专利名称：：溴酚内分泌干扰物作用的快速检测方法
技术领域：
：本发明涉及环境化合物的内分泌干扰检测
技术领域：
，更具体涉及一种溴酚的内分泌干扰作用的快速检测方法，该方法能够检测低剂量的溴酚通过非受体途径发挥的内分泌干扰效应，即影响与类固醇激素合成途径的重要基因表达的影响，以便确定该化合物的毒理学效应，该方法也可以作为环保部门和科研单位进行持久性有机污染物及化学品的内分泌干扰作用评价。
背景技术：
：溴酚类化合物广泛应用于纺织品、聚氨酯类、塑料、环氧化脂和纸类的生产中。溴酚类化合物也可作为添加剂生产其他溴代阻燃剂。同时，塑料降解和多溴联苯醚(PBDEs)的降解也可生成溴酚类化合物。如溴代阻燃剂中用量最大的四溴双酚A(TBBPA)可经光降解可生成溴酚。2，4，6-三溴苯酚(2，4，6-tribromophenol，TBP)是一种产量最大且广泛运用的溴酚类化合物。据统计，2001年日本的产量为2500吨，全世界的产量为9500吨。溴酚类化合物在环境中广泛存在，且主要以2，4-二溴苯酚(2，4-DBP)，2，6_二溴苯酚和TBP为主。在很多地区的表层水体中均检测到TBP。此外，饮用水、污水处理厂的废水中、污泥以及土壤样品中都检测到TBP。环境中的溴酚类化合物具有生物积累效应。在鱼类、软体动物、甲壳类和多毛类动物，海洋哺乳动物都存在较高含量的溴酚。此外，人的尿液、血清和乳汁中也检测到溴酚。内分泌干扰物(Endocrinedisruptors)是指环境中存在的能够干扰生物体内源激素的合成、释放、转运、结合、作用或清除，从而影响机体的内环境稳定、生殖、发育及行为的外源性物质。环境中的许多化学物质具有内分泌干扰作用，这些化合物性质差异极大，既有难降解的持久性有机污染物(P0Ps)(如二恶英、多氯联苯、有机氯农药等)，又有易分解的极性除草剂、杀虫剂、洗涤剂降解产物、动物及人类排泄的激素、天然植物激素及微生物毒素以及某些重金属等。内分泌干扰物的分子作用模式主要是外源化学物质与生物体内源激素结构的相似，这些激素通过结合细胞外受体，转运到细胞核内同启动子位置结合，从而启动目的基因的表达。因而可模拟、阻止或干扰，雄激素、雌激素、甲状腺激素等内分泌的过程，称之为受体-介导途径。尽管如此，环境中的大量化学物质，其化学结构与生物体内的内源激素结构并不相同，但是也可表现出内分泌干扰物作用。这可能是污染物直接影响了生物体内的与激素合成有关酶的活力，以及通过破坏内源性激素及其受体的生成、代谢、转运、细胞信号转导，这些作用称之为非受体介导途径。长期以来，对于环境内分泌干扰物的研究由于研究技术手段的限制，大多有关内分泌干扰物作用的研究多集中在污染物与不同激素核受体相互作用方面，如雌激素、雄激素、甲状腺激素受体的相互作用。这些激素通过结合细胞外受体，转运到细胞核内同启动子位置结合到DNA上的雌激素反应元件，诱导基因表达，从而发挥生物学效应。然而，由于内分泌干扰物的物理、化学结构的差异，其作用的方式也不同，内分泌干扰物可发生在激素的代谢水平上、合成的调节和释放、储存、转运、清除等。也可通过改变细胞内的信号传导，如激酶、&2+介导的通路，会影响转录因子磷酸化状态，从而改变相关基因的表达。特别需要指出的是，污染物可能通过影响类固醇激素的合成途径而发挥内分泌干扰物作用，即非受体途径。目前，溴酚的毒性以及其对人体和环境的危害目前还不是很清楚。对溴酚类毒性的检测主要是通过生物筛选来进行。实验表明溴酚对小鼠具有发育毒性、胚胎毒性等。溴酚可能是干扰甲状腺激素的分泌。同时，可能干扰神经内分泌细胞内的钙离子信号。此外，溴酚还能干扰神经瘤细胞的分化。鱼类实验发现溴酚能影响斑马鱼胚胎的发育。近来，尽管水体中的含量一般较低，但溴酚类化合物因其较低的味觉阀值和对水生生物的毒害作用，引起了广泛地关注。溴酚类化合物具有亲脂性，因而极易通过食物链积累。近年来，环境中广泛存在的这些污染物已引起了科技界及公众的极大关注。从目前的研究分析，尚未有溴酚内分泌干扰作用的快速离体评价方法。
