专利名称：启动子核酸、表达盒和载体、宿主细胞和使用该细胞表达基因的方法
技术领域：
本发明涉及来自棒杆菌属细菌的新的启动子核酸、包含该启动子的表达盒、包 含该表达盒的载体、包含该载体的宿主细胞和使用该宿主细胞表达基因的方法。
背景技术：
棒杆菌类细菌是用于产生用于许多应用的多种化学物质的微生物，所述化学物 质为如动物饲料、药品，和食品，包括L-赖氨酸、L-苏氨酸，和多种核酸。通过遗传 工程和代谢工程可以开发显示出高生产力的棒杆菌菌株。为了得到显示出高生产力的棒 杆菌菌株，需要在棒杆菌中表达涉及多种代谢途径的基因。为此，必须开发合适的启动 子。通常，在棒杆菌中，基因在内在地包括在该基因中的启动子的控制下表达(见 例如，Journal of Bacteriology，181(19)，6188-6191，1999)。同时，在棒杆菌细菌中表 达基因的启动子序列的结构是未知的，而其他工业微生物，如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽 孢杆菌(Bacillus subtilis)的结构是已知的。因此，已经提出了下面的方法用来产生能够 使基因在棒杆菌细菌中表达的启动子。首先，除去耐受抗生素，如氯霉素的基因的启动 子区。使用合适的限制酶单独地切割从棒杆菌细菌分离的染色体DNA，并将所得片段 导入除去该启动子区的基因中。然后，所得基因用于转化棒杆菌细菌以产生转化的菌株 并测量所转化的菌株的抗生素抗性(见Gene，102，93-98，1991 ； Microbiology, 142， 1297-1309，1996.)。具体地，已经开发了用于 Corynebacterium ammoniagenesis 中的非 常少数目的启动子，Corynebacterium ammoniagenesis是一种已知的生产核酸的微生物。 例如，在大肠杆菌中使用比tac启动子活性高约10%的启动子(见BiotechnoLLett. 25， 1311-1316，2003.)。然而，当它用于基因的大量表达时，这种启动子显示出低效率。美 国专利号5,593,781公开了一种启动子DNA，其从黄色短杆菌CBrevibacterium flavum)菌 株MJ-233 (FERM BP-1497)分离并且具有比tac启动子更高的活性。然而，这种从短杆 菌属分离的启动子DNA在其他细菌中不能工作。因此，需要开发来自通过商业途径可获 得的产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)并且在其他细菌中具有高活性的启动子 序列。因此，本发明的发明人在产氨棒杆菌中寻找强启动子序列并且发现根据本发明 的启动子可以在产氨棒杆菌中以高活性表达基因。附图描述
图1显示了从产氨棒杆菌细菌提取的样品的二维电泳测定的结果，其中将测定 结果进行银染并显影用于鉴定；图2图解了根据本发明的实施方案产生pll7-gi^的筛选载体的方法；图3图解了根据本发明的实施方案从筛选载体pll7-gi^产生包括启动子序列pcjl 到pcj7的重组载体的方法。发明详述 技术问题本发明提供了在棒杆菌中具有高活性的启动子。本发明还提供了包括所述启动子的表达盒和包括该表达盒的载体。本发明还提供了包括所述载体的宿主细胞。本发明还提供了使用所述宿主细胞表达基因的方法。技术解决方案本发明提供了包含至少一种选自由SEQ ID NO 1到7组成的组的多核苷酸的启动子。根据本发明的实施方案的启动子是分离的核酸并且具有启动子活性。这里，术 语“启动子”指DNA区，RNA聚合酶结合该DNA区以起始基因的转录。术语“tac启 动子”指通过将从大肠杆菌的色氨酸操纵子启动子的-35区得到的序列与从大肠杆菌的乳 糖操纵子启动子的-10区得到的序列融合得到的启动子。已知tac启动子具有高启动子 活性。具有选自SEQ IDNO : 1、4、5、6和7的至少一种核酸的启动子在棒杆菌属细菌 中具有比tac启动子更高的活性。具体地，具有选自SEQ ID NO: 1和4的至少一种核酸 的启动子在棒杆菌属细菌中具有比tac启动子高4到10倍的活性。根据本发明的实施方案的启动子除了在棒杆菌属细菌中，还在埃希氏菌 (Escherichia)属细菌中具有启动子活性。具体地，含有SEQ ID NO 1的启动子甚至在 埃希氏菌属细菌中也显示出比tac启动子高两倍的启动子活性。本发明的启动子可以在其中起作用的细胞可以是任何棒杆菌属细菌。棒杆菌 属细菌的实例包括产氨棒杆菌CJHB100(KCCM-10330)和ATCC6871、谷氨酸棒杆菌 (Corynebacteriumglutamicum) ATCC13032 和 ATCC13060，等等。然而，谷氨酸棒杆菌属
