专利名称：一种对虾肠道微生物dna的提取方法
技术领域：
本发明属于微生物学和分子生态学领域，具体涉及一种对虾肠道微生物DNA的提 取方法。
背景技术：
肠道微生物的研究日益成为热点，目前对虾肠道微生物多样性的研究多为可培养 细菌的研究，但是自然界中99%以上的微生物是不可培养的，为了克服传统微生物培养技 术的缺陷，更全面深入地了解对虾肠道的微生物群落结构，需要建立研究对虾肠道微生物 组成的分子方法。肠道微生物DNA是进行分子研究的前提。能否获得高的DNA提取率和高 质量的DNA，从而真实地反映微生物群落的实际情况，是保障研究结果是否可靠的关键。如 何获取高质量、较完整的肠道菌群基因组DNA是肠道微生物研究中的关键。
微生物分子生态学是通过分析样品中DNA分子的种类、数量等基因组信息来反映 微生物细胞种类与种群比例等信息的。用这种方法对环境微生物多样性、群落结构及变化 规律进行研究始于20世纪80年代中期，近年来在土壤、海洋、动物肠道等微生态系统的研 究中得到快速发展，已成为最富于活力的生态学科前沿领域之一。由于摆脱了培养方法的 局限性，直接对环境样品中的细菌基因组DNA组成状况进行分析评价，因此建立高效、可靠 的DNA提取方法成为研究者关注的热点。有关从土壤、水体、海洋沉积中提取DNA的方法已 得到较好发展，而对于肠道微生物DNA的提取方法的研究相对较少，不同动物肠道复杂环 境的影响增加了 DNA的提取的难度。按照常规方法进行肠道微生物DNA的提取，很难得到 可用于扩增的DNA样品，一种专门用于肠道微生物DNA提取的方法是进行研究的首要前提。
发明内容
本发明的目的是提供一种通用性好、可靠性高、成本低廉的对虾肠道微生物DNA 的提取方法。 为实现上述目标本发明采用的技术方案为对虾肠道微生物DNA的提取方法
1)将O. 01-0. 05g对虫下肠道在液氮下研磨，并加入0. 8-1. 2mL PBS、 15-25 y L PVPP 匀桨和200-300 ii L 0. 5% Tween-80，均匀后吹打洗脱3-5min ; 2)将洗脱液在200g离心5-10min，取上清菌液待用；沉淀中加0. 8-1. 2mL PBS以 200g离心取上清菌液，将两次离心所得上清菌液合并，合并上清液以300g离心5-10min，取 上清菌液待用； 3)将步骤2)所得上清菌液以1200g离心5-10min，收集上清菌液；
4)将步骤3)所得上清菌液中加100-150 iiL CTAB提取液和10-15 yL溶菌酶， 放入37 。C摇床，振荡30-40min;而后加15-20 iiL 20% (W/C) SDS和10-15 y L蛋白酶K， 60-70。C水浴l-2h ; 5)将水浴后菌液在4。C 3200g离心8-15min，取上清菌液，而后加100-150 iiL CTAB 液和20-25 ii L 20% SDS混匀后，涡旋，6Q-70。C水浴10-15min ;
6)将水浴后菌液以3200g离心8-15min，取上清菌液，而后加入与上述上清菌液等 体积的酚/氯仿混合液，14000g离心10-15min，取上清菌液待用；其中酚/氯仿按25 : 24v 混合； 7)将步骤6)所得上清菌液中加上清菌液体积0. 6-0. 8倍的异丙醇，而后于_20°C 静置l-2h，再以4°C 14000g离心10-15min，所得沉淀待用; 8)将步骤7)所得沉淀中加入600-800 ii L 70%预冷乙醇，14000g离心10-15min， 所得沉淀即为对虫下肠道微生物DNA。 所述所得对虾肠道微生物DNA在超净台下干燥，加50 ii L TE重悬，冻于-8(TC备 用。所述TE溶液成分为100mM Tris，lmM EDTA， 0. 1 % RNase， pH = 8. 0所述步骤1)中PBS 溶液，其成分为2mM KH2P04， 10mM Na2HP04， 137mM NaC1，2. 7mM KC1， pH = 7. 4。所述步骤1) 所述对虾肠道放入无水乙醇中，冻于-8(TC保存待用。所述步骤3)离心后所得上清菌液 用PBS洗涤2-3次。所述步骤4)中CTAB提取液，其成分为100mM Tris-HCl， 100mM EDTA， 100mM磷酸钠，1. 5M NaCl， 1% CTAB，pH = 8. 0 ;所述步骤4)中溶菌酶浓度为50mg/mL ;所述 步骤4)中蛋白酶K浓度为20mg/ml。所述步骤4)水浴时每隔15min将离心所得上清菌液 上下翻转混匀。
本发明的优点 本发明快速并成本低，适合肠道微生物研究中总DNA提取，尤其适合处理大批量 的样品。采用各种细胞破壁方法相结合，裂解完全；不需要核酸吸附材料进一步纯化，可直 接用于PCR扩增的肠道微生物DNA提取方法；有较好的通用性，仅一次提取即得到高质量的 模板DNA，在对16S rRNA基因的扩增中，所有提取的DNA模板均能成功进行扩增。得到与预 计大小相同的1500bp产物，且浓度大、特异性强，测序结果证实了提取的可靠性和真实性。
本发明得到的产物DNA片段大于20Kb，可进行基因扩增和测序。本发明通用性好， 适用于各种甲壳类水产动物肠道微生物DNA提取。
图1为对虾肠道微生物DNA琼脂糖凝胶电泳图谱(其中M为1Kb DNAladder)。
图2为日本对虾16S rDNA基因的浓度梯度PCR结果(其中模板浓度依次为稀释 20倍分别取1 ii L， 2 ii L， 4 ii L， 8 ii L以及原样1 ii L， 2 ii L。 M为DL2000 plus DNA ladder)。
