专利名称：：含稳定聚合酶的反应化合物的干组合物的利记博彩app含稳定聚合酶的反应化合物的干组合物
背景技术：
：极少生物反应化合物以溶解形式在任何长的时间内保持稳定，尤其在室温下储存更是如此。因此，过去进行了大量评价增强干燥形式生物反应化合物储存能力可能性的研允。基于在干反应化合物领域的大量现有技术文献，本领域技术人员确信为了确保例如聚合酶在重新溶解时的生物活性，使用至少一种稳定添加剂是必不可少的。WO2008/36544描述了为提供干组合物的所谓填充材料的应用，所述填充材料是例如糖类(如FIC0L1"、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、松三糖、DEXTRANTM或甘露醇)、蛋白质(如BSA、明胶或胶原)以及聚合物(如PEG或聚乙烯吡咯烷酮(PVP))。在US5，098，893、US5，200，399和US5，240，843中进一步描述了用于稳定生物试剂的玻璃形成的填充材料。在US3，300，474中公开的填充材料FICOLL是共聚物。此外，液体反应混合物的干燥方法在大多数情况下本质上是非常复杂的，因此干燥程序有很高的要求而且昂贵。在文献中，冻干(US5，593，824)或真空干燥(US5，565，318)用于干燥糖类聚合物基质中的生物材料。冷冻干燥法即冻干是在很多现有技术文献中公开的充分建立的蛋白质储藏技术(例如Passot，S.，等，PharmaceuticalDevelopmentandTechnology12(2007)543-553;Carpenter，J.F.，等，Pha皿ceuticalResearch14(8)(1997)969-975;Schwegman，J.J.，等，PharmaceuticalDevelopmentandTechnology10(2005)151-173)。在US7，407，747中描述了包含Taq聚合酶遗传修饰的用于测序的不同反应混合物干燥条件的选择。所使用的干燥程序是冻干、在没有另外加热下的离心真空蒸发浓縮(speedvac)、在另外加热下的离心真空蒸发浓縮和室温风干。对该专利内的反应混合物进行了有关各种冷冻保护剂如海藻糖、蔗糖、葡萄糖和三甲胺-N-氧化物(TMAN0)的试验。此外，还进行了在没有任何冷冻保护剂下的实验，但没有公开关于那些反应混合物稳定性随时间变化的数据。仅报道了含有海藻糖和牛血清白蛋白(BSA)的反应混合物长达8周的良好稳定性。此外，US7，407，747公开了使用各种测序混合物中的聚合酶的实验，所述测序混合物包含缓冲液、核苷酸、含荧光标记的核苷酸和引物的各种组成。尚没有公开是否可干燥并储存用于实时PCR扩增的混合物(即含有缓冲液、核酸、引物和检测探针的混合物)中的聚合酶而不影响聚合酶的PCR活性。本发明提供了干燥实时PCR混合物内TaqDNA聚合酶的方法，而所获得的干组合物可被储存但不影响TaqDNA聚合酶的PCR性能。发明概述提供含有聚合酶的反应化合物的干组合物是一个复杂的问题，特别是在以下情况意欲将所述干组合物储存一定时间并且所述干组合物随后的重新溶解必须尽可能不影响PCR应用的聚合酶活性。在干燥含不同组分的液体溶液过程中，所述组分的浓度会不断增加，致使其性质3彻底改变，而液体溶液的确切性能取决于各组分和干燥程序。技术人员认识到的是，例如高盐浓度将使蛋白质失去稳定性，缓冲液在高浓度下性能将改变，导致产生极端的pH值。如上文所述，本领域技术人员了解可加入到含有聚合酶的溶液中以增强聚合酶在干燥过程中的稳定性的某些化合物。此外，如果某种聚合酶的混合物的组分会改变，那么本领域技术人员将不能预料可得到该聚合酶的相同干燥效果。例如，US7，407，747公开了可在由以下物质组成的混合物中干燥Taq聚合酶缓冲液、核苷酸、BSA和海藻糖，并且公开了所述聚合物可保持活性长达8周。开发了本发明的方法以提供PCR应用的聚合酶干组合物，所述组合物不仅包含缓冲剂和核苷酸，而且还包含另外的组分(即引物乃至引物和探针)，以构成完整的检测混合物。业已认识的是，可将含有聚合酶、核苷酸和稳定分子的液体混合物进行干燥和储存而不影响聚合酶的活性，但如果将额外的引物加到液体混合物中，则会使聚合酶的活性丧失。更详细地说，如果在干燥程序之后直接进行重新溶解，则由于引物的加入而使PCR性能丧失。本发明解决了增加Taq聚合酶稳定性致使所干燥的液体混合物可包含附加的引物这一技术问题。令人意想不到的是，发现将适配体加入液体溶液增强了Taq聚合酶的稳定性，其中所述稳定化不仅对于干燥而且对于干燥混合物的储存都是足够好的。因此，本发明的一个方面是制备可储存的反应化合物干组合物的方法，所述方法包括以下步骤a)提供反应化合物的液体混合物，所述液体混合物包含引物、核苷酸、TaqDNA聚合酶和第一稳定分子，禾口b)通过降低所述液体混合物周围的压力来干燥所述液体混合物，其中所述反应化合物干组合物在水溶液中是可溶性的，其特征在于步骤a)中所述反应化合物的液体混合物进一步包含作为第二稳定分子的适配体。在本发明全文中，短语"干组合物"用于强调溶剂的量，优选水溶剂下降至5%重量以下。短语"可储存的干组合物"在本发明全文中意指所述干组合物必须可储存至少一周，优选至少4周，更优选8周以上而不影响聚合酶的活性。本发明中的"稳定分子"是在含有所述聚合酶水溶液的干燥过程中，提高聚合酶对其PCR活性丧失的抗性的分子。本发明的另一方面是含有引物、核苷酸、TaqDNA聚合酶、第一稳定分子和作为第二稳定分子的适配体的反应化合物的干组合物，所述干组合物提供了室温储存至少一周后重新溶解时的PCR活性。还有本发明的另一方面是实施PCR扩增的方法，所述方法包括以下步骤a)通过加入水溶液重新溶解本发明的反应化合物干组合物，禾口b)用含有重新溶解的反应化合物的水溶液实施热循环方案。发明详述本发明的一个方面是提供反应化合物的可储存干组合物的方法，所述方法包括以下步骤a)提供反应化合物的液体混合物，所述液体混合物包含引物、核苷酸、TaqDNA聚合酶和第一稳定分子，禾口b)通过降低所述液体混合物周围的压力干燥所述液体混合物，其中所述反应化合物的干组合物在水溶液中是可溶性的，其特征在于步骤a)中所述反应化合物的液体混合物进一步包含作为第二稳定分子的适配体。可从几类分子中选出用于TaqDNA聚合酶的第一稳定分子。