细菌不限于此。本发明的启动子可以在其中起作用的埃希氏菌属细菌的实例包括大肠杆 菌。根据本发明实施方案的启动子的序列可以由本领域普通技术人员通过已知的诱 变方法如定向进化和位点定向诱变而容易地改变。因此，本发明的范围内包括与分离的 启动子序列具有例如70%或者更高同源性，优选80%或者更高同源性，更优选90%或者 更高同源性并且可以在棒杆菌属细菌中作为启动子的核酸，所述分离的启动子序列包括 至少一种选自SEQ IDNO. 1到7的核酸。本发明还提供了表达盒，其包括可操纵连接编码序列的启动子。编码序列可 以是例如完整基因或者编码基因的预定区域的编码序列。这里，术语“可操纵连接 (operably linked)"指出编码序列功能地连接启动子，使得启动子序列可以起始或者介导 编码序列的转录。根据本发明的实施方案的表达盒可以还包括可操纵连接启动子序列的 5’和3’控制序列。编码序列可以是结合代谢产物，如IMP、GMP, L-赖氨酸和L-苏氨酸的基因。本发明还提供了包括根据本发明的实施方案的表达盒的载体。这里，载体是不 受限制的，并且可以是本领域中已知的任何载体。根据本发明的实施方案的载体的实 例包括 pCR2.1-TOPO 载体(Invitrogen Inc, USA 生产)禾Π pECCG117 (KFCC-10673)。 然而，载体不限于此。包括根据本发明的实施方案的表达盒的载体的实例包括 pll7-cjl-gip> pll7-cj2-gip> pll7_cj3_gfp、pll7-cj4-gip> pll7-cj5-gip> pll7-cj6-gip 禾口 pll7_cj7-gfp0本发明还提供了包括按照本发明的实施方案的载体的宿主细胞。宿主细胞可以 是棒杆菌属细菌或者埃希氏菌属细菌，但不限于此。例如，宿主细胞可以是产氨棒杆菌 CJHB100(KCCM-10330)或者大肠杆菌。本发明还提供了通过培养宿主细胞表达异源基因的方法。根据所选的宿主细 胞，可以在多种已知的培养基和多种已知的培养条件之一下培养宿主细胞。有益效果 可操纵连接根据本发明的启动子的基因在大肠杆菌和产氨棒杆菌中有效表达。 启动子适于用棒杆菌属细菌开发菌株。包括根据本发明的启动子的表达盒和包括根据本发明的表达盒的载体适于在大 肠杆菌和产氨棒杆菌中有效表达外源基因。根据本发明的宿主细胞可以有效表达外源基因。通过使用根据本发明的表达基因的方法，可以有效表达外源基因。最佳方式将参考下面的实施例进一步详细描述本发明。这些实施例仅用于阐明目的，并 且不意在限制本发明的范围。
实施例从不同培养阶段的产氨棒杆菌CJHB100(KCCM_10330)制备细菌提取物。对细 菌提取物进行二维电泳以发现其中过表达的蛋白质，然后将其切割以分析肽序列。所得 的肽序列用于鉴定过表达蛋白质的基因。然而，分离启动子区，并使用启动子区产生载 体。接着，测量启动子在产氨棒杆菌CJHB100(KCCM_10330)和大肠杆菌中的活性。实施例1 :培养产氨棒杆菌CJHB100(KCCM-10330)并根据培养阶段选择过表 达蛋白质(1)细菌的培养在具有糖蜜的粗糖(含有50%葡萄糖和50%果糖的混合物)的培养基中培养产 氨棒杆菌CJHB100(KCCM-10330)。此时，测量细胞浓度。在早稳定期和稳定期收获 培养的产氨棒杆菌CJHB100(KCCM_10330)的样品。将样品离心并除去所得的上清液。 得到的细胞沉淀在崩解缓冲液中裂解以产生约100 μ m细菌提取物。(2) 二维电泳测定从第⑴部分得到的细菌提取物用6M尿素、2M硫脲、4% CHAPS和0.4% DTT 稀释以得到总体积350 μ 1的混合物。然后，向其中加入7μ1的IPT缓冲液和3μ1的 溴酚蓝(BPB)。使用immobiline pH梯度drystrip将所得溶液装载到再水化盘。再水化盘上的样品用2ml覆盖液覆盖以防止样品的蒸发和尿素的结晶，然后在室温下再水化约24 小时。使用等电聚焦装置(MultiphorII Amersham Bioscience, USA.生产)将再 水化的条带凝胶(strip gel)进行等电聚焦在20°C 0-100V进行1小时，300V进行1 小时，600V进行1小时，和在8000V下进行预定的时间，该时间经调节以进行聚焦 43-97kVhr(pH 4-7 43.4kVhr，pH 4.5-5.5，pH5.5-6.7 97kVhr)。