酸激酶III (IysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、thr操纵子编码的天冬氨酸激酶 I(thrA)、高丝氨酸激酶(thrB)、苏氨酸合酶(thrC)、夭冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)(aspC)。括号内为该基因的简记符号(下同)。所述酶中，特别优选天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸激酶I、高丝氨酸激酶、天冬氨酸氨基转移酶以及苏氨酸合酶。L-苏氨酸生物合成系统基因可以导入苏氨酸分解受到抑制的埃希氏菌属细菌中。作为苏氨酸分解受到抑制的埃希氏菌属细菌，可以列举例如苏氨酸脱氢酶活性缺损的TDH6株(特开2001-346578 号)等。L-苏氨酸生物合成系统酶的酶活性受终产物L-苏氨酸的抑制。因此，为了构建 L-苏氨酸生产菌，优选对L-苏氨酸生物合成系统酶进行修饰以使所述酶不受L-苏氨酸的反馈抑制。此外，上述thrA、thrB和thrC基因组成苏氨酸操纵子，苏氨酸操纵子形成弱化子(attenuator)结构。苏氨酸操纵子的表达受到培养液中异亮氨酸和苏氨酸的抑制，并且表达受到弱化作用的抑制。可通过去除弱化区中的前导序列或弱化子来实现该修饰(参照 Lynn, S. P. et al. 1987. J. Mol. Biol. 194:59-69 ；国际公开第 02/26993 号小册子；国际公开第2005/049808号小册子)。苏氨酸操纵子上游存在天然启动子，可用非天然(non-naive)启动子将其取代 (参考国际公开第98/04715号小册子)。或者，可以构建苏氨酸操纵.子使得苏氨酸生物合成的相关的基因的表达受到λ噬菌体的阻遏物Oppressor)和启动子的调控(参考欧洲专利第0593792号说明书)。而且，为了对细菌进行修饰使其不受L-苏氨酸的反馈抑制， 也可以通过选择对α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)有抗性的菌株来实现。对于如上所述经修饰而不受L-苏氨酸的反馈抑制的苏氨酸操纵子而言，优选的是其在宿主中拷贝数增加，或者是其连接于强启动子而表达量提高。除了通过使用质粒的扩增来增加拷贝数，还可以通过使用转座子、Mu噬菌体等向基因组上转入苏氨酸操纵子来增加拷贝数。理想的是，除了 L-苏氨酸生物合成系统酶之外，还增强糖酵解系统、TCA循环和呼吸链中涉及的基因、调控这些基因表达的基因、和糖摄取基因。这些在L-苏氨酸生产中有效的基因的实例包括转氢酶基因(PntAB)(欧洲专利733712号说明书)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(PepC)(国际公开95/06114号小册子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(欧洲专利877090号说明书)、棒状杆菌型细菌或芽孢杆菌属细菌的丙酮酸羧化酶基因(国际公开 99/18228号小册子、欧洲申请公开1092776号说明书)。此外，增强赋予L-苏氨酸抗性的基因、赋予L-高丝氨酸抗性的基因的表达，或赋予宿主L-苏氨酸抗性、L-高丝氨酸抗性，也是理想的。赋予抗性的基因的实例包括rhtA基因(Livshits,V. A. et al. 2003. Res. Microbiol. 154 :123-135)、rhtB 基因(欧洲专利申请公开第0994190号说明书)、rhtC基因(欧洲专利申请公开第1013765号说明书)和yfiK、 yeaS基因(欧洲专利申请公开第1016710号说明书)。此外，关于对宿主赋予L-苏氨酸抗性的方法，可参考欧洲专利申请公开第0994190号说明书、国际公开第90/04636号小册子记载的方法。作为L-苏氨酸生产菌和用于衍生L-苏氨酸生产菌的亲本株的例子，可以列举 大肠杆菌TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996)(美国专利第5，175，107号、美国专利第5，705，371 号)、大肠杆菌472T23/pYN7 (ATCC 98081)(美国专利第5，631，157号)、大肠杆菌 NRRL-21593 (美国专利第5，939，307号)、大肠杆菌FERM BP-3756 (美国专利第5，474，918 号)、大肠杆菌FERMBP-3519和FERM BP-3520 (美国专利第5，376，538号)、大肠杆菌 MG442 (Gusyatiner 等，1978. Genetika (俄语)，14 :947-956)、大肠杆菌 VL643 和 VL2055 (欧洲专利申请公开第1149911号)等属于埃希氏杆菌属的菌株，但不限于此。TDH-6菌株缺失thrC基因，是蔗糖同化型，并且ilvA基因有泄漏突变(leaky mutation)。该菌株的rhtA基因也有突变，该突变赋予对高浓度的苏氨酸或高丝氨酸的抗性。B-3996菌株携带PVIC40质粒，pVIC40是通过将含有突变的thrA基因的thrA*BC操纵子插入到由RSF 1010获得的载体中而获得。这种突变的thrA基因编码的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I对苏氨酸的反馈抑制基本上已解除。B-3996菌株在1987年11月19 日被保藏于All-Union Scientific Center of Antibiotics (全联盟抗生素科学中心) (Nagatinskaya Street 3-A，117105 Moscow，Russia)，保藏号为 RIA 1867。该菌株也在 1987年4月7日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), (IDorozhny proezd. ,IMoscow 117545, Russia), 保藏号为B-3996。还可以使用大肠杆菌VKPM B-5318(EP 0593792B)作为L-苏氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株。B-5318菌株是非异亮氨酸营养缺陷型的，其中温度敏感的λ噬菌体Cl阻遏物和I3R启动子取代了 PVIC40质粒中的苏氨酸操纵子的调控区域。VKPM Β-5318菌株在 1990年5月3日国际保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM) (IDorozhny proezd.， 1Moscow117545, Russia)，保藏号为 VKPM B-5318。编码大肠杆菌天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因位于以Genbank登录号U00096登录的大肠杆菌MG1655株的基因组序列上的碱基编号337 2，799，该基因编码以GenBank登录号AAC73113登录的蛋白质。编码大肠杆菌高丝氨酸激酶的thrB基因位于以Genbank登录号U00096登录的大肠杆菌MG1655株的基因组序列上的碱基编号2，801 3，733，该基因编码以GenBank登录号AAC73114登录的蛋白质。编码大肠杆菌苏氨酸合酶的thrC基因位于以Genbank登录号U00096登录的大肠杆菌MG1655株的基因组序列上的碱基编号3，734 5，020，该基因编码以GenBank登录号AAC73115登录的蛋白质。这3个基因在编码前导肽的thrL基因的下游以由thrL ABC构成的苏氨酸操纵子的形式编码。为了增加苏氨酸操纵子的表达，优选从操纵子上除去影响转录的弱化子区域是有效的(国际公开第2005/049808号、国际公开第2003/097839号)。编码对苏氨酸的反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA 基因，加上thrB和thrC基因，可以作为一个操纵子从熟知的PVIC40质粒中获得，该质粒存在于苏氨酸生产株大肠杆菌VKPM B-3996菌株中，在美国专利No. 5，705，371中有详述。rhtA基因是作为赋予高丝氨酸以及苏氨酸抗性的基因(rht resistant tothreonine/homoserine,高丝氨酸/苏氨酸抗性)而获得的，其位于以Genbank登录号 U00096登录的大肠杆菌MG1655株的基因组序列上的碱基编号848，433 849，320 (互补链)，该基因编码以GenBank登录号AAC73900登录的蛋白质。此外，已经证明提高rthA的表达的rhtA23突变是相对于ATG起始密码子为_1位的位置上的G — A取代(Livshits， V. A. et al. 2003. ResMicrobiol. 154 123-135、欧洲专利申请公开第 1013765 号)。大肠杆菌的asd基因位于以Genbank登录号U00096登录的大肠杆菌MG 1655株的基因组序列上的碱基编号3，571，798 3，572，901 (互补链)，该基因编码以GenBank登录号AAC76458登录的蛋白质。可以通过使用基于基因碱基序列制作的引物的PCR来获得 (White, T. J. et al. 1989. Trends Genet. 5 185-189 参照)。其它微生物的 asd 基因也可以以同样的方式获得。此外，大肠杆菌的aspC基因位于以Genbank登录号U00096登录的大肠杆菌MG 1655株的基因组序列上的碱基编号983，742 984，932 (互补链)，该基因编码以GenBank 登录号AAC74014登录的蛋白质，可以通过PCR获得。其它微生物的aspC基因也可以以同样的方式获得。L-赖氨酸生产菌以下，以L-赖氨酸生产菌及其构建方法为例进行说明。作为具有L-赖氨酸生产能力的菌株，可以例举L-赖氨酸类似物抗性株或代谢调控突变株。作为L-赖氨酸类似物的例子，可以列举氧化赖氨酸、赖氨酸氧肟酸、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(以下也简记为“AEC”)、Y-甲基赖氨酸、α-氯己内酰胺等，但不限于此。对于所述赖氨酸类似物具有抗性的突变株，可以通过对属于肠杆菌科的细菌或棒状杆菌型细菌实施常规的人工突变处理来获得。作为L-赖氨酸生产菌，具体可以列举大肠杆菌AJ11442株(FERM ΒΡ-1543、NRRL Β-12185 ；参照特开昭56-18596号公报和美国专利第 4346170号说明书)、大肠杆菌VL611株(特开2000-189180号公报)等。此外，作为大肠杆菌的L-赖氨酸生产菌，也可以使用WC196株(参照国际公开第96/17930号小册子)。此外，通过提高L-赖氨酸生物合成系统的酶活性也可以构建L-赖氨酸生产菌。所述酶活性的提高可以通过提高编码酶的基因在细胞内的拷贝数、或对表达调节序列进行修饰来实现。用于增强基因表达的修饰可以通过例如利用基因重组技术提高细胞中基因的拷贝数来进行。