本发明优选的方法是其中所述第一稳定分子是蛋白质，优选所述的稳定分子是酪蛋白和BSA的方法。本发明另一个优选的方法是其中所述第一稳定分子是糖类，优选所述稳定分子是海藻糖或甘露醇的方法，。本发明又一个优选的方法是其中所述第一稳定分子是合成聚合物，优选所述稳定分子是PEG或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的方法。本发明令人意想不到的发现是，另一类分子，即适配体类能够为聚合酶提供稳定作用。已知适配体在溶液中与聚合酶结合，并将所谓的"热启动"特征附加到聚合酶中(例如US5，475，096和US5，270，163)。简言之，短的寡核苷酸(适配体)与聚合酶结合致使聚合酶活性被阻断。如果在PCR扩增的热循环方案中温度升高到某一阈值以上，适配体则将释放聚合酶并启动聚合酶活性。因此，在"热启动，CR中，利用与聚合酶结合的适配体可阻碍不合乎需要的聚合酶低温活性，直到反应温度达到足以实施引物退火的高严格性。如上文所述，可干燥、储存并重新溶解含有缓冲剂、核苷酸和第一稳定分子的混合物中的TaqDNA聚合酶而不影响聚合酶活性，但向混合物加入引物之后，聚合酶活性在干燥之后直接丧失。只有在将适配体加入到溶液之后，聚合酶活性才可重新恢复。在不受理论的束缚下，预期引物3'端的羟基至少影响提供PCR活性的聚合酶的那些氨基酸。通过另外的实验(数据未显示)来检验该理论，其中用磷酸化的引物来代替引物，并分析了干燥后的PCR活性。结果表明磷酸化的引物不影响聚合酶，并且无需额外的适配体即可干燥反应化合物的液体混合物。在TaqDNA聚合酶的情况下，可将包含缓冲剂、核苷酸和例如作为稳定分子的酪蛋白的混合物进行干燥、储存和重新溶解而不影响聚合酶的稳定性(见实施例)。将引物加入混合物之后，PCR性能在干燥后直接丧失(数据未显示，实施例仅显示储存后的结果)。因此，由于在液体混合物中引物的加入，增加了对稳定用于干燥的Taq聚合酶的需要。另外的实验显示，在没有第一稳定分子下，适配体不能提供足够的稳定性以维持聚合酶的活性(数据未显示)。因此，第一稳定分子与适配体的结合能够使包含缓冲剂、核苷酸和引物的混合物中的T叫DNA聚合酶的干燥和储存成为可能。在本发明的一个优选方法中，所述适配体是具有序列SEQIDN0:9或SEQIDNO:10的适配体。在不受理论的束缚下，预期由于适配体附着在TaqDNA聚合酶上的能力，其增强了聚合酶对高盐浓度、极端PH值和引物羟基的抗性。在本发明另一个优选的方法中，所述反应化合物的液体混合物是包含镁盐的缓冲水溶液。5在本发明更优选的方法中，用Tris或H印es对所述反应化合物的液体混合物进行缓冲。在本发明另一个更优选的方法中，所述反应化合物的液体混合物进一步包含氯化钾。对于本发明方法的步骤b)中的干燥程序，若干工作流程是合适的。一般而言，本领域技术人员认识的是，干燥液体混合物所需的时间与所述液体混合物周围的压力相关。在本发明中认可的是，压力不应(至少不应在一个步骤内)降至非常小的压力值。如果压力差太大，那么液体混合物与含混合物的容器会接触不良，致使不能再实现完全的重新溶解。在本发明一个优选的方法中，步骤b)中所述液体混合物周围的压力下降至低于600mbar，优选低于400mbar，更优选200mbar。在本发明一个更优选的方法中，维持所述减少的压力至少6小时，优选至少10小时，最优选16小时。基于实验室操作的合宜性，优选在200mbar下储存液体混合物过夜。为了减少制备干组合物所需的时间，可在两个步骤内完成本发明方法中的干燥步骤b)，即第一步用相对高的压力随后第二步用较低的压力。在本发明另一个优选的方法中，在步骤b)的第二部分进一步降低压力，所述进一步降低的压力低于200mbar，优选低于100mbar，最优选50mbar。在本发明又一个优选的方法中，所述进一步降低的压力维持至少1小时，优选至少3小时，最优选4小时。优选的2步干燥流程包括第一步在200mbar下10小时，随后第二步在50mbar下4小时。在本发明又一个优选的方法中，步骤b)中所述的干燥在室温下进行。在本发明中，结果表明将温度调节到某个高值或低值并不影响重新溶解时的PCR活性。因此，优选在室温下进行干燥。为了给实时PCR提供完整的干组合物，还必须在反应化合物的液体混合物中加入检测探针。在本发明中证实，在反应化合物的液体混合物中加入检测探针不影响重新溶解时的PCR活性。请注意如果液体混合物包含检测探针但不含引物，那么即使没有适配体，TaqDNA聚合酶仍维持其重新溶解时的PCR活性(数据未显示)。在本发明一个优选的方法中，所述反应化合物的液体混合物进一步包含检测探针。在本发明更优选的方法中，所述检测探针是荧光标记探针，优选杂交探针或水解探针。因为实时PCR通常是基于荧光检测而实施的，所以优选使用荧光标记探针。三种主要的探针模式简要介绍如下。a)水解探针模式(TaqMan⑧模式)用两种组分对单链的杂交探针进行标记。当用合适波长的光激发第一组分时，根据荧光共振能量转移原理，所吸收的能量转移至第二组分(即所谓的猝灭剂)。在PCR反应的退火步骤中，杂交探针结合到靶DNA上并在随后的延伸阶段中被Taq聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性降解。结果被激发的荧光组分和猝灭剂在空间上彼此分离，因而可测量到第6一组分的荧光发射(US5，210，015、US5，538，848、US5，487，972、US5,804,375)。b)分子信标(MolecularBeacon):还是用第一组分和猝灭剂对这些杂交探针进行标记，优选标记物位于探针的两端。作为探针二级结构的结果，两种组分在溶液中都是空间相邻的。在与靶核酸杂交之后，两种组分都彼此分离以至于在用合适波长的光激发之后，可测量到第一组分的荧光发射(US5，118，801)。c)FRET杂交探针该模式的特征在于同时使用了两种单链的杂交探针并且它们与所扩增靶核酸的同一条链的邻近位点互补。两种探针用不同的荧光组分来标记。当用合适波长的光激发时，根据荧光共振能量转移原理，第一组分将所吸收的能量转移给第二组分，以至于当两种杂交探针与被检测靶分子的邻近位置结合时，可以测量第二组分的荧光发射。作为监测FRET受体组分荧光增加的选择，还可监测FRET供体组分的荧光下降来作为杂交事件的定量测定(WO97/46707;WO97/46712;WO97/46714)。