发明内容本发明的目的是在于提供了一种溴酚内分泌干扰作用的快速检测方法。人肾上腺皮质瘤细胞株(H295R)保留了大多数与类固醇激素合成相关的基因。通过采用荧光定量PCR技术，可准确、快速得到相关基因表达的变化，来检测化合物的内分泌干扰作用。为了达到上述目的，本发明采用以下方法采用离体细胞的培养方法，即将细胞培养于96孔培养板中，细胞密度达到80%时，进行低剂量(0.1yM)的溴酚暴露，并对细胞的活性进行测定，收集细胞提取RNA，设计基因表达的引物，进行荧光定量PCR，以及找到受到溴酚作用响应的敏感基因，从而评价溴酚的内分泌干扰作用。—种溴酚内分泌干扰物作用的快速检测方法，它包括下列步骤A、细胞暴露，如果时间长，将影响细胞的活力。采用胰岛素铁硒传递蛋白(insulin-transferringsodiumseleniteplusPremix，BDBioscience,SanJose，CA，USA)作为生长促进剂以及使用不含激素的碳过滤血清2.5%体积比，Nu-Serum，BDBioscience,暴露时间46-50小时。B、选择暴露剂量分别为0.l，l和10iiM，此剂量下细胞有100%存活率，从而确定溴酚的作用并非来自毒性效应，而是内分泌干扰作用。所述的暴露剂为2，4，6-溴酚(2，4，6-TBP)、四溴双酚A(TBBPA)和2，6-二溴酚(2，6-DBP)其中的任意一种。C、RNA的提取和将RNA逆转录为与RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA(cDNA)。D、用荧光定量PCR技术检测类固醇合成过程中关键酶的基因表达变化。由于目前尚未有评价溴酚内分泌干扰作用的技术，本方法采用基因表达灵敏、可靠、快速，能够快速判断溴酚是否具有影响与类固醇激素合成的相关基因，从而判定该类化合物的内分泌干扰物潜力。由于培养细胞只需要很少的样品暴露，因此可以对环境中的样品进行暴露。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果H295R细胞株含有与类固醇激素合成的基因，而大多数基因可在溴酚的作用下诱导表达，因此改变这些基因的表达直接可用来推测对类固醇类激素合成，因此可用来评价内分泌干扰效应。研究结果表明，在低剂量(0.liiM)暴露下，H295R细胞中与类固醇激素代谢相关的重要基因受到影B向，因此该方法灵敏度高，能够检测低于O.li!M的剂量。样品处理程序简单，不需要特殊昂贵的仪器；由于可在96孔板中培养，成本低，可以同时检测多个样品。图1为一种人肾上腺皮质瘤细胞株类固醇激素合成的途径示意图。能表达类固醇激素合成过程中涉及的所有酶类，生成肾上腺皮质合成的所有类固醇激素。其中在球状带主要以胆固醇为原料合成醛固酮为主的激素。在束状带可将孕烯醇酮和孕酮转化为皮质醇。在网状带主要合成性激素，包括脱氢表雄酮、雄烯二酮、睾酮及雌二醇等。类固醇激素合成是一个复杂有序的过程，从胆固醇到合成各种类固醇激素终产物须经过多个步骤的生物转化，任何基因的表达异常，将导致类固醇激素合成障碍。图2.0.1、1、10iiMTBP暴露组与对照组比较，3I3-HSD2基因表达量倍数变化分别下降4.5倍，2.2倍，3.0倍。图3.0.1、1、10iiMTBP暴露组与对照组比较，CYP19基因表达量变化分别下降为9.5倍，2.8倍，5.5倍。图4.0.1、1、10iiMTBBPA暴露组与对照组比较，基因表达在1、10iiM暴露组下降2.9倍，2.6倍。图5.0.1、1、10iiMTBBPA暴露组与对照组比较，基因表达量下降为1.8倍，3.5倍，5.0倍。图6.2，6-DBP，0.1、1、10iiM暴露组与对照组比较，3P-HSD2基因表达量变化倍数下降分别为3.7倍，5.5倍，3.2倍。