例如，可以将包含gapA基因的DNA片段与在宿主细菌中发挥功能的载体、优选多拷贝型载体相连接，来制作重组DNA，然后再将其导入细菌进行转化。提高基因的拷贝数还可以通过使如上所述的基因在细菌的基因组DNA上以多拷贝存在来实现。为了在细菌基因组DNA上多拷贝地导入基因，可以利用染色体DNA上多拷贝存在的序列作为靶标来进行同源重组。作为染色体DNA上多拷贝存在的序列，可以利用重复DNA或存在于转移因子的端部的反向重复序列。此外，可以在存在于基因组上的gapA 基因的旁侧随机连接各种基因，也可以把多个这样的基因来导入到基因组上的不必要的基因中。所述基因导入可以使用温度敏感型载体，或者使用整合(integration)载体来实现。或者，也可以如特开平2-109985号公报所述那样，将基因加载在转座子上，使其发生转移，从而将基因多拷贝地导入基因组DNA上。基因转移到基因组上这一事实的确认， 可以通过以基因的一部分作为探针进行Southern杂交来确认。而且，除了上述的基因拷贝数扩增以外，基因表达的增强还可以通过下述方法实现采用国际公开00/18935号小册子记载的方法，将基因组DNA上或质粒上的基因的各自的启动子等表达调节序列替换为更强力的启动子等表达调节序列，使各基因的-35、-10区域向共有序列接近，对提高基因表达的调节子进行扩增，或者对降低基因表达的调节子进行缺失或弱化。例如，Iac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、araBA启动子、λ噬菌体的I3R启动子、PL启动子、tet启动子、T7启动子、φ 10启动子等是已知的强力启动子。 此外，还可以在gapA基因的启动子区域、SD区域导入碱基取代等，将其修饰得更为强力。启动子强度的评价方法和强力启动子的例子在Goldstein等的论文(ftOkaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol.Annu. Rev. 1995. 1 :105-128)等中有记载。而且，已知对核糖体结合位点(RBQ与起始密码子之间的间隔序列中，特别是对起始密码子紧邻上游的序列中的数个核苷酸的取代，对mRNA的翻译效率有非常大的影响，可以对这些序列进行修饰。基因的启动子等表达调节区域也可以使用启动子搜索载体、GENEITX等基因解析软件来确定。通过所述启动子取代或修饰，基因的表达得到强化。表达调节序列的取代可以采用例如使用温度敏感型质粒的方法、Red驱动整合法(W02005/01017O等。作为编码L-赖氨酸生物合成系统酶的基因，可以列举二氢吡啶二羧酸合成酶基因(dapA)、天冬氨酸激酶基因(IysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapB)、二氨基庚二酸脱碳酸酶基因(IysA)、二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)(以上、国际公开第96/40934 号小册子)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)(特开昭60-87788号公报)、天冬氨酸氨基转移酶基因(aspC)(特公平6-1020 号公报)、二氨基庚二酸差向异构酶基因(dapF) (特开2003-135066号公报)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)(国际公开第00/61723号小册子)等二氨基庚二酸途径的酶的基因，或者高乌头酸水合酶基因(特开2000-157276 号公报)等氨基已二酸途径的酶等的基因。此外，亲本菌株中涉及能量效率(energy efficiency)的基因(cyo) (EP 1170376A)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利5，830，716)、编码具有L-赖氨酸分泌活性的蛋白质的ybjE基因(W02005/073390)、编码谷氨酸脱氢酶的基因(gdhA) (Valle F. et al. 1983. Gene 23 =199-209)或它们的任意组合的基因表达水平可以增加。而且，括号内为所述基因的简记符号。已知大肠杆菌来源的野生型二氢吡啶二羧酸合成酶受L-赖氨酸的反馈抑制，大肠杆菌来源的野生型天冬氨酸激酶受L-赖氨酸的抑制和反馈抑制。因此，在使用dapA基
21因和IysC基因时，优选这些基因是不受L-赖氨酸的反馈抑制的突变型基因。作为编码不受L-赖氨酸的反馈抑制的突变型二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA，可以列举编码具有第118位的组氨酸残基被取代成酪氨酸残基的序列的蛋白质的DNA。此外，作为编码不受L-赖氨酸的反馈抑制的突变型天冬氨酸激酶的DNA，可以列举编码具有第352 位的苏氨酸残基被取代为异亮氨酸残基、第323位的甘氨酸残基被取代为天冬酰胺残基、 第318位的甲硫氨酸被取代为异亮氨酸的序列的AKIII的DNA(关于这些突变体，可参见美国专利第5661012号和第6040160号说明书)。突变型DNA可以通过利用PCR等的定点突变方法获得。而且，作为包含编码突变型氢吡啶二羧酸合成酶的突变型dapA和编码突变型天冬氨酸激酶的突变型IysC的质粒，已知有广宿主域质粒RSFD80、pCAB l、pCABD2 (美国专利第6040160号说明书)。用该质粒转化的大肠杆菌JM109株(美国专利第6040160号说明书)命名为AJ12396，该株于1993年10月观日保藏在日本通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)，保藏号FERM P-13936 ；并于1994年11月1日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERMBP-4859。 RSFD80可采用公知方法从AJ12396株获取。在L-赖氨酸生产中，作为这样的酶，有高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(cadA， ldcC)、苹果酸酶等，该酶的活性降低或缺损的菌株记载于国际公开第1095/^23864号、第 W096/17930号小册子、第W02005/010175号小册子等。为了使赖氨酸脱羧酶活性降低或缺损，优选降低编码赖氨酸脱羧酶的cadA基因和IdcC基因这两者的表达。降低这两个基因的表达可以按照W02006/078039号小册子所述的方法来进行。作为降低或者缺损所述酶活性的方法，可以采用常规的突变处理法或基因重组技术，在基因组上的上述酶的基因中导入使得细胞中该酶的活性降低或缺损的突变。这样的突变的导入可以如下地实现例如，通过基因重组缺损染色体上的编码酶的基因，或者对启动子、shine-dalgarno(SD)序列等表达调节序列进行修饰，等等。此外，还可以这样完成向基因组上的编码酶的区域导入氨基酸取代(错义突变)、或者导入终止密码子(无义突变)、或者导入添加或缺失一 二个碱基的移码突变，或者使基因的一部分或整个区域缺失(Wang，J. P. et al. 2006. J. Agric. Food Chem. 54 :9405-9410 ；Winkler, W. C. 2005. Curr. Opin. Chem. Biol. 9 :594-602 ；Qiu, Ζ. and Goodman, M. F. 1997. J. Biol. Chem. 272 8611-8617 ；ffente, S. R. and Schachman, H. K. 1991. J. Biol. Chem. 266 :20833-20839)。此外，酶活性的降低或缺损还可以这样实现构建编码突变酶的基因，其中编码区域整体或部分缺失，通过同源重组等用该基因取代染色体上的正常基因，或者将转座子、IS因子导入到该基因中。例如，为了通过基因重组导入使得上述酶的活性降低或缺损的突变，可以采用诸如以下的方法。对目的基因的部分序列进行修饰，制备不产生正常发挥功能的酶的突变型基因，用含该基因的DNA转化属于肠杆菌科的细菌，通过突变型基因与染色体上的基因之间发生重组，可以将染色体上的目的基因替换成突变型。如上所述的利用同源重组的基因取代包括称为 “Red 驱动整合(Red-driven integration)” 的方法(Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97 :6640-6645)、组合使用 Red 驱动整合法与 λ 噬菌体来源的切出系统(Cho，Ε. H.，Gumport, R. I.，Gardner, J. F. J. 2002. Bacteriol. 184 =5200-5203)的方法(参照W02005/010175号)等使用线性DNA的方法，或者使用含温度敏感型复制起点的质粒的方法等(美国专利第6303383号、特开平05-007491 号公报)。此外，基于如上述的利用了同源重组的基因取代的位点特异性突变导入还可以利用在宿主中不具有复制能力的质粒来进行。作为优选的L-赖氨酸生产菌，可以列举大肠杆菌WC196 Δ cadAAldcC/ PCABD2 (W02006/078039)。该菌株是通过在WC196株中破坏编码赖氨酸脱羧酶的cadA和 IdcC基因、并导入包含赖氨酸生物合成系统基因的质粒pCABD2(美国专利第6，040，160 号)而构建的菌株。WC196株是由大肠杆菌K-12来源的W3110株出发，用突变型IysC基因替换W3110株染色体上的野生型IysC基因，而后赋予AEC抗性而选育得到的菌株(美国专利第5，827，698号)，所述突变型IysC基因编码第352位的苏氨酸被替换成异亮氨酸， 从而解除了 L-赖氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶III (美国专利第5，661，012号)。WC196 株被命名为大肠杆菌AJ13069，已于1994年12月6日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心、〒305-8566日本国茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM P-14690 ；并于1995年9月四日转(为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERM BP-5252(美国专利第)5，827，698 号)。WC196 AcadA Δ IdcC本身也是优选的L-赖氨酸生产菌。WC196 Δ cadA Δ IdcC被命名为AJ110692，并于2008年10月7日国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(〒305-8566日本国茨(城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM ΒΡ-11027。)