在大多数PCR应用中，需要结合对照机制以评价如此的PCR扩增是否确实有效。一般而言，这是用掺入到样本中的模板DNA(内部对照)或用单独的容器内的模板DNA(外部对照)来实施的。在本发明的全文中，这两种备选方式统称为短语"阳性对照"。在本发明优选的方法中，所述反应化合物的液体混合物进一步包含模板DNA。在本发明更优选的方法中，将所述模板DNA用作阳性对照。如上文所述，本发明内的实验提示核酸3'端的羟基影响TaqDNA聚合酶。因此，加到液体混合物中的模板DNA还可对重新溶解后的PCR性能产生不良影响。但是，可能基于模板DNA浓度比正常引物浓度低得多的原因，经鉴定表明在液体混合物中加入模板DNA不影响重新溶解后的PCR性能。在本发明更优选的方法中，所述模板DNA是环状质粒。这种环状质粒没有任何3'羟基，因此甚至可进一步减少羟基的不良影响。本发明的另一方面是包含引物、核苷酸、TaqDNA聚合酶、第一稳定分子和作为第二稳定分子的适配体的反应化合物干组合物，所述干组合物提供室温储存至少一周后重新溶解时的PCR活性。在本发明更优选的反应化合物干组合物中，在室温储存至少4周、更优选至少8周之后重新溶解时提供所述PCR活性。进行了若干评价长期稳定性的实验，例如包含带适配体NTQ12-46A(SEQIDNO:9)的TaqDNA聚合酶以及引物和探针的反应化合物干组合物提供了室温下储存8周后重新溶解时的PCR活性(数据未显示)。本发明优选的反应化合物干组合物是进一步包含检测探针的干组合物。在本发明更优选的反应化合物干组合物中，所述检测探针是荧光标记探针，优选杂交探针或水解探针。本发明另外优选的反应化合物干组合物是以下干组合物，其中所述第一稳定分子是蛋白质，优选所述稳定分子是酪蛋白或BSA。本发明还优选的反应化合物干组合物是以下干组合物，其中所述第一稳定分子是糖类，优选所述稳定分子是海藻糖或甘露醇。本发明还优选的反应化合物干组合物是以下干组合物，其中所述第一稳定分子是合成的聚合物，优选所述稳定分子是PEG或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在本发明另外优选的反应化合物干组合物中，所述适配体是具有序列SEQIDNO:9或SEQIDNO:10的适配体。在本发明还优选的反应化合物干组合物中，所述反应化合物液体混合物进一步包含模板DNA。在本发明更优选的反应化合物干组合物中，所述模板DNA是阳性对照。在本发明另外更优选的反应化合物干组合物中，所述模板DNA是环状质粒。本发明的另一方面是实施PCR扩增的方法，所述方法包括以下步骤a)通过加入水溶液重新溶解本发明反应化合物的干组合物，以及b)用包含重新溶解的反应化合物的水溶液实施热循环方案。无需特殊的辅助手段，通过简单地加入水溶液便可重新溶解本发明反应化合物的干组合物。但是为了帮助溶解并减少溶解时间，可优选施用机械剌激(mechanicalstimulation)。在本发明优选的实施PCR扩增的方法中，通过振荡混合物来帮助在步骤b)中所述的重新溶解。在本发明另外优选的实施PCR扩增的方法中，通过旋涡振荡混合物来帮助在步骤b)中所述的重新溶解。因为只需要加水到所述反应化合物干组合物中，所以在本发明范围内可有两种实施PCR扩增的备选方案。在第一种备选方案中，用水溶液对干组合物进行重新溶解，然后加入含有被分析靶核酸的样品。在第二种备选方案中(优选的备选方案)，直接用含有被扩增靶核酸的水溶液重新溶解干组合物。在本发明优选的方法中，所述水溶液包含通过热循环方案进行扩增的靶核酸。提供以下实施例、序列表和附图以帮助理解本发明，其实际范围在所附的权利要求书中阐述。应该理解的是，可对所阐述的方法进行不离背本发明精神的修改。图1用Taq聚合酶和酪蛋白进行的Eamst质粒扩增图2用Taq聚合酶和酪蛋白进行的Wsebi质粒扩增图3用Taq聚合酶和BSA进行的Eamst质粒扩增图4用Taq聚合酶和BSA进行的Wsebi质粒扩增图5用Taq聚合酶、NTQ12-46A适配体和酪蛋白进行的Eamst质粒扩增图6用Taq聚合酶、NTQ12-46A适配体和酪蛋白进行的Wsebi质粒扩增图7用Taq聚合酶、NTQ12-46A适配体和BSA进行的Eamst质粒扩增图8用Taq聚合酶、NTQ12-46A适配体和BSA进行的Wsebi质粒扩增图9用Taq聚合酶、NTQ12-46A适配体和酪蛋白进行的Wsebi质粒扩增图10用Taq聚合酶、21-41-P适配体和酪蛋白进行的Wsebi质粒扩增图11用Taq聚合酶、NTQ12-46A适配体和酪蛋白进行的Eamst质粒扩增图12用Taq聚合酶、21-41-P适配体和酪蛋白进行的Eamst质粒扩增8图13用干燥的质粒DNA、Taq聚合酶、NTQ12-46A适配体和酪蛋白进行的Eamst质粒扩增图14用干燥的质粒DNA、Taq聚合酶、NTQ12-46A适配体和酪蛋白进行的Wsebi质粒扩增实施例1TaqDNA聚合酶的稳定性该实施例概述了在不含适配体下TaqDNA聚合酶的液体混合物的效果。使用两种不同的参数，在含和不含检测混合物(detectionmix)(含或不含引物和探针)下分析了储存并重新溶解后聚合酶的PCR性能。重新溶解之前将液体混合物于200mbar下干燥16小时，并在37t:下储存l周。还使用了未干燥的液体混合物作为对照(以下称为液体参照)。在384孔微量滴定板(RocheDiagnosticGmbH)的孔中提供所有混合物，重新溶解之后在LightCycler⑧'480(RocheDiagnosticGmbH)上使用以下运行方案来实施PCR运行。-5分钟95。C-10秒钟95°C，30秒钟60°C，1秒钟72°C(45x)-10秒钟4(TC含酪蛋白的Mastermix:60mMTris/HClpH8，3，60mMKCl，6，4mMMgC12，0，4mMdATP，0，4mMdCTP，0，4mMdGTP，1，2mMdUTP，lmg/mL酪蛋白和0，3U/ii1TaqDNA聚合酶(无甘油)。含BSA的Mastermix:60mMTris/HClpH8，3，60mMKCl，6，4mMMgC12，0，4mMdATP，0，4mMdCTP，0，4mMdGTP，1，2mMdUTP，lmg/mlBSA和0，3U/ii1TaqDNA聚合酶(无甘油)。