图7.0.1、1、10iiM2，6-DBP暴露组与对照组比较，CYP17基因表达量变化倍数分别下降为23.8倍，22.2倍，12.8倍。图8.0.1、1、10iiM2，6-DBP暴露组与对照组比较，CYP19基因表达量变化倍数分别下降为3.6倍，6.8倍，7.5倍。具体实施例方式—种评价溴酚内分泌干扰作用的方法，它包括下列步骤1、H295R细胞培养(A)、培养条件使用DMEM/F12培养基，力n1%(体积比)insulin-transferringsodiumseleniteplusPremix，2.5%(体禾只比)Nu-Serum，100U/ml青霉素，100iig/ml链霉素。在37°。，5%(体积比)C02的细胞培养箱中培养。(B)、细胞复苏(1)、从液氮罐中取出冻存的细胞迅速放入盛有36t:37t:水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻。(2)、取出冻存管，用70%(体积比)酒精擦拭消毒后，净化台上打开盖，用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补加10ml培养液，吹打使细胞悬浮。(3)、低速离心(5001000转/分)5分钟，取上清后再重复用培养液漂洗、离心。(4).加入培养液适当稀释后，再移装入培养瓶中，置温箱培养，次日更换一次培养液后再继续培养。(C)、细胞传代(1)、将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去；(2)、加入0.25%(体积比)胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为O.5ml或更多，使细胞充分浸润；(3)、一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量(0.05%)的细胞培养液终止消化；(4)、视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例。2、细胞暴露(H295R)及检测细胞活性将2，6-溴酚(2，6-DBP)，2，4，6_溴酚(2，4，6-TBP)，四溴双酚A(TBBPA)溶解于二甲基亚砜(DMS0)中，分别进行低剂量暴露分别为0.1，1，10iiM，暴露时间为47或48或49小时。细胞活性采用噻唑兰(MTT)方法测定。即将H295R细胞培养于96孔培养板中(Falcon，Newjersey，USA)，密度为5X105细胞/ml，24小时后，将培养液更换，于每孔中加入200ii1暴露液(2，6-溴酚，2，4，6-溴酚，四溴双酚A)，对照组加入0.1%(体积比)DMS0。暴露44小时后，加入25y1MTT母液(5g/L)，并且再培养4小时。移去培养基，在每孔中加入200iU0.1M的磷酸缓冲液(pH7.4)洗涤2次，然后加入100ii1DMS0。20分钟后，将每孔中的液体提出100iil，使用多功能酶标仪(MolecularDevice,M2)在570nm下测定吸光值。3、RNA的抽提与保存(D、物品Trizol(Invitrogen)、三氯甲烷、异丙醇、DEPC(焦碳酸二乙酯)水(lOOml超纯水加入lOOiilDEPC，混匀放置12-24小时，然后12(TC灭菌20分钟)、75X(体积比)乙醇(用DEPC水稀释100%的乙醇)、冷磷酸缓冲液、1.5ml离心管、灭酶吸头、一次性手套。(2)、操作步骤A、取出细胞。用冷磷酸缓冲液(4°C)冲洗细胞两次，并将磷酸缓冲液倒掉。向细胞培养瓶中加入2mlTrizol，使Trizol覆盖住整个细胞表面，在室温(20_25°C)放置15分钟，用移液器吹打至液体澄清。B、将裂解液移至2个1.5ml离心管中，每管lml。