pCABD2包含编码具有解除了 L-赖氨酸反馈抑制的突变的大肠杆菌来源二氢吡啶二羧酸合成酶(DDPQ的突变型dapA基因、编码具有解除了 L-赖氨酸反馈抑制的突变的大肠杆菌来源天冬氨酸激酶III的突变型IysC基因、编码大肠杆菌来源二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因、以及编码乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)来源二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因(国际公开第W095/16042、W001/53459号小册子)。增强如上所述的L-赖氨酸生物合成相关酶的基因表达的方法、降低酶活性的方法对于其它编码L-氨基酸生物合成酶的基因也同样适用。作为具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌，可以列举AEC抗性突变株(乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum) AJ 11082 (NRRLB-11470)株等参照特公昭56-1914号公报、特公昭56-1915号公报、特公昭57-14157号公报、特公昭57-14158号公报、特公昭57-30474号公报、特公昭58-10075号公报、特公昭59-4993号公报、特公昭 61-35840号公报、特公昭62-24074号公报、特公昭62-36673号公报、特公平5-11958号公报、特公平7-11M37号公报、特公平7-11M38号公报)；生长需要L-高丝氨酸等氨基酸的突变株(参照特公昭48-28078号公报、特公昭56-6499号公报)；显示AEC抗性、且需要L-亮氨酸、L-高丝氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸等氨基酸的突变株(参照美国专利第3708395号以及第3825472号说明书)；显示DL-α -氨基-ε -己内酰胺、α -氨基-月桂内酰胺、天冬氨酸-类似物、磺胺类药、醌类、N-月桂酰亮氨酸抗性的L-赖氨酸生产突变株；显示草酰乙酸脱碳酸酶(脱羧酶)或呼吸体系酶抑制剂抗性的L-赖氨酸生产突变株(特开昭50-53588号公报、特开昭50-31093号公报、特开昭52-102498号公报、特开昭53-9394号公报、特开昭53-86089号公报、特开昭55-9783 号公报、特开昭55-9759号公报、特开昭56-3四95号公报、特开昭56-39778号公报、特公昭 53-43591号公报、特公昭53-1833号公报)；需要肌醇或乙酸的L-赖氨酸生产突变株(特开昭55-9784号公报、特开昭56-8692号公报)；对氟代丙酮酸或34°C以上的温度显示敏感性的L-赖氨酸生产突变株(特开昭55-9783号公报、特开昭53-86090号公报)；对乙二醇显示抗性、且生产L-赖氨酸的短杆菌属或棒杆菌属的生产突变株(美国专利第4411997号说明书)等。L-半胱氨酸生产菌L-半胱氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如用编码反馈抑制抗性丝氨酸乙酰转移酶的不同cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15 (美国专利6，218，168，俄罗斯专利申请2003121601)，具有过表达编码适于向细胞分泌有毒物质的蛋白的基因的大肠杆菌W3110 (美国专利5，972，663)，半胱氨酸脱巯基酶(cysteinedesulfohydrase)活性减少的大肠杆菌菌株(特开平11-155571号)；由cysB 基因编码的半胱氨酸调节子的正向转录调控物活性增强的大肠杆菌W3110(国际公开第 0127307 号)，等等。L-亮氨酸生产菌L-亮氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括，但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如，菌株57(VKPMB-7386，美国专利第 6，124，121号))或对亮氨酸类似物(包括β-2-噻吩丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-氮亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸等)有抗性的大肠杆菌菌株(特公昭62-34397号和特开平8-70879 号)；通过国际公开第96/069 号中描述的基因工程方法获得的大肠杆菌菌株；大肠杆菌 H-9068 (特开平8-70879号)，等等。用于本发明的细菌可以通过增加涉及L-亮氨酸生物合成的一种以上的基因的表达来加以改进。这些基因的实例可优选例举以编码解除了 L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合酶的突变IeuA基因(美国专利第6，403，342号)为代表的IeuABCD操纵子中的基因。此外，可以通过增加编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白的一种以上的基因的表达来改进用于本发明的细菌。这类基因的实例包括1^2682和1^2683基因(ygdH基因)(欧洲专利申请公开第1239041号)。棒状杆菌型细菌中的L-异亮氨酸生产菌的例子包括扩增了编码支链氨基酸分泌蛋白的brnE基因的棒状杆菌型细菌(特开2001-169788)、通过与L-赖氨酸生产菌进行原生质体融合而被赋予了 L-异亮氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌(特开昭62-74293)、 增强了高丝氨酸脱氢酶的棒状杆菌型细菌(特开昭62-91193)、苏氨酸氧肟酸(threonine hydroxamete)抗性菌株(特开昭 62_195四3)、α -酮丙二酸(α -ketomalonic acid)抗性菌株(特开昭61-15695)和甲基赖氨酸抗性菌株(特开昭61-15696)。L-组氨酸生产菌L-组氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株大肠杆菌M株(VKPM B-5945、俄罗斯专利第2003677号)、大肠杆菌80株 (VKPM B-7270、俄罗斯专利第2119536号)、大肠杆菌NRRLB-12116-B12121 (美国专利第 4，388，405 号)、大肠杆菌 H-9342(FERM BP-6675)以及 H-9343 (FERM BP-6676)(美国专利第6，344，347号)、大肠杆菌H-9341 (FERM BP-6674)(欧洲专利申请公开第1085087号)、 大肠杆菌AI80/pFM201 (美国专利第6，258，554号)，等等。L-组氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子还包括如下菌株，所述菌株中编码 L-组氨酸生物合成系统酶的1种以上的基因的表达增强。相关基因的实例包括ATP磷酸核糖基转移酶基因(hisG)、磷酸核糖基AMP环化水解酶基因(hisl)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶基因(hisl)、磷酸核糖基亚氨甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖核苷酸异构酶基因(pho sphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase)(hisA)、酉先胺转移酶基因(hisH)、组氨醇磷酸氨基转移酶基因(hisC)、组氨醇磷酸酶基因(hisB)、组氨醇脱氢酶基因(hisD)等。已知hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成系统酶被L-组氨酸所抑制，因此还可以通过向ATP磷酸核糖基转移酶基因(hisG)中引入诱导可赋予对反馈抑制的抗性的突变，来有效地增加产生L-组氨酸的能力(俄罗斯专利2003677和2119536)。具有L-组氨酸生产能力的菌株具体实例包括大肠杆菌FERM-P 5038和5048，其已经导入了携带编码L-组氨酸生物合成系统酶的DNA的载体(特开昭56-005099号)，导入了用于氨基酸输送的基因的大肠杆菌菌株(欧洲专利申请公开第1016710号)，赋予了磺胺胍、DL-1，2，4-三唑-3-丙氨酸和链霉素抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270，俄罗斯专利2119536号)，等等。L-谷氨酸生产菌 L-谷氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括、但不限于大肠杆菌 (E. coli)VL334thrC+(EP 1172433)等属于埃希氏菌属的菌株。大肠杆菌VL3!34 (VKPM B-1641)是L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型菌株，其在thrC和ilvA基因中有突变(美国专利4，278，765)。利用可在野生型大肠杆菌菌株K_12 (VKPM B-7)细胞中增殖的噬菌体 Pl，通过常规转化方法来转移thrC基因的野生型等位基因。结果，获得了 L-异亮氨酸营养缺陷型的L-谷氨酸生产菌VL3!MthrC+(VKPM B-8961)。L-谷氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括但不限于L-谷氨酸生物合成系统酶中的1种或2种以上的活性得到增强的菌株。作为所述基因的例子，可以列举 谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltAB)、异柠檬酸脱氢酶 (icdA)、顺乌头酸水合酶(acnA，acnB)、柠檬酸合酶(gltA)、甲基柠檬酸合酶(prpC)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PPC)、丙酮酸脱氢酶(aceEF，IpdA)、丙酮酸激酶(pykA，pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(PPsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸变位酶(pgmA，pgml)、磷酸甘油酸激酶 (Pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、丙糖磷酸异构酶(tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、 磷酸果糖激酶(pfkA，pfkB)、葡萄糖磷酸异构酶(pgi)等。所述酶中，优选谷氨酸脱氢酶、 柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶以及甲基柠檬酸合酶。作为经过了修饰使得柠檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达增加的菌株的例子，可以列举欧洲专利申请公开第1078989号、欧洲专利申请公开第955368号以及欧洲专利申请公开第952221号中公开的菌株。作为L-谷氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子，还可以列举下述酶的活性降低或缺损的菌株，所述酶催化从L-谷氨酸生物合成途径改道而合成L-谷氨酸以外的化合物。作为这样的酶的例子，可以列举异柠檬酸裂合酶(aceA)、α-酮戊二酸脱氢酶