qPCREamstDetectionMix:10mMTrispH8，3，0，05%Brij，7，liiM正向引物(SEQIDNO:1)，7'lyM反向弓l物(SEQIDNO:2)禾P0，6iiMFam-Tamra探针(SEQIDNO:3)。qPCRWsebiDetectionMix:10mMTrispH8，3，0，05%Brij，7，liiM正向引物(SEQIDNO:4)，7，lyM反向弓l物(SEQIDNO:5)禾P0，6iiMFam-Tamra探针(SEQIDNO:6)。在微量滴定板上制备和干燥下列混合物，将每种混合物以3个重复置于所述微量滴定板上<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>对于随后的PCR扩增，按照以下移液方案通过加入溶液重新溶解干组合物。在PCR运行之前将液体参照移液至微量滴定板的空孔中。以4xl0e4拷贝/yl的浓度对质粒进行移液。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>结果本实施例的PCR扩增曲线概述于图1-4中，其中不含检测混合物(detectionmix)的曲线用"1"标号，含检测混合物的曲线用"2"标号，液体参照曲线用"3"标号。此外，下表概述了由图l-4的曲线所获得的PCR值。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>该实施例清楚地显示，在不含检测混合物下干燥的TaqDNA聚合酶的性能等同于在液体参照中的T叫DNA聚合酶的性能。在另一方面，如果在含检测混合物下干燥T叫DNA聚合酶，则重新溶解后的PCR性能不再是可接受的。对于Wsebi参数，在含检测混合物下进行干燥的情况下，根本没有可检测到的扩增。对于Eamst参数，相似的交点仍然是可检测到的，但荧光值不再是可接受的。实施例2含适配体NTQ12-46A的TaqDNA聚合酶的稳定性该实施例概述了含适配体NTQ12-46A(SEQIDNO:9)的TaqDNA聚合酶的液体混合物的效果。在该实施例中，含附着的适配体的T叫DNA聚合酶命名为AptaT叫DNA聚合酶國12-46A。使用两种不同的参数，在含和不含检测混合物(detectionmix)(含或不含引物和探针)下分析了储存并重新溶解后聚合酶的PCR性能。重新溶解之前将液体混合物于200mbar下干燥16小时，并在37。C下储存1周。还使用了未干燥的液体混合物作为对照(以下称为液体参照)。在384孔微量滴定板(RocheDiagnosticGmbH)的孔中提供所有混合物，重新溶解之后在LightCycler⑧'480(RocheDiagnosticGmbH)上使用以下运行方案来实施PCR运行-5分钟95。C-10秒钟95°C，30秒钟60°C，1秒钟72°C(45x)-10秒钟4(TC含酪蛋白的Mastermix:60mMTris/HClpH8，3，60mMKCl，6，4mMMgC12，0，4mMdATP，0，4mMdCTP，0，4mMdGTP，l，2mMdUTP，lg/L酪蛋白和0，3U/ii1AptaTaqDNA聚合酶(无甘油；0，65pmo1适配体(NTQ12-46A;SEQIDNO:9)/lUTaqDNA聚合酶)。含BSA的Mastermix:60mMTris/HClpH8，3，60mMKCl，6，4mMMgC12，0，4mMdATP，0，4mMdCTP，0，4mMdGTP，1，2mMdUTP，lmg/mlBSA和0，3U/ii1AptaTaqDNA聚合酶(无甘油；0，65pmo1适配体(NTQ12-46A;SEQIDN0:9)/1UTaqDNA聚合酶)。qPCREamstDetectionMix禾口qPCRWsebiDetectionMix:这些检测混合物与实施例1中的相同。在微量滴定板上制备和干燥下列混合物，将每种混合物以3个重复置于所述微量滴定板上<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>对于随后的PCR扩增，按照以下移液方案通过加入溶液重新溶解干组合物。在PCR运行之前将液体参照移液至微量滴定板的空孔中。以4xl0e4拷贝/yl的浓度对质粒进行移液。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>结果本实施例的PCR扩增曲线概述于图5-8中，其中在不含检测混合物下干燥后的曲线用"1"标号，在含检测混合物下干燥后的曲线用"2"标号，液体参照(未干燥)的曲线用"3"标号。此外，下表概述了由图5-8的曲线所获得的PCR值。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>为了证实适配体的稳定化性质，需要将图5-8的扩增曲线与图1-4比较，更准确地讲是图5与图1比较，图6与图2比较，图7与图3比较，图8与图4比较。很显然图1_4显示显著下降的干燥后扩增曲线，而图5-8显示仅有轻微改变的干燥后扩增曲线。该实施例清楚地显示，在含或不含检测混合物下干燥的AptaT叫DNA聚合酶NTQ12-46A的性能在干组合物重新溶解后仍然是可以接受的。实施例3含适配体NTQ12-46A与含适配体21-42-P的TaqDNA聚合酶的比较在该实施例中，将含适配体NTQ12-46A(SEQIDNO:9)的TaqDNA聚合酶与含适配体21-42-P(SEQIDNO:10)的T叫DNA聚合酶的液体混合物的PCR性能进行比较。在该实施例中，含附着的适配体的T叫DNA聚合酶分别命名为AptaT叫DNA聚合酶NTQ12-46A和AptaTaqDNA聚合酶21_42_P。使用两种不同的参数，在含检测混合物(含引物和探针)下分析了储存并重新溶解后含上述两种适配体的聚合酶的PCR性能。重新溶解之前将液体混合物于200mbar下干燥16小时，并在37t:下储存l周。还使用了未干燥的液体混合物作为对照(以下称为液体参照)。在384孔微量滴定板(RocheDiagnosticGmbH)的孔中提供所有混合物，重新溶解之后在LightCyder⑧'480(RocheDiagnosticGmbH)上使用以下运行方案来实施PCR运行-5分钟95。