向每个离心管中加入氯仿0.2ml(1/5Trizol体积)，用涡旋混匀器剧烈震摇15秒，置于冰上5分钟，然后4°C、12000Xg离心15分钟，可见分层。用移液器小心收集上层水相约0.4ml置于另一1.5ml离心管中(确保不要吸入中间层和有机相)。各管分别加入0.4ml异丙醇(等体积)，上下颠倒10次，置-20°C120分钟。然后4°C、12000Xg离心10分钟，可见RNA沉淀。倒弃上清，加入预冷的75%(体积比)乙醇lml洗涤一次。C、4°C、12000Xg离心5分钟，沉淀即为总RNA。弃上清，空气中干燥至乙醇完全挥发，加入50ii1DEPC水溶解RNA沉淀。D、用分光光度计测定提取的RNA在260nm和280nm处的吸光值。0D26Qnm可以检测总RNA的浓度，RNA浓度(yg/iiL)=0D26QnmX40X稀释倍数/1000。而提取的RNA样品的质量可用0026。/0028。比值进行判断，如果0026。/0028。的比值在1.8_2.0之间，说明RNA的质量良好，否则要重新提取RNA;另外取1iigRNA进行琼脂糖变性电泳检测rRNA的完整性，通过目测28S和18S的亮度比例可以初步评价总RNA的质量。一般认为28S:18S>2可以初步判定总RNA质量较好。剩下的RNA在-S(TC保存直至逆转录。4、逆转录(1)、准备物品DNA酶I试剂盒、RNA酶抑制剂(40U/y1)、寡聚脱氧胸苷(500yg/ml)、莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)反转录酶试剂盒、脱氧核糖核苷酸(dNTP)(10mM)(以上试剂为Promega)。200yl灭酶PCR管、灭酶吸头、一次性手套。(2)、操作步骤A、向200iil灭酶PCR管中依次加入1iU的DNA酶I缓冲液(500mM氯化钾，200mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH8.3)，0.5iU核糖核酸酶抑制剂(RNasin)，2iig(约4iU，通过RNA浓度测量的数据计算而得)RNA样品，1illDNA酶，用DEPC水补足到10，PCR仪上37。C反应30分钟，85t:反应10分钟。B、向上述PCR管中加入0.5iig(liil)寡聚脱氧胸苷，PCR仪上75。C反应5分钟，然后立即放到冰上。C、依次加入RNA酶抑制剂0.5iU，莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)反转录酶5X反应缓冲液5iil，dNTP1iil，M-MLV反转录酶1yl，最后用DEPC水补足到25，PCR仪上42t:反应1小时，得到逆转录后的cDNA，-2(rC保存直至荧光定量PCR。5、荧光定量PCR:(1)、准备物品荧光定量PCR管，吸头，灭菌离心管，引物(Invitrogen合成)，荧光定量PCRi式剂盒(SYBRGreenPCRmastermix)。(2)、操作步骤A、PCR反应混合物的配制反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>设计的引物如下P-肌动蛋白-actin):上游引物5'-CACCTTCCAGCCTTCCTTCC-3'，下游引物5'-AGGTCTTTGCGGATGTCCAC-3';17a羟化酶/17，20裂解酶(CYP17):上游引物5'-AGCCGCACACCAACTATCAG-3'，下游引物5'-TCACCGATGCTGGAGTCAAC-3';芳香化酶(CYP19):上游引物5'-AGGTGCTATTGGTRCATCTTGCTC-3'，下游引物5'-TGGTGGAATCGGGTCTTTATGG-3';313-羟基类固醇脱氢酶(313-HSD):上游引物5'-TGCCAGTCTTCATCTACACCAG-3'，下游引物5'-TTCCCAGAGGCTCTTCTTCGTG-3';17P_类固醇脱氢酶(17P-HSD):上游引物5'-TGCGGGATCACGGATGACTC-3'，下游引物5'-GCCACCATTCTCCTCACAACTC-3'。