25(sucA)、磷酸乙酰转移酶(pta)、乙酸激酶(ack)、乙酰羟基酸合酶(ilvG)、乙酰乳酸合酶 (ilvl)、甲酸乙酰转移酶(pfl)、乳酸脱氢酶(Idh)、谷氨酸脱羧酶(gadAB)等。α -酮戊二酸脱氢酶活性缺损、或α-酮戊二酸脱氢酶活性降低的属于埃希氏菌属的细菌及其获取方法在美国专利第5，378，616号和第5，573，945号中有记载。作为具体例子，可以列举下述菌株。大肠杆菌W3IIOsucA Kmr大肠杆菌AJU624(FERM BP-3853)大肠杆菌AJU6^(FERM BP-3854)大肠杆菌AJ1^49(FERM BP-4881)大肠杆菌W3110sucA: :Kmr是通过破坏大肠杆菌W3110的α -酮戊二酸脱氢酶基因(以下也称“sucA基因”)而得到的菌株。该菌株的α-酮戊二酸脱氢酶完全缺损。此外，作为α -酮戊二酸脱氢酶活性降低的棒状杆菌型细菌，可以例举以下菌株。乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum) L30-2 株(特开 2006-340603 号说明书)乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum) Δ S 株(国际公开 95/34672 号小册子)乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum) AJ12821 (FERM BP-4172 ；参照法国专利公报9401748号说明书)黄色短杆菌AJU822 (FERM BP-4173 ；法国专利公报9401748号说明书)谷氨酸棒杆菌AJU823 (FERM BP-4174 ；法国专利公报9401748号说明书)谷氨酸棒杆菌L30-2株(特开2006-340603号)作为L-谷氨酸生产菌的其它例子，可以列举属于埃希氏菌属、且对天冬氨酸代谢拮抗物质有抗性的菌株。所述菌株可以缺损α-酮戊二酸脱氢酶，可以例举大肠杆菌 AJ13199 (FERM BP-5807)(美国专利第5，908，768号)，以及还降低了 L-谷氨酸分解能力的 FFRM P-12379(美国专利第 5,393,671 号)；AJ13138 (FERM BP-5565)(美国专利第 6，110，714 号)等。作为Pantoea ananatis的L-谷氨酸生产菌的例子,可以列举Pantoeaananatis AJ13355株。该菌株是从静R县磐田市的土壤中作为能够在低pH下在含L-谷氨酸和碳源的培养基中生长的菌株而分离出来的菌株。Pantoeaananatis AJ13355于1998年2月19 日被保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址〒305-8566日本国茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM P-16644 ；于1999年1月11日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERM BP-6614。而且，该菌株在分离出来时被鉴定为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)，并作为成团肠杆菌AJ13355保藏，但近年来通过16S rRNA的碱基序列解析等，其被重新分类为Pantoea ananatis。此外，作为Pantoea ananatis的L-谷氨酸生产菌，可以列举α -酮戊二酸脱氢酶 (aKGDH)活性缺损、或者a KGDH活性降低的属于泛菌属的细菌。作为这样的菌株有缺损 AJ13355株的a KGDH-El亚基基因(sucA)而得到的AJ13356 (美国专利第6，331，419号)， 以及从AJ13355株中作为粘液质低生产突变菌株选择出来的SC17株衍生的sucA基因缺损株SC17sucA(美国专利第6，596，517号)。AJ13356于1998年2月19日保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心、 〒305-8566日本国茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM P-16645，并于1999年1月11日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERM BP-6616。AJ13355 以及AJ13356在上述保藏机构是作为EntercAacter agglomerans保藏的，但是在本说明书中，将其描述为Pantoeaananatis。此外，SC17sucA株的内部编号为AJ417，已于2004年2 月沈日保藏于前述的产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏号FERMBP-08646。而且，作为属于Pantoea ananatis的L-谷氨酸生产菌，可以列举SC17sucA/ RSFCPG+pSTVCB 株、AJ13601 株、NP106 株以及 NAl 株。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB 株是在SC17sucA株中导入大肠杆菌来源的包含柠檬酸合酶基因(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(PPsA)和谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)的质粒RSFCPG以及乳发酵短杆菌 (Brevibacteriumlactofermentum)来源的包含柠檬酸合酶基因(gltA)的质粒pSTVCB而得到的菌株。AJ13601株是从该SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株中作为低pH下显示出对高浓度 L-谷氨酸的抗性的菌株而选择出的菌株。此外，NP106株是质粒RSFCPG+pSTVCB从AJ13601 株脱落而得到的菌株。AJ13601株于1999年8月18日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(亍305-8566日本国茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)， 保藏号FERMP-17516，并于2000年7月6日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERM BP-7207。而且，作为赋予棒状杆菌型细菌L-谷氨酸生产能力的方法，可以采用扩增编码动力敏感离子通道(mechanosensitive channel)的yggB基因的方法(国际公开 W02006/070944号)，导入在编码区域内具有突变的突变型yggB基因的方法。yggB基因位于以Genbank登录号NC_003450登录的谷氨酸棒杆菌ATCC13032株的基因组序列上的碱基编号1，337，692 1，336，091 (互补链)，该基因编码以GenBank登录号NP_600492登录的膜蛋白质(也称为NCgl 1221)。作为赋予或者增强L-谷氨酸生产能力的其它方法，还可以列举赋予对有机酸类似物、呼吸链抑制剂等的抗性的方法，和赋予对细胞壁合成抑制剂的敏感性的方法。例如 赋予单氟乙酸抗性的方法(特开昭50-113209)、赋予腺嘌呤抗性或胸腺嘧啶抗性的方法 (特开昭57-065198)、削弱脲酶的方法(特开昭52-038088)、赋予丙二酸抗性的方法(特开昭52-038088)、赋予苯并吡喃酮或萘醌类抗性的方法(特开昭56-1889)、赋予HOQNO抗性的方法(特开昭56-140895)、赋予α -酮丙二酸抗性的方法(特开昭57-2689)、赋予胍抗性的方法(特开昭56-35981)和赋予青霉素敏感性的方法(特开平4-88994)，等等。作为这样的抗性菌的具体例子，可以列举诸如下述的菌株。黄色短杆菌AJ3949 (参照 FERM ΒΡ-2632 特开昭 50-113209)谷氨酸棒杆菌AJl 1628(参照 FERM P-5736 ；特开昭 57-065198)黄色短杆菌AJl 1355 (参照FERM P-5007 ；特开昭56-1889号公报)谷氨酸棒杆菌AJl 1368 (参照FERM P-5020 ；特开昭56-1889号公报)黄色短杆菌AJl 1217(参照FERM P-4318 ；特开昭57-2689号公报)谷氨酸棒杆菌AJl 1218 (参照FERM P-4319 ；特开昭57-2689号公报)黄色短杆菌AJl 1564(参照FERM P-5472 ；特开昭56-140895公报)黄色短杆菌AJ11439 (参照FERM P-5136 ；特开昭56-35981号公报)