当等电聚焦完成时，各自的条带凝胶在含有20mMTris-HCl、6M尿素、2% SDS、20%甘油、2.5%丙烯酰胺和5mMTBP的pH8.8溶液中平衡15分钟。将各自平衡的 条带装载到二维凝胶(9-16%浓度梯度)中然后用含有0.5%具有低沸点的琼脂和0.001% BPB的SDS溶液密封。在100V下电泳约19小时。电泳完成后，将凝胶在45%甲醇溶液和5%乙酸溶液中固定。用蒸馏水洗涤乙 酸1小时。将凝胶用0.02%硫代硫酸钠敏化2分钟并用蒸馏水洗涤。然后，将凝胶与 0.1%硝酸银反应20分钟并用蒸馏水洗涤。反应产物用含有2% (w/v)碳酸钠和0.04% (v/v)甲醛的溶液显影。当斑点具有出现的希望的强度时，用乙酸中止反应。凝胶 用蒸馏水洗涤并在4°C下保存在密封的塑料袋中。当使用考马斯染色时，当电泳完成后，用30%甲醇溶液和10%乙酸溶液固定凝 胶1小时，用蒸馏水洗涤，用胶体考马斯亮蓝G-250染色24小时，然后用10%甲醇溶液 和7%乙酸溶液漂白4小时。(3)基于斑点，制备用于质谱的肽样品使用已知方法(Shevchenkoetal.Anal.Chem.，68(5)，850-8，1996.)的改进版从
斑点分离肽。首先，从第(2)部分制备的凝胶切除蛋白质斑点，用30mM铁氰化钾和lOOmM 硫代硫酸钠的1 1比例的120iU混合溶液漂白，并用蒸馏水洗涤，然后用120iU50% 乙腈/25mM碳酸氢铵(pH7.8)洗涤10分钟。所得产物与50 y 1 100%乙腈反应直到白色 出现约5分钟，然后真空干燥。向干燥的斑点加入10ii 1 二维电泳级的胰蛋白酶(0.02 ii g/ii 1)然后在冰水反应 45分钟。然后，向反应产物加入50mM碳酸氢铵缓冲液(pH7.8)并在37。C反应12-14小 时。所得产物在10 y 10.5% TFA和50%乙腈中用超声波处理3次10分钟以提取肽。(4)质谱法通过HPLC-MS/MS分析如上述提取肽。用1100系列HPLC系统(Agilient Inc， USA生产)和Finnigan LCQ DECA离子阱质谱装置(ThermoQuest，USA生产)进行 HPLC-MS/MS,在该装置上安装纳喷雾离子化源。用C18显微探针反相柱进行HPLC， 并以线性梯度(流速=lyl/分钟)提供0.1%甲酸(溶剂A)和90% (v/v)乙腈和0.1% 甲酸的溶液(溶剂B)以分离肽。使用纳喷雾电离(NSI)(喷雾电压1.8kV ；毛细管温度200°C;毛细管电压 34V；管透镜偏移40V;和电子倍增器-60V)进行肽检测3次。以图心模式(centroid mode)得到测量。得到400-2000Da的完整MS扫描后，将阈值设置为1 X 105计数并通 过高分辨率局部放大扫描分离最强的离子。然后，进行碰撞诱导解离(CID)MS/MS。使 用TurboQuest软件(Thermo Finnigan Inc, USA生产)鉴定不编码的CID光谱的序列。SEQUEST搜索的结果通过互相关和ΔΟι(Δ归一化相关)鉴定。使用Q-star Pulsar LC MS/MS (Applied Biosystems Inc, USA 生产)证实和鉴定
肽的氨基酸序列。结果，发现了 50种蛋白质，并选择了 50种蛋白质的7种过表达的蛋白质。图1 显示了从产氨棒杆菌提取的样品的二维电泳分析的结果，其中将测定结果银染并显影用 于鉴定。在图1中，鉴定了通过CJl到CJ7表示的7种过表达的斑点。这些7种过表达 的蛋白质的功能在表1中指出。通过将肽的序列与NCBI gene bank数据库中所含的氨基 酸序列比较，鉴定了这些蛋白质的功能。表 1
权利要求
1.启动子，其由SEQIDNO 7的多核苷酸组成。
2.表达盒，其包含权利要求1的启动子并且可操纵连接编码序列。
3.载体，其包含权利要求2的表达盒。
4.宿主细胞，其包含权利要求3的载体。
5.权利要求4的宿主细胞，其是属于棒杆菌属(Corynebacterium)或埃希氏菌属 (Escherichia)的细菌细胞。
6.表达异源基因的方法，其包括培养权利要求4或者权利要求5的宿主细胞。
全文摘要
提供了包括至少一种选自由SEQ ID NO1到7组成的组的多核苷酸的启动子、包括该启动子的表达盒、包括该表达盒的载体、包括该载体的宿主细胞，和使用该宿主细胞表达基因的方法。
文档编号C12N15/113GK102010862SQ20091026608
公开日2011年4月13日 申请日期2005年12月16日 优先权日2004年12月16日
发明者崔惠真, 强泰善, 朴英薰, 李源植, 李真浩, 沈栽益, 金显洙, 黄水渊 申请人:Cj第一制糖株式会社