C-10秒钟95°C，30秒钟60°C，1秒钟72°C(45x)-10秒钟4(TC含酪蛋白+适配体NTQ21-46A的Mastermix:60mMTris/HClpH8，3，60mMKCl，6，4mMMgC12，0，4mMdATP，0，4mMdCTP，0，4mMdGTP，l，2mMdUTP，lg/L酪蛋白和0，3U/ii1AptaTaqDNA聚合酶(无甘油；0，65pmo1适配体NTQ12-46A(SEQIDN0:9)/1UTaqDNA聚合酶)。含酪蛋白+适配体21-42-P的Mastermix:60mMTris/HClpH8，3，60mMKCl，6，4mMMgC12，0，4mMdATP，0，4mMdCTP，0，4mMdGTP，l，2mMdUTP，lg/L酪蛋白，0，8U/ii1AptaTaqDNA聚合酶(无甘油；0，5iiM适配体21-42-P(SEQIDN0:10)。13qPCREamstDetectionMix禾口qPCRWsebiDetectionMix:这些检测混合物与实施例1中的相同。在微量滴定板上制备和干燥下列混合物，将每种混合物以3个重复置于所述微量滴定板上<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>对于随后的PCR扩增，按照以下移液方案通过加入溶液重新溶解对应每种适配体的干组合物。在PCR运行之前将液体参照移液至微量滴定板的空孔中。以4xl0e4拷贝/P1的浓度对质粒进行移液。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>结果图9-12概述了该实施例的PCR扩增曲线，其中在含检测混合物下干燥后的曲线用"l"标号，液体参照(未干燥)曲线用"2"标号。此外，下表概述了由图9-12的曲线获得的PCR值。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>再次，为了证实适配体的稳定化性质，需要将图9-12的扩增曲线与图1-4的相比较，显然图1-4显示了干燥后显著下降的扩增曲线，而图9-12显示了仅轻微改变的干燥后曲线。该实施例清楚地显示，在含检测混合物下干燥的AptaT叫DNA聚合酶NTQ12-46A与AptaTaqDNA聚合酶21_41_P的性能在干组合物重新溶解后是相当的。实施例4在含质粒DNA下干燥的AptaTaqDNA聚合酶NTQ12-46A在本实施例中，将含AptaTaqDNA聚合酶NTQ12-46A、两种不同参数的质粒和各自的检测混合物的液体混合物进行干燥，并将储存并重新溶解后的PCR性能与不含所述质粒的液体混合物进行比较。重新溶解之前将液体混合物于200mbar下干燥16小时，并在37°C下储存1周。还使用未干燥的液体混合物作为对照(以下称为液体参照)。在384孔微量滴定板(RocheDiagnosticGmbH)的孔中提供所有混合物，重新溶解之后在LightCycler⑧480(RocheDiagnosticGmbH)上使用以下运行方案来实施PCR运行-5分钟95。C-10秒钟95°C，30秒钟60°C，1秒钟72°C(45x)-10秒钟4(TCMastermix和两种检测混合物均与在实施例2中的相同。在微量滴定板上制备和干燥下列混合物，将每种混合物以3个重复置于所述微量滴定板上。以4xl0e4拷贝/ill的浓度对质粒进行移液。AptaTaqDNA聚合酶NTQ12-46AEamstWsebi含DetectionMix的Master5jilMaster+1,4(ilDetectionMixEamst5fiMaster+1,4jalDetectionMixWsebi含DetectionMix和质粒DNA的Master5jilMaster+1,4^1DetectionMixEamst+2,5质粒DNAEamst5pi2xMaster+1，4piDetectionMixWsebi+2，5]al质粒DNAWsebi对于随后的PCR扩增，按照以下移液方案通过加入溶液重新溶解对应每种混合物的干组合物。在PCR运行之前将液体参照移液至微量滴定板的空孔中。15<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>结果图13-14概述了该实施例的PCR扩增曲线，其中在不含质粒下干燥后的曲线用"1"标号，在含质粒下干燥后的曲线用"2"标号，液体参照曲线(未干燥)用"3"标号。此外，下表概述了由图13-14的曲线获得的PCR值。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>该实施例清楚地显示，即使在干燥之前将质粒加入液体混合物中，在干组合物的储存和重新溶解后AptaTaqDNA聚合酶NTQ12-46A的性能也是不受影响的。序列表〈110〉罗赫诊断器材股份有限公司霍夫曼-拉罗奇有限公司〈120〉含稳定聚合酶的反应化合物的干组合物〈130>25614FT〈150>EP08022082〈151>2008_12-19〈160>10〈170>PatentInversion3.5〈210>1〈211〉17〈212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉正向引物Eamst〈400〉1gtggcggcaccatgtct〈210>2〈211>23〈212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉反向引物Eamst〈400>2ctggtt朋朋agattggttgCg￡l〈210〉3〈211〉22〈212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223>Fam-Tamra探针Eamst〈400〉3cagctggacctacgggagcggg〈210>4〈211>21〈212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉正向引物Wsebi〈400>4ggcttagtgaatccttcggag〈220〉〈223〉反向引物Wsebi〈400>5gtttacccaactttgcagtcca〈210>6〈211>23〈212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223>Fam-Tamra