谷氨酸棒杆菌H7684 (参照FERM BP-3004 ；特开平04-88994号公报)乳发酵短杆菌(Brevibacteri um lactofermentum) AJl 1426 (参,照 FERMP—5123 ； 特开平56-048890号公报)谷氨酸棒杆菌AJl 1440(参照FERM P-5137 ；特开平56-048890号公报)乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum) AJl 1796 (参照 FERMP-6402 ；特开平58-158192号公报)L-苯丙氨酸生产菌L-苯丙氨酸生产菌或者用于衍生L-苯丙氨酸生产菌的亲本株的实例，可以列举， 但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶以及酪氨酸阻遏物缺损的大肠杆菌 AJ12739(tyrA: :TnlO, tyrR) (VKPMB-8197)(国际公开 03/044191 号)，携带了编码解除了反馈抑制的分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的突变型pheA34基因的大肠杆菌 HW1089(ATCC55371)(美国专利第 5，354, 672 号)，大肠杆菌MWEC101_b (KR8903681)、大肠杆菌 NRRL B-1214UNRRL B_12145、NRRL B-12146 以及 NRRLB-12147 (美国专利第 4,407,952 号)等。此外，也可以使用携带了编码解除了反馈抑制的分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶基因的大肠杆菌 K-12 [W3110 (tyrA) /pPHAB] (FERM BP-3566)、大肠杆菌 K-12 [W3110 (tyrA) / pPHAD] (FERM BP-12659)、大肠杆菌 K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERMBP-12662)以及命名为 AJ l 04的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB](FERM BP-3579)作为亲本株(EP 488424B1) 0此外，还可使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白质的活性增加的属于埃希氏菌属的L-苯丙氨酸生产菌(美国专利申请公开2003/0148473号以及 2003/0157667、国际公开 03/044192 号)。作为属于棒状杆菌型细菌的苯丙氨酸生产菌，可以使用磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或丙酮酸激酶活性减弱的谷氨酸棒状杆菌BPS-13株(FERMBP-1777)，K77 (FERM BP-2062) 和K78(FERM BP-2063)(欧洲专利公开公报331145号，特开平02303495)，酪氨酸营养缺陷株(特开平05049489)等。此外，对于苯丙氨酸生产菌，通过进行修饰使得将副产物摄入细胞内，例如通过增加L-色氨酸摄取基因tnaB或mtr或者L-酪氨酸摄取基因tyrP的表达量，也可以获得高效地生产L-苯丙氨酸的菌株(EP1484410)。L-色氨酸生产菌L-色氨酸生产菌或用于诱导L-色氨酸生产菌的亲本株的例子包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株大肠杆菌JP4735/pMU3(^8 (DSM10122)和JP6015/ PMU91 (DSM10123)，其色氨酰-tRNA合成酶缺陷，该酶由突变的trpS基因编码(美国专利5，756，345)；大肠杆菌SV164(pGH5)，其具有编码不受丝氨酸反馈抑制性的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码不受色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase)的trpE等位基因(美国专利6，180，373)；色氨酸酶缺陷的大肠杆菌 AGX17(pGX44)(NRRL B-12263)和 AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264) (美国专利4，371，614)；磷酸烯醇丙酮酸的生产能力增加的大肠杆菌AGX17/pGX50， pACKG4-pps(W09708333，美国专利6，319，696)等等。此外，还可以使用由yedA基因或yddG 基因编码的蛋白的活性增强的属于埃希氏菌属的L-色氨酸生产菌(美国专利申请公开 2003/0148473 和 2003/0157667)。
作为L-色氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子，还可以列举选自邻氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢酶(serA)、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶 (aroG)、3_脱氢奎宁酸合酶(aroB)、莽草酸脱氢酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5_烯醇酸丙 ||酉先莽草酸 3- 舞酸合Sl (aroA, 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)、分支酸合酶(aroC)、预苯酸脱水酶、分支酸变位酶以及色氨酸合酶(trpAB)中的1种或2种以上酶的活性增强的菌株。预苯酸脱水酶和分支酸变位酶以双功能酶(chorismatemutase/ prephenate dehydrogenase (CM/PDH))的形式被pheA基因编码。所述酶之中，特别优选磷酸甘油酸脱氢酶、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶、3-脱氢奎宁酸合酶、莽草酸脱水酶、莽草酸激酶、5-烯醇酸丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶、分支酸合酶、预苯酸脱水酶、分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶两者都受L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因此可以向这些酶中引入使反馈抑制解除的突变。具有此类突变的菌株的具体实例包括具有脱敏型邻氨基苯甲酸合酶的大肠杆菌SV164、和通过将质粒 pGH5(国际公开94/08031)导入大肠杆菌SV164而获得的转化菌株，所述质粒pGH5包含编码解除了反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的突变serA基因。L-色氨酸生产菌或用于诱导L-色氨酸生产菌的亲本株的例子还包括导入了包含编码抑制解除型邻氨基苯甲酸合酶的基因的色氨酸操纵子的菌株(特开昭57-71397号，特开昭62-244382号，美国专利第4，371，614)。此外，可以通过增加色氨酸操纵子(trpBA)中编码色氨酸合酶的基因的表达来赋予L-色氨酸生产能力。色氨酸合酶由α和β亚单位组成，这两种亚单位分别由trpA和trpB基因编码。另外，可以通过增强异柠檬酸裂合酶-马来酸合酶操纵子的表达来改进L-色氨酸生产能力(国际公开2005/103275)。作为棒状杆菌型细菌，可以使用下列菌株磺胺胍(sulfaguanidine)抗性株谷氨酸棒杆菌AJ12118(FERM BP-478，特许01681002号)、导入了色氨酸操纵子的棒状杆菌型细菌(特开昭63M0794号公报)，导入了编码棒状杆菌型细菌来源的莽草酸激酶的基因的棒状杆菌型细菌(特开01994749号公报)。L-脯氨酸生产菌作为L-脯氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子，可以列举ilvA基因缺损、且能够生产L-脯氨酸的大肠杆菌702ilvA(VKPM B-8012)(欧洲专利公开公报1，172，433号) 等属于埃希氏菌属的菌株，但不限于此。本发明中使用的细菌，可以通过增加一种以上参与L-脯氨酸生物合成的基因的表达来进行改良。作为L-脯氨酸生产菌所优选的基因的例子，可以列举编码解除了 L-脯氨酸反馈抑制的谷氨酸激酶的ProB基因(德国专利第3127361号)。而且，本发明中使用的细菌，可以通过增加一种以上编码从细菌细胞中分泌L-氨基酸的蛋白质的基因的表达来进行改良。作为这样的基因，可以列举1^682基因和1^683基因(ygdH基因)(欧洲专利公开公报1，239，041号)。作为具有L-脯氨酸生产能力的属于埃希氏菌属的细菌的例子，可以列举NRRL B-12403以及NRRL B-1M04 (英国专利第2075056号)、VKPMB-8012 (俄罗斯专利申请 2000124295)、德国专利第3127361号所述的质粒突变体、Bloom F. R等(The 15th Miami winter symposium, 1983, p. 34)所述的质粒突变体等大肠杆菌株。L-精氨酸生产菌
L-精氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌237菌株(VKPM B-7925)(美国专利申请公开2002/05831 及其带有突变的N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamatesynthase)的衍生菌株(俄罗斯专利申 it 2, 001, 112，869)，大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926)(欧洲专利公开公报1，170，358号)， 引入了编码N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamate synthetase)的argA基因的精氨酸生产株(欧洲专利公开公报1，170, 361号)，等等。L-精氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子还包括编码L-精氨酸生物合成系统酶的1种以上基因的表达增加的菌株。相关基因的实例包括N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶基因(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶基因(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶基因(argD)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶基因(argF)、精氨琥珀酸合成酶基因(argG)、 精氨琥珀酸裂合酶基因(argH)和氨甲酰基磷酸合成酶基因(carAB)。L-缬氨酸生产菌L-缬氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括但不限于经修饰而过表达 iIvGMEDA操纵子的菌株(美国专利5，998，178)。优选将衰减所需的ilvGMEDA操纵子的区域移除以使操纵子的表达不会被产生的L-缬氨酸所削弱。此外，优选将操纵子中的ilvA 基因破坏从而降低苏氨酸脱氨酶的活性。L-缬氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子还包括具有氨酰t-RNA合成酶突变的突变株(美国专利5，658，766)。例如，可以使用大肠杆菌VL1970，该菌株在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。