胆固醇侧链裂解酶(CYP11A):上游引物5'-GAGATGGCACGCAACCTGAAG-3'，下游引物5'-CTTAGTGTCTCCTTGATGCTGGC-3'。醛固酮合酶(CYP11B2):上游引物5'-TCCAGGTGTGTTCAGRAGTTCC-3'，下游引物5'-GAAGCCATCTCTGAGGTCTGTG-3'B、每个浓度3个平行样，每个样品重复3次。对应的内参基因(e-actin)也一样。C、将荧光定量PCR管放到荧光定量PCR仪上，进行程序设定程序为95t:预变性2分钟；95。C变性15秒，6(TC退火15秒，72。C延伸45秒，循环40次；在72。C退火45秒阶段收集荧光值。(3)、溶解曲线的绘制在上述扩增完成后进行6(TC至95t:的融解曲线分析，在温度升高的过程中连续监测样品的荧光值，使用实时定量PCR系统分析软件检测观察结果，分析扩增曲线和熔解曲线。首先测定各基因引物的扩增效率，确定目的基因与内参基因13-actin的扩增效率基本一致(差别不超过5%)。通过对溶解曲线的分析，就可以得知反应中扩增到的产物的情况，判断扩增产物是否为目的片段，是否出现非特异性扩增和引物二聚体，如果有则需要重新设计引物。每份样品重复测定三次，对应的e-actin也一样。6、数据的处理用2—AAGt方法计算相对基因表达量。公式为AACt=(Cts的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct,，g-Ct^^g)对照组。2—A"t表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。采用单因素方差分析的方法(AN0VA)将数据进行统计分析，通过SPSS13.0软件进行处理，P<0.05作为确定显著性差异的标准。权利要求一种溴酚内分泌干扰物作用的快速检测方法，其步骤是A、细胞培养，采用胰岛素铁硒传递蛋白为生长促进剂及使用不含激素的碳过滤血清2.5％体积比，Nu-Serum，BDBioscience，暴露时间46-50小时；B、选择暴露剂量分别为0.1，1和10μM，此剂量下细胞有100％存活率，确定溴酚的作用并非来自毒性效应，所述的暴露剂为2，4，6-溴酚、四溴双酚A、2，6-二溴酚其中的任意一种；C、RNA的提取和将RNA逆转录为与RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA；D、用荧光定量PCR技术检测类固醇合成过程中酶的基因表达变化。全文摘要本发明公开了一种溴酚内分泌干扰物作用的快速检测方法，其步骤是A、细胞培养，采用胰岛素铁硒传递蛋白为生长促进剂及使用不含激素的碳过滤血清Nu-Serum，暴露时间46-50小时；B、选择暴露剂量0.1，1，10μM保证细胞100％存活率，确定溴酚的内分泌干扰作用；C、提取RNA和将RNA逆转录为cDNA；D、用荧光定量PCR技术检测类固醇合成过程中酶的基因表达变化。所以该技术能够实现对环境样品进行评价。在低剂量暴露下，H295R细胞中与类固醇激素代谢相关的重要基因受到影响，该方法灵敏度高，能够检测低于0.1μM的剂量。样品处理程序简单，不需要特殊昂贵的仪器；在96孔板中培养，成本低，可以同时检测多个样品。适合环保部和科研单位进行环境溴代阻燃剂内分泌干扰效应的检测。文档编号C12Q1/68GK101701261SQ20091027275公开日2010年5月5日申请日期2009年11月13日优先权日2009年11月13日发明者周炳升,方琪,邓军申请人:中国科学院水生生物研究所