探针Wsebi〈400>6tgtgccgttgccggctca朋teg〈210>7〈211>3227〈212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223>Eamst质粒〈400>7tcgcgcgtttcggtgatgacggtg皿皿cccagcttgtctgt朋gCggEltgccgggagrattggcgggtgtcggggctggctteactetgaccategatcctgaggatcggggtgat腿tggcgcg卿tctaaaaaaa朋ggctcc皿ccactccgacgggatt雄gagtgccgteaaggttctgatcctcgagcatctteagaattatctgggtggcggcaccatgtctggtcctcteggtccagctggragctegcctcgcaaccgtaattttgatttgcatgccgtccgggtga3gC3g3gtctgtg咖tgcggccgctgacgctagtgacctgcagccggcgcgccatctgtacctgaatcaattggcg^attttttgtecgcacgtecccatgcgctecgttcctggccctcaccctgattcagateggagaggatcattgCC3C3g3gCcttteacgatgtegtecagcgtgctcttggatgggtecttatg皿tgtggtccgtttgaggttteccaagteccateagatecctga皿gCggC3tC3g3gcagattgtectg卿gtgc2223tctgacacatgcagctcccggagacggtca60gacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtg120cggcatcagagcagattgtectgagagtgc180tcagtctgcgccaratcggggga朋c皿朋240aaggagcctttcgcgcteccaggtaacgcg300acgacgatggttttaccgtgtgcggagatc360cgtcccacggtttgtctegagcagccgaca420gagcgtetggggctttgtcacccgctcccg480aatcttttteaccagccaatttcctgacgg540gtcatagcgtctggttgttttgccagattc600tcgaggaacgccaggttgcccactttctca660gcagacaaacgcatcaggatatccggattt720gaaatttcagccacttcacaggcggttttc780tcttcaaacaggcccagttcgccaateaaa840tctttaccctcttcgtctttgatcagcact900gtttccgctttttcaccctggtgaateagc960c皿tgag3C33g皿ccattcgagagtegga1020tccttaaatttttettetctagctagatga1080caaataaattttttatctggctteactetg1140accatatgcggtgtgaaateccgcacagat120018gcgte郷ag朋皿teccgcatcaggcgctgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtetccacagaatcgC3gg朋3g3gg皿ccgtea朋aggccgcgttgctggcgttcgacgctca賜tc卿ggtaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgatecctgtccgcctttctcccttcgggaaggtetctcagttcggtgteggtcgttcgctttcagcccgaccgctgcgccttetccggteacgacttatcgccactggcagcagccactggcggtgctecagagttcttg朋gtggtggcttggtetctgcgctctgctg朋gccagtteCCggC3朋C3aaccaccgctggtegcggtggcag皿朋皿3ggatctc皿gaagatccttgg皿cg朋皿ctcacgtteagggattttggagatcctttttgaagtttteggtctg織gtteccaatgctteatcagtggttcatccatagttgcctgactccccgtcgcatctggccccagtgctgcaatgateccgccagc皿te皿ccagccagccgg皿gggccgcctccatccagtctetteattgttgccggggtttgcgcaacgttgttgccattgctacagtggcttcattcagctccggttcccaacgatgc皿皿朋gcggttegctccttcggtcctctgttetcactcatggttetggcagcactgcgatgcttttctgtgactggtgagtectc皿g紅gagttgctcttgcccggcgtcaateccatcattggaaaacgttctttgttgagatccagttcgatgtaacccactcctttcaccagcgtttctgggt朋gggcgactgaatectcatttetcagggttettgtctc咖teggggttccgcgcacatttccccgaacatgacatteateggcgtet〈210〉8〈211〉3200〈212〉DNA〈213〉人工的〈220〉cttccgcttcctcgctcactgactcgctgc1260cagctcactca皿ggcggteatecggttet1320皿皿ggCC3gc皿朋ggcca1380ttttccateggctccgcccccctgacgagc1440ggcg朋acccgacaggactete朋gatecc1500gctctcctgttccgaccctgccgctteccg1560gcgtggcgctttctcategctcacgctgta1620cc皿gctgggctgtgtgcacgaaccccccg1680actetcgtcttgagtccaacccggteagac1740gteacaggattegcagagcg郷tetgteg1800cteactecggctecactega3gg3cagtet1860ccttcggaaaa卿gttggtagctcttgat1920gtttttttgtttgc皿gcagcagattecgc1980tgatcttttctecggggtctgacgctcagt2040tcatgagattatc朋a朋ggatcttcacct2100gagte皿ctt2160aggcacctetctcagcgatctgtctetttc2220tgtegateactecgatecggg郷gcttec2280gagacccacgctcaccggctccagatttet23403gCgC3g皿gtggtcctgcaactttetccg2400皿gctegagt皿gtegttcgccagtteata2460gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggta2520c皿ggcgagttecatgatcccccatgttgt2580cgatcgttgtcag朋gteagttggccgcag2640ateattctcttectgtcatgccatccgtaa2700ccaagtcattctgag皿tegtgtetgcggc2760gggateateccgcgccacat2820cggggcg腿actctcaaggatctteccgc2880gtgcacccaactgatcttcagcatctttta2940C3gg朋ggC33皿tgCCgC3皿朋aggg皿3000tectcttcctttttcaatettettg皿gca3060acatetttgaatgtattteg3120aagtgccacctgcteag^accattettet3180cacgaggccctttcgtc322719〈223〉Wasabi质粒〈400>8tcgcgcgtttcggtgatgacggtg皿皿cctctgacacatgcagctcccggagacggtca60cagcttgtctgt朋gCggEltgccgggagragac皿gcccgtcagggcgcgtcagcgggtg120ttggcgggtgtcggggctggctteactetgCggC3tC3g3gcagattgtectg卿gtgc180accategatcctgaggatcggggtgat腿tcagtctgcgccacatcggg240tggcgcg卿tctaaaaaaa皿ggctcc皿皿ggagcctttcgcgcteccaggteacgcg300ccactccgacgggatt雄gagtgccgteaacgacgatggtttteccgtgtgcgg卿tc360aggttctgatcctcgagcatctteagaattcgtcccacggtttgtctegagC3gCCg3C3420atctgggtttacccaactttgC3gtCC皿3tgtgccgttgccggctcaaategaccactc■cg朋ggattcacteagccccaatttcctgacgggteattttgatttgcatgccgtccggg540tgagtcategcgtctggttgttttgccagatctgtgcaatgcggccgctg600acgtcgaggaacgccaggttgcccactttctcactegtgacctgcagccggcgcgccatc660tgtgC3g3C3皿CgC3tC3ggatetccggatttecctgaatcaattggcgaaattttttg720tecgaaatttcagccacttc織ggcggttttcgcacgtecccatgcgctacgttcctgg780ccctcttcaa3C3ggCCC3gttcgccaateaaatcaccctgattcagategg卿ggatc840atttcttteccctcttcgtctttgatcagcactgccacagagccttteacgatgtegtec■agcgtttccgctttttcaccctggtg皿teagcgtgctcttggatgggtecttetgaatg960tggC朋tgElgttcgagagteggatccgtttgaggtttecc皿gteccate1020agatcctteaatttttattetctegctegatgateatettttgtacctga1080attttttetctggcttaactatgcggcatcgtectg卿g1140tgcaccatetgcggtgtg皿ateccgcacagatgcgt皿ggag皿朋teccgcatcaggc1200gctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcgg1260tetcagctcactca皿ggcggteatecggttetccacagaatc郷ggat皿cgcagg朋13203g朋C3tgtgagc皿朋ggcC3gC皿皿ggccagg皿ccgte皿皿ggccgcgttgctgg1380cgtttttccataggctccgcccccctgacga^tcgacgc1440ggtggcg腿CCCg3C3gg3ctete朋gataccaggcgtttccccctggaagctccctcg1500tgcgctctcctgttccgaccctgccgctteccggatecctgtccgcctttctcccttcgg1560gaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgteggtetctcagttcggtgteggtcgttc1620gctccaagctgggctgtgtgcacg皿ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttetccg1680gtaactetcgtcttgagtcc朋cccggteagacacgacttatcgccactggC3gC3gCC31740ctggteacaggattegcagagcg郷tetgteggcggtgctacagagttcttg皿gtggt1800ggccteactecggctecact3g皿gg3C3gtetttggtetctgcgctctgctg朋gccag1860ttaccttcggggtegctcttgatccggc皿gctggtegcg1920gtggtttttttgtttgcaagragc3gatteCgCgC3g皿3c皿g皿gatc1980ctttgatcttttctecggggtctgacgctc3gtgg皿Cg3aaactcacgtteagggattt2040tggtcatgagaggatcttcacctegatcct2100cte皿gtetetetgagte皿cttggtctgacagtteccaatgctteatca2160gtgaggcacctatctcagcgatctgtctetttcgttcatccategttgcctgactccccg222020tcgtgtegat朋ctecgatecggg郷gctteccatctggccccagtgctgcaatgatec2280cgcgagacccacgctcaccggctccagatttetcagcaat皿3CC3gCC3gccgg皿ggg2340ccgagcgcagaagtggtcctgcaactttetccgcctccatccagtctettaattgttgcc2400ggg皿gctegagteagtegttcgccagtteategtttgcgcaacgttgttgccattgcta2460caggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtetggcttcattcagctccggttcccaac2520gatc皿ggcgtcccccatgtagcggttegctccttcggtc2580ctccgatcgttgtcag皿gt朋gttggccgcagtgttetcactcatggttatggcagcac2640tgcateattctcttectgtcatgccatccgteagatgcttttctgtgactggtgagtect2700caaccaagtcattctgag皿tagtgtatgcggcg紅gagttgctcttgcccggcgtcaa2760tecgggateataccgcgccacategc3g皿cttteaaagtgctcatcattggaaaacgtt2820cttcggggcgaggatctteccgctgttgagatccagttcgatgtaaccca2880ctcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttectttcaccagcgtttctgggtgagc朋2940gc皿皿tgccgc皿皿皿ggg皿t朋gggcgac3cgg皿3tgttg皿tec3000tcatectcttcctttttcaagcatttetcagggttettgtctcatgagcg3060gatecatatttgaatgtett皿ca朋teggggttccgcgcacatttcccc3120g朋皿gtgccacctgcteagtetcatgacatteacctete皿皿teggcg3180tatcacgaggccctttcgtc3200〈210>9〈211>46〈212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉适配体NTQ12-46A〈400>9cgatcatctcagaacattcttagcgttttgttcttgtgtatgatcg站〈210>10〈211>42〈212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉适配体21-42-P〈400>10gatcatctcagaacattcttagcgttttgttcttgtgtatga4权利要求制备反应化合物的可储存干组合物的方法，所述方法包括以下步骤a)提供反应化合物的液体混合物，所述液体混合物包含引物、核苷酸、TaqDNA聚合酶和第一稳定分子，以及b)通过降低所述液体混合物周围的压力干燥所述液体混合物，其中所述反应化合物的干组合物可溶于水溶液中，所述方法的特征在于步骤a)的所述反应化合物的液体混合物进一步包含作为第二稳定分子的适配体。2.权利要求l的方法，其中所述第一稳定分子是蛋白质，优选所述稳定分子是酪蛋白或BSA。3.权利要求1-2的方法，其中所述适配体是具有序列SEQIDN0:9或SEQIDN0:10的适配体。4.权利要求1-3的方法，其中所述反应化合物的液体混合物是含有镁盐的缓冲水溶液。5.权利要求l-4的方法，其中在步骤b)中所述液体混合物周围的压力下降至低于600mbar，优选低于400mbar，最优选至200mbar。6.权利要求l-5的方法，其中在步骤b)中所述干燥在室温下完成。7.权利要求1-6的方法，其中所述反应化合物的液体混合物进一步包含检测探针，优选所述检测探针是荧光标记探针。8.权利要求1-7的方法，其中所述反应化合物的液体混合物进一步包含模板DNA。9.反应化合物的干组合物，所述干组合物包含引物、核苷酸、TaqDNA聚合酶、第一稳定分子和作为第二稳定分子的适配体，所述干组合物提供室温下储存至少1周后重新溶解时的PCR活性。10.权利要求9的反应化合物的干组合物，其中所述反应化合物的干组合物进一步包含检测探针。11.权利要求9-10的反应化合物的干组合物，其中所述第一稳定分子是蛋白质，优选所述稳定分子是酪蛋白或BSA。12.权利要求9-11的反应化合物的干组合物，其中所述适配体是具有序列SEQIDNO:9或SEQIDNO:10的适配体。13.实施PCR扩增的方法，所述方法包括以下步骤a)通过加入水溶液重新溶解权利要求9-12的反应化合物的干组合物，并且b)用包含重新溶解的反应化合物的水溶液来实施热循环方案。14.权利要求13的方法，其中所述水溶液包含由热循环方案扩增的靶核酸。全文摘要本发明提供获得反应化合物干组合物的方法，该方法在某一储存时间后重新溶解时维持化合物的生物活性。优选干组合物包含聚合酶并且干组合物对于重新溶解后的PCR扩增是可用的。文档编号C12P19/34GK101768616SQ20091026383公开日2010年7月7日申请日期2009年12月17日优先权日2008年12月19日发明者A·佩塞尼,H·索贝克,T·哈斯林格,T·梅茨勒申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司