已将大肠杆菌VL1970在1988年6月M日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM) (IDorozhny Proezd. , 1 Moscow 117545，Russia)， 保藏号为VKPM B-4411。此外，还可以使用生长需要硫辛酸(lipoic acid)的突变株和/或缺乏H+-ATP酶的突变株(国际公开96/06926)作为亲本株。作为棒状杆菌型细菌中的L-缬氨酸生产菌，包括例如通过修饰而增强了编码 L-缬氨酸生物合成相关酶的基因的表达的菌株。L-缬氨酸生物合成相关酶的实例包括由ilvBNC操纵子编码的酶，S卩，由ilvBN编码的乙酰羟酸合酶、由ilvC编码的异构还原酶 (isomero-reductase)(国际公开00/50624)。此外，由于iIvBNC操纵子受到L-缬氨酸和 /或L-异亮氨酸和/或L-亮氨酸的操纵子表达调控(transcriptional regulation)，所以最好解除弱化作用，以解除由所生成的L-缬氨酸导致的表达抑制。作为具有L-缬氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌，可以通过降低或者缺损至少一种与减少L-缬氨酸产生的物质代谢途径相关的酶的活性来进行。例如，可以考虑降低涉及L-亮氨酸合成的苏氨酸脱水酶的活性，或降低涉及D-泛酸合成的酶的活性(国际公开 W00050624)。其它赋予L-缬氨酸生产能力的方法还包括例如赋予对氨基酸类似物等的抗性的方法。例如，可以列举L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸营养缺陷性的、并对D-核糖、嘌呤核糖核苷或嘧啶核糖核苷有抗性的、并且具有L-缬氨酸生产能力的突变菌株(FERM P-1841， FERM P-29，特公昭53-025034)，对聚酮类有抗性的突变菌株(FERM P-1763, FERM P-1764 ； 特公平06-065314)，在以乙酸为唯一碳源的培养基中对L-缬氨酸有抗性、且在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中对丙酮酸类似物(氟代丙酮酸(fluoropyruvic acid)等)敏感的突变菌株(FERM BP-3006, BP-3OO7,特许:30( 9 号)。L-异亮氨酸生产菌L-异亮氨酸生产菌或用于衍生L-异亮氨酸生产菌的亲本株的例子包括，但不限于对6- 二甲基氨基嘌呤有抗性的突变株(特开平5-304969号)，对异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸氧肟酸等具有抗性的突变株，以及对DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突变株(特开平5-130882号)。此外，还可以使用以编码涉及L-异亮氨酸生物合成的蛋白(如苏氨酸脱氨酶、乙酰羟酸合酶 (acetohydroxatesynthase)等)的基因转化的重组菌株作为亲本株(特开平2_458号， FR0;356739，和美国专利第 5，998，178 号)。属于棒状杆菌型细菌的L-异亮氨酸生产菌的例子包括扩增了编码支链氨基酸分泌蛋白的brnE基因的棒状杆菌型细菌(特开2001-169788)、通过与L-赖氨酸生产菌进行原生质体融合而被赋予了 L-异亮氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌(特开昭62-74293)、 增强了高丝氨酸脱氢酶的棒状杆菌型细菌(特开昭62-91193)、苏氨酸氧肟酸(threonine hydroxamete)抗性菌株(特开昭 62_195四3)、α -酮丙二酸(α -ketomalonic acid)抗性菌株(特开昭61-15695)和甲基赖氨酸抗性菌株(特开昭61-15696)。L-甲硫氨酸生产菌L-甲硫氨酸生产菌或用于衍生它的亲本株的例子包括、但不限于L-苏氨酸营养缺陷株、对正亮氨酸有抗性的突变株(特开2000-139471号)。而且，还可以使用缺损了甲硫氨酸阻遏物的菌株、用编码高丝氨酸转琥珀酰酶、胱硫醚Y-合酶等L-甲硫氨酸生物合成相关蛋白质的基因转化过的重组菌株作为亲本株(特开2000-139471号)。在通过基因重组来培育上述L-氨基酸生产菌时，所使用的基因不限于具有上述基因信息的基因或具有公知序列的基因，在不损害所编码的蛋白质的功能的前提下，还可以使用该基因的同源物、人工修饰体等具有保守突变的基因。即，还可以是下述基因，所述基因编码具有在公知的蛋白质的氨基酸序列中包含一个或数个位置上的一个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加等而成的序列的蛋白质。这里，所谓“一个或数个”，虽然因氨基酸残基的种类或其在蛋白质的立体结构中的位置而异，但具体地是指优选1 20个、更优选1 10个、更优选1 5个。作为保守突变，当取代部位为芳族氨基酸时，是指在Wie、Trp, Tyr之间相互取代的突变，当取代部位为疏水性氨基酸时，是指在Leu、lie、Val之间相互取代的突变，当取代部位为极性氨基酸时，是指在Gin、Asn之间相互取代的突变，当取代部位为碱性氨基酸时，是指在Lys、Arg, His之间相互取代的突变，当取代部位为酸性氨基酸时，是指在Asp、Glu之间相互取代的突变，当取代部位为带有羟基的氨基酸时，是指在％r、Thr之间进行相互取代的突变。保守突变的代表是保守取代，作为可视作保守取代的取代，具体地可以列举从Ala到Ser或Thr 的取代，从Arg到Gin、His或Lys的取代，从Asn到Glu、Gin、Lys、His或Asp的取代，从 Asp 到 Asn、Glu 或 Gln 的取代，从 Cys 到 Ser 或 Ala 的取代，从 Gln 到 Asn、Glu、Lys、His、 Asp或Arg的取代，从Glu到Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的取代，从Gly到Pro的取代，从His 到 Asn、Lys、Gin、Arg 或 Tyr 的取代，从 Ile 到 Leu、Met、Val 或 Wie 的取代，从 Leu 到 lie、 Met、Val 或 Phe 的取代，从 Lys 到 Asn、Glu、Gin、His 或 Arg 的取代，从 Met 到 lie、Leu、Val或Phe的取代，从Phe到Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代，从Ser到Thr或Ala的取代，从 Thr到Ser或Ala的取代，从Trp到Phe或Tyr的取代，从Tyr到His、Phe或Trp的取代， 以及从Val到Met、Ile或Leu的取代。此外，如上所述的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等还包括因基于基因所来源的微生物的个体差异、种间差异等情形而天然发生的突变 (mutant或variant)而产生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。这样的基因例如可以这样获得采用定点突变法对公知基因的碱基序列进行修饰，使得被编码的蛋白质的特定部位处的氨基酸残基包含取代、缺失、插入或增加。而且，具有如上所述的保守突变的基因还可以是编码下述蛋白质的基因就编码的氨基酸序列全长而言，其与野生型蛋白质具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、特别优选97%以上的同源性，且具有与野生型蛋白质等同的功能。此外，可以将基因序列中各自的密码子取代为易于在基因所导入的宿主中使用的密码子。具有保守突变的基因可以通过突变剂处理等常规突变处理中使用的方法来获得。此外，基因还可以是下述DNA，所述DNA与公知基因序列的互补序列或可由所述互补序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有与公知基因产物等同的功能的蛋白质。 这里，“严格条件”，是指形成所谓特异性杂交体，但不形成非特异性杂交体的条件。举例说明在具有高同源性的DNA之间、例如具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、 特别优选97%以上的同源性的DNA之间发生杂交，而同源性低于上述的DNA之间则不发生杂交的条件；或者在与常规Southern杂交的洗涤条件即60°C、1 X SSC、0. 1 % SDS，优选 0. 1XSSC、0. SDS，更优选68°C、0. 1XSSC、0. 1 % SDS相当的盐浓度、温度下，洗涤1次更优选2 3次的条件。作为探针，也可以使用基因的互补序列的一部分。这种探针可以通过PCR制备，其中PCR以基于公知的基因序列制备的寡核苷酸为引物，以包含这些碱基序列的DNA片段为模板来进行。例如，当使用300bp左右长度的DNA片段作为探针时，杂交的洗涤条件可以是例如 50°C、2XSSC、0. 1% SDS0上述的关于基因同源物以及保守突变的记载，同样适用于前述的脂肪酶基因。<3>L_氨基酸的生产方法在本发明的L-氨基酸生产方法中，用含微型藻类的所述处理物的培养基培养具有L-氨基酸生产能力的细菌，在培养物中生产并蓄积L-氨基酸，并从该培养物收集L-氨基酸。或者，(a)用培养基培养微型藻类，将该培养物用选自破碎、提取、分级以及水解中的 1种以上方法进行处理，制备促进具有L-氨基酸生产能力的细菌的L-氨基酸生产蓄积的该微型藻类的处理物；(b)用该包含微型藻类的处理物的培养基培养该细菌，在培养物中生产并蓄积L-氨基酸；(c)从该培养物收集L-氨基酸。优选包含所述处理物作为碳源，在这种情况下，特别优选包含淀粉的糖化物或者油脂的水解物的处理物。所述“作为碳源”是指能够在细菌增殖以及L-氨基酸生产中作为构成菌体成分以及L-氨基酸的碳元素的供给源做出实质性贡献。如果与未添加由微型藻类生产的有机物的培养基相比，在使用添加了水解物的培养基进行培养的情况下，细菌的生长或者L-氨基酸的生成蓄积良好，则可以做出所述水解物是碳源的评价。而且，培养基可以仅包含由微型藻类生产的有机物作为碳源，也可以还包含其它碳源。
本发明的方法可以采用分批培养(batch culture)、流加培养 (Fed-batchculture)、连续培养法(continuous culture)中的任何方法,培养基中的油脂水解物可以包含在初始培养基中，也可以包含在流加培养基中，或者包含于这两者中。流加培养是指下述培养方法将培养基连续地或间歇地添加至培养容器中，并且在培养完成之前不从容器中取出培养基。此外，连续培养指下述培养方法连续地或间歇地将培养基流加至培养容器中，同时从容器中取出培养基(通常而言，等于所流加的培养基的量)。“初始培养基”的意思是在流加培养或连续培养中，在流加流加培养基之前的分批培养中所用的培养基(培养开始时的培养基)；“流加培养基”的意思是在进行流加培养或连续培养时，提供至发酵罐的培养基。此外，分批培养(batch culture)是指每批一次准备新的培养基，将菌株接种到其中，并且直至收获都不加入培养基。所使用的由微型藻类生产的有机物，可以使任何浓度，只要该浓度适于L-氨基酸生产即可。培养基中含有的作为淀粉糖化物的葡萄糖浓度是优选0.05w/V% 50w/V%左右、更优选0. 1 八％ 4(^八％左右、特别优选0.2 八％ 2(^八％左右。培养基中含有的作为油脂水解物的甘油以及脂肪酸的量理想的是0. 01 10W/v%、优选0. 02 5W/v%、更优选0. 05 2W/v%左右。由微型藻类生产的有机物可以单独使用，也可以与葡萄糖、果糖、 蔗糖、废糖蜜、淀粉水解物等其它碳源组合使用。这种情况下，由微型藻类生产的有机物与其它碳源可以以任意比率混合，但理想的是，碳源中的由微型藻类生产的有机物的比率为 10重量％以上、更优选50重量％以上、更优选70重量％。优选的其它碳源是，葡萄糖、果糖、 蔗糖、乳糖、半乳糖、废糖蜜、淀粉水解物、生物质水解而得到的糖液等糖类、乙醇、甘油等醇类、富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类。此外，当在存在有机酸作为缓冲液的条件下进行淀粉的酶水解时，可以将该有机酸与糖化物一起添加到培养基中作为碳源。碳源中的淀粉糖化物与有机酸的比率可以是任意的，优选为1 1 1 3。作为有机酸可以是任意的，只要所使用的细菌能够同化即可， 可以例举乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸等，特别优选乙酸。培养开始时的由微型藻类生产的淀粉的糖化物与油脂的水解物的优选初始浓度如上述，但根据培养中由微型藻类生产的淀粉的糖化物与油脂的水解物的消耗情况，可以添加由微型藻类生产的有机物的混合物。而且，在本发明中，可以在培养的全部步骤中均包含一定浓度的藻类来源的有机物，也可以仅将其添加在流加培养基或者初始培养基中，而如果其它碳源充足的话，还可以存在一定时间的油脂水解物不足的时期。“暂时性地”可以是指例如全部发酵时间中的10% 以内或20%以内、最大30%以内的时间里油脂水解物不足。像这样油脂的水解物的浓度有时暂时性地变为0、但存在利用包含由藻类生产的有机物的培养基进行培养的期间的情形， 包含在如上述的本发明的“培养基包含由藻类生产的有机物作为碳源”的表述中。所使用的培养基中除了包含由藻类生产的有机物以外，可以使用在利用微生物进行的L-氨基酸发酵生产中传统上一直使用的培养基。即，可以使用除了碳源以外、还包含氮源、无机离子以及视需要的其它有机成分的常规培养基。这里，作为氮源，可以使用硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、乙酸铵、尿素等无机铵盐或硝酸盐，大豆水解物等有机氮，氨气、氨水等。此外，还可以利用蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆水解物等。 培养基中可以仅包含所述氮源中的1种，也可以包含2种以上。所述氮源可以在初始培养
33基中使用，也可以在流加培养基中使用。此外，初始培养基、流加培养基可以使用相同的氮源，也可以在流加培养基中使用与初始培养基不同的氮源。本发明的培养基中，除了碳源、氮源之外，优选还包含磷酸源、硫源。作为磷酸源， 可以利用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、焦磷酸等磷酸多聚物等。此外，作为硫源，只要包含硫原子即可，优选硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐等硫酸盐，半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽等含硫氨基酸，这其中优选硫酸铵。此外，培养基上述成分之外，还可以包含生长促进因子(具有生长促进效果的营养素)。能够使用的生长促进因子包括微量金属、氨基酸、维生素、核酸以及含有前述物质的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白降解物等。作为微量金属，可以列举铁、锰、 镁、钙等；作为维生素，可以列举维生素Bi、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酰胺、维生素B12 等。这些生长促进因子可以包含在初始培养基中，也可以包含在流加培养基中。此外，在使用其生长需求氨基酸等的营养缺陷型突变株时，优选在培养基中添补所需求的营养素。特别是，对于可在本发明中使用的L-赖氨酸生产菌而言，大多如后述地强化了 L-赖氨酸生物合成途径，而弱化了 L-赖氨酸分解能力，因此，优选添加选自L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸中的1种或2种以上。初始培养基和流加培养基的培养基组成可以相同，也可以不同。此外，初始培养基与流加培养基的硫浓度可以相同，也可以不同。而且，当流加培养基的流加分多个阶段进行时，各流加培养基的组成可以相同，也可以不同。而且，本发明中使用的培养基只要是包含碳源、氮源以及视需要而定的其它成分的培养基即可，可以是天然培养基，也可以是合成培养基。由藻类生产的有机物中除了包含碳源以外，还包含可用于氨基酸的成分。与常规的培养基相比，本发明中使用的培养基，视需要可以减少氮源以及其它成分。培养优选在需氧条件下实施1 7天，培养温度为20°C 45°C、优选 45°C、 特别优选33 42°C。培养优选为通气培养，优选进行调节使得氧浓度为饱和浓度的5 50%、理想的是10%左右。此外，培养中的pH优选为5 9。而且，为了调整pH，可以使用无机或者有机的酸性或者碱性物质，例如碳酸钙、氨气、氨水等。在如上所述的条件下，通过培养优选10小时 120小时左右，培养液中可以蓄积显著量的L-氨基酸。蓄积的L-氨基酸的浓度只要是能够从培养基或菌体收集、回收的浓度即可，优选为lg/L以上、更优选50g/L以上、更优选100g/L以上。此外，在生产L-赖氨酸等碱性氨基酸时，可以采用下述方法来进行生产，所述方法中采用下述方法进行发酵、并回收目的碱性氨基酸进行控制使得培养中的pH为6. 5 9. 0、而培养结束时的培养基的pH为7. 2 9. 0，并且控制发酵中发酵罐内压力为正，或者， 向培养基中供给二氧化碳或含有二氧化碳的混合气体，使得存在培养基中的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子为至少2g/U20mM)以上的培养期，并且以所述碳酸氢根离子和/或碳酸根离子作为以碱性氨基酸为主的阳离子的反荷离子(特开2002-65287、US2002-0025564A EP 1813677A)。此外，在L-谷氨酸发酵中，还可以使用已调整至能够使L-谷氨酸析出的条件的液体培养基，使进行培养的同时L-谷氨酸在培养基中析出。作为L-谷氨酸析出的条件，可以例举pH5. 0 4. 0、优选ρΗ4· 5 4. 0、更优选ρΗ4· 3 4. 0、特别优选ρΗ4· 0 (欧洲专利申请公开第1078989号说明书)。就从培养液回收L-氨基酸而言，可以组合常规的离子交换树脂法、沉淀法以及其它公知方法来实施。而且，当L-氨基酸在菌体内蓄积时，例如可以利用超声波等破碎菌体， 并通过离心分离除去菌体，采用离子交换树脂法等从所得上清中回收L-氨基酸。回收的 L-氨基酸可以是游离体的L-氨基酸，也可以是盐，包括硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、铵盐、钠盐.、Φ^Ρ盐ο此外，本发明中收集到的L-氨基酸除了包含目的L-氨基酸以外，还可以包含微生物菌体、培养基成分、水分以及微生物的代谢副产物。所收集的L-氨基酸的纯度为 50% 以上、优选 85% 以上、特别优选 95% 以上(US5, 431,933, JP1214636B, US4, 956, 471, US4, 777，051，US4946654, US5, 840358，US6,238，714，US2005/0025878)。实施例1以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明。本实施例中使用了从德克萨斯大学藻类培养物保藏中心(The University of Texas at Austin, TheCulture Collection of Algae (UTEX), IUniversity Station A6700, Austin, TX78712-0183, USA)获得的 Chlorella kessleri Ilh 株(UTEX 263)、Neochlorisoleoabundans UTEX 1185 株、 Nannochloris sp. UTEX LB 1999 株以及假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)UTEX LB FD2 株。〔实施例1 (1)〕微型藻类Chlorella kessleri的培养将Chlorella kessleri 在装有 IOOmL 的 0. 2 X Gamborg's B5 培养基(日本制药) 的500mL容量三角烧瓶中，以30°C、光强度10，OOOlux(Τ0ΜΥ公司制造的培养装置CL-301) 的条件振荡培养6天，以此为前培养液。而且，光源使用的是来自荧光灯的白色光。在装有 0. 2XGamborg' s B5培养基800mL的IL容量培养基瓶中添加前培养液16mL，在培养温度 30°C、光强度10，OOOlux，并以500mL/min通入空气与(X)2的混合气体使(X)2浓度达到3%的条件下，培养12天。(0.2XGamborg's B5培养基
KNO3500mg/L
MgSO4 · 7H2050mg/L
NaH2PO4 · H2O30mg/L
CaCl2 · 2H2030mg/L
(NH4)2SO426. 8mg/L
Na2-EDTA7. 46mg/L
FeSO4 · 7H205. 56mg/L
MnSO4 · H2O2mg/L
H3BO30. 6mg/L
ZnSO4 · 7H200. 4mg/L
KI0. 15mg/L
Na2MoO2 · 2H200. 05mg/L
CuSO4 · 5H200. 005mg/L
CoCl2 · 6H200.005mg/L
120 0C 15分钟高压蒸汽灭菌
〔实施例1⑵〕从Chlorellakessleri制备淀粉糖化液通过离心分离沉淀出IL实施例1 (1)的培养液中的藻体，向该沉淀物中加入SOmL 的乙醇并悬浮藻体，然后煮沸30分钟。对该悬浮液进行离心分离使藻体沉淀，然后用 80mL的乙醇洗涤2次，再于干燥器内进行干燥。向该干燥藻体中加入40mL的0. 2M Κ0Η, 煮沸30分钟，再使用超声波装置(Kubota公司INS0NAT0R 201MA)进行15，OOOffUO分钟的处理，从而将细胞破碎。向该破碎液中加入8mL的IM乙酸溶液、250U的淀粉葡糖苷酶 (Sigma-Aldrich公司，于55°C反应18小时反应。反应结束后，使用生物技术分析仪AS210(&ikUra kiki)对反应产物中的葡萄糖进行了定量。即使将酶浓度改变为原来的 2倍，生成的葡萄糖量也基本没有变化，由此可以推定淀粉中的大部分被转化为葡萄糖。通过离心分离除去藻体破碎物(残渣)，将上清作为氨基酸发酵的碳源使用。〔实施例1(3)〕以Chlorella kessleri来源的淀粉糖化液作为碳源的L-赖氨酸生产培养作为L-赖氨酸生产菌，使用了国际公开第2006/078039号小册子中记载的大肠杆菌 WC196 Δ cadAA ldcC/pCABD2o 将 WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2 在含有 20mg/L 链霉素硫酸盐的LB琼脂培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L)中 37°C培养20小时。刮取琼脂培养基上的细胞，接种到装有40mL含20mg/L链霉素硫酸盐的 L-赖氨酸生产培养基的500mL容量三角烧瓶中，培养温度37°C，进行了 M小时培养。在主培养中，使用从Chlorella kessleri生产的淀粉制备的实施例1 ( 的糖化液(葡萄糖量为2.75g/L)以及制备该糖化液时作为缓冲液利用的乙酸4. 8g/L作为碳源。作为对照，使用含相同浓度的葡萄糖或乙酸两者之一的培养基、以及含葡萄糖和乙酸这两者作为碳源的培养基实施了培养。(L-赖氨酸生产培养基组成)(A 区)碳源葡萄糖2. 75g/L乙酸 4. 8g/L(B 区)(NH4) 2S04 24g/LKH2PO4 lg/L酵母提取物2g/LFeSO4 · 7H20 10mg/LMnSO4 · 4H20 lOmg/L(C 区)碳酸钙15g/LA区、B区115°C高压蒸汽灭菌10分钟，C区180°C干热灭菌3小时。冷却至室温后，将三者混合，加入终浓度lg/L的MgSO4 · 7H20溶液。培养结束后，使用生物技术分析仪AS210 (Mkura kiki)确认了葡萄糖的消耗，通过活菌数计数测定了生长程度，使用BF_5(王子计测机器)测定了 L-赖氨酸量。每组使用两个烧瓶进行培养，结果的平均值示于表1。当分别以试剂葡萄糖和乙酸作为单独的碳源时，分别蓄积了 1. lg/L和0. 3g/L的 L-赖氨酸。当混合试剂葡萄糖和乙酸作为碳源时，蓄积了 1.4g/L的L-赖氨酸，这相当于各碳源单独使用时的L-赖氨酸蓄积量的合计。在使用与之相同浓度的、由藻类生产的淀粉来源的葡萄糖以及乙酸时，观察到了高于同等程度的1.8g/L的L-赖氨酸蓄积，表明它们是有效的碳源。[表 1]表 1
权利要求
1.一种生产L-氨基酸的方法，其特征在于，在包含微型藻类的处理物的培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的细菌，从而在培养物中生产并蓄积L-氨基酸，并从该培养物收集 L-氨基酸，其中，该处理物促进所述细菌生产并蓄积L-氨基酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述处理物是(1)所述微型藻类的培养物的破碎物；( 所述破碎物的提取物或分级物，其中包含来源于所述微型藻类的有机物的混合物； 或(3)该破碎物、该提取物或该分级物的水解物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述处理物是对产生淀粉的微型藻类的藻体破碎物、或所述藻体破碎物的含淀粉的提取物、或所述提取物的含淀粉的分级物进行水解而得到的糖化物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述糖化物是从微型藻类的藻体破碎物或所述藻体破碎物的含淀粉的分级物通过使用淀粉酶进行酶反应而得到的反应产物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述淀粉酶是葡糖淀粉酶。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述处理物是对产生油脂的微型藻类的藻体破碎物、或者所述藻体破碎物的含油脂的提取物、或者所述提取物的含油脂的分级物进行水解而得到的水解物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述水解物是从微型藻类的藻体破碎物或所述藻体破碎物的含油脂的分级物通过使用脂肪酶进行酶反应而得到的反应产物。
8.根据权利要求6 7中任一项所述的方法，其特征在于，所述水解物经过了乳化处理。
9.权利要求1 8中任一项所述的方法，其特征在于，所述微型藻类的破碎方法为高温处理。
10.根据权利要求1 9中任一项所述的方法，其特征在于，所述微型藻类的破碎方法是在100°C以上的温度下进行处理。
11.权利要求1 10中任一项所述的方法，其中，所述微型藻类是属于绿藻门 (Chlorophyta)或不等长鞭毛门(Heterokontophyta)的藻类。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述微型藻类是属于绿藻纲 (Chlorophyceae) Λ Trebouxiophyceae ^ ^! (Baci 1 Iariophyceae)的
13.根据权利要求1 12中任一项所述的方法，其中，所述微型藻类是属于绿藻纲的藻类。
14.根据权利要求1 13中任一项所述的方法，其中，所述细菌是属于肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)的细菌或棒状杆菌型细菌。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述属于肠杆菌科的细菌是大肠杆菌 (Escherichia coli)0
16.根据权利要求1 15中任一项所述的方法，其中，所述L-氨基酸为选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酸中的1种或2种以上的L-氨基酸。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述L-氨基酸为L-赖氨酸，且所述细菌中选自二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氨基庚二酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、二氨基庚二酸差向异构酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、以及琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶中的1种或2种以上的酶的活性被增强，和/或赖氨酸脱羧酶的活性被弱化。
18.根据权利要求15所述的方法，其中，所述L-氨基酸为L-苏氨酸，且所述细菌中选自天冬氨酸半醛脱氢酶、thr操纵子编码的天冬氨酸激酶I、高丝氨酸激酶、天冬氨酸氨基转移酶、以及苏氨酸合酶中的1种或2种以上的酶的活性被增强。
19.根据权利要求15所述的方法，其中，所述L-氨基酸为L-谷氨酸，且所述细菌中的选自谷氨酸脱氢酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、以及甲基柠檬酸合酶中的1种或 2种以上的酶的活性被增强，和/或α -酮戊二酸脱氢酶的活性被弱化。
20.根据权利要求1 19中任一项所述的方法，其中，所述培养基包含所述处理物作为碳源。
21.—种生产L-氨基酸的方法，其特征在于，(a)在培养基中培养微型藻类，并通过选自破碎、提取、分级和水解中的1种以上的方法对该培养物进行处理，来制备促进具有L-氨基酸生产能力的细菌生产并蓄积L-氨基酸的该微型藻类的处理物；(b)在包含所述微型藻类的处理物的培养基中培养所述细菌，从而在培养物中生产并蓄积L-氨基酸；以及(c)从该培养物收集L-氨基酸。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述处理物是(1)所述微型藻类的培养物的破碎物；( 所述破碎物的提取物或分级物，其中包含来源于该微型藻类的有机物的混合物； 或者C3)该破碎物、该提取物或该分级物的水解物。
23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述破碎是通过选自高温处理、有机溶剂处理、煮沸处理和强碱处理中的1种以上的方法进行的。
24.根据权利要求21 23中任一项所述的方法，其中，所述处理物制备步骤包括通过对产生淀粉的微型藻类进行破碎和/或提取和/或分级，并对所得处理物进行水解以将其糖化的步骤。
25.根据权利要求M所述的方法，其特征在于，在所述糖化步骤中使用淀粉酶进行酶反应。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述淀粉酶为葡糖淀粉酶。
27.根据权利要求21 23中任一项所述的方法，其中，所述处理物制备步骤包括对产生油脂的微型藻类进行破碎和/或提取和/或分级，并对所得的油处理物进行水解的步骤。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，在所述水解步骤中使用脂肪酶进行酶反应。
29.根据权利要求27或观中任一项所述的方法，其中，所述水解物经过了乳化处理。
30.根据权利要求21 四中任一项所述的方法，其中，所述微型藻类是属于绿藻门或不等长鞭毛门的藻类。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述微型藻类是属于绿藻纲、 Trebouxiophyceae或娃藻纲的藻类。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述微型藻类是属于绿藻纲的藻类。
33.根据权利要求21 32中任一项所述的方法，其中，所述细菌是属于肠杆菌科的细菌或棒状杆菌型细菌。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述属于肠杆菌科的细菌是大肠杆菌。
全文摘要
通过在包含微型藻类的可促进该细菌生产并蓄积L-氨基酸的处理物(例如微型藻类的培养物的破碎物、含有该微型藻类产生的有机物的混合物的该破碎物的抽提物或分级物、或者该破碎物、该抽提物或该分级物的水解物等)的培养基中，特别是在包含淀粉的糖化物或者油脂的水解物的培养基中，培养具有L-氨基酸生产能力的细菌，在培养物中生产并蓄积L-氨基酸，并从该培养物收集L-氨基酸，来生产L-氨基酸。
文档编号C12P13/14GK102348806SQ20098010289
公开日2012年2月8日 申请日期2009年1月23日 优先权日2008年1月23日
发明者羽城周平, 臼田佳弘, 铃木茂雄 申请人:味之素株式会社