具体实施方式
实施例1 以南美白对虾为例；取对虾肠道放入无水乙醇中，冻于_80°C ;取虾肠0. 02g，液氮 下研磨，加入总量lmL PBS和20 ii L 20 % (体积比)PVPP匀浆，250 y L 0. 5 % (体积比) Tween-80，吹打洗脱3min，所述PBS溶液，其成分为2mM KH2P04， 10mM Na2HP04， 137mM NaCl， 2.7mM KCl，pH=7.4。而后以200g离心6min，取上清菌液待用，沉淀中加lmL PBS再以 200g离心后取上清菌液，将两次上清菌液合并；将合并的上清菌液以300g离心6min，取上 清菌液；所得上清菌液再以1200g离心6min，收集上清菌液，并用PBS洗涤2次；得到的上清 菌液中加130 ii L CTAB提取液和10 ii L溶菌酶，放入37。C摇床，振荡30min ;而后再加15 y L 20% (W/C)SDS和lOii L蛋白酶K，65t:水浴2h ;所述水浴时每隔15min将离心所得上清菌液上下翻转混匀。水浴后以4°C 3200g离心lOmin，取上清菌液；并在上清菌液中加100 y L CTAB液禾口 25 ii L 20% SDS，涡旋，65。C水浴lOmin ;水浴后以3200g离心8min，取上清菌液; 而后在上清菌液中加入等体积的酚/氯仿混合液，再以14000g离心15min，取上清菌液；在 上清菌液中加0. 7倍体积的异丙醇，-2(TC静置lh ;而后以4°C 14000g离心15min，取沉淀； 在沉淀中加入600iiL 70%预冷乙醇，并以14000g离心10min，取沉淀，即为对虾肠道微生 物DNA ;将所得沉淀对虾肠道微生物DNA在超净台下干燥，加50 ii L TE重悬，冻于-8(TC备 用(参见图1中K1所示)。所述TE溶液成分为100mM Tris， lmM EDTA， 0. 1 % RNase， pH = 8. 0
所述CTAB提取液，其成分为100mM Tris-HCl， 100mM EDTA， 100mM磷酸钠，1. 5M NaCl， 1% CTAB， pH = 8. 0 ;所述溶菌酶浓度为50mg/mL ;所述蛋白酶K浓度为20mg/ml。
实施例2 以中国明对虾为例，取对虾肠道放入无水乙醇中，冻于_80°C ;取虾肠0. 05g，液氮 下研磨，加入总量O. 8mL PBS和15iiL 20% (体积比)PVPP匀浆，200 y L 0.5% (体积比) Tween-80，吹打洗脱5min，所述PBS溶液，其成分为2mM KH2P04， 10mM Na2HP04， 137mM NaCl， 2. 7mMKCl，pH = 7. 4。而后以200g离心10min，取上清菌液待用，沉淀中加0. 8mL PBS再以 200g离心后取上清菌液，将两次上清菌液合并；将合并的上清菌液以300g离心10min，取 上清菌液；所得上清菌液再以1200g离心10min，收集上清菌液，并用PBS洗涤3次；得到的 上清菌液中加100 ii L CTAB提取液和15 ii L溶菌酶，放入37。C摇床，振荡40min ;而后再加 20 ii L 20% (W/C) SDS禾P 15 y L蛋白酶K， 70。C水浴lh ;所述水浴时每隔15min将离心所得 上清菌液上下翻转混匀。水浴后以4°C 3200g离心15min，取上清菌液；并在上清菌液中加 150 ii L CTAB液和20ii L 20% SDS，涡旋，67。C水浴15min ;水浴后以3200g离心15min，取 上清菌液；而后在上清菌液中加入与其等体积的酚/氯仿混合液(酚/氯仿按25 : 24v混 合)，再以14000g离心10min，取上清菌液；在上清菌液中加其0. 6倍体积的异丙醇，_20°C 静置2h ;而后以4t: 14000g离心15min，取沉淀；在沉淀中加入800 y L 70%预冷乙醇，并以 14000g离心10min，取沉淀，即为对虾肠道微生物DNA ;将所得沉淀对虾肠道微生物DNA在 超净台下干燥，加50yL TE重悬，冻于-8(TC备用(参见图1中K2所示)。
实施例3 以日本对虾为例，取对虾肠道放入无水乙醇中，冻于-8(TC ;取虾肠0.01g，液氮下 研磨，加入总量1.2mL PBS禾P25iiL 20% (体积比)PVPP匀浆，300 y L 0.5% (体积比) Tween-80，吹打洗脱4min，所述PBS溶液，其成分为2mM KH2P04， 10mM Na2HP04， 137mM NaCl， 2. 7mMKCl， pH = 7. 4。而后以200g离心8min，取上清菌液待用，沉淀中加1. 2mL PBS再以 200g离心后取上清菌液，将两次上清菌液合并；将合并的上清菌液以300g离心8min，取上 清菌液；所得上清菌液再以1200g离心8min，收集上清菌液，并用PBS洗涤2次；得到的上清 菌液中加150 y L CTAB提取液和12 y L溶菌酶，放入37"摇床，振荡35min ;而后再加18 y L 20% (W/C)SDS和13ii L蛋白酶K，60。C水浴1. 5h ;所述水浴时每隔15min将离心所得上清 菌液上下翻转混匀。水浴后以4°C 3200g离8min，取上清菌液；并在上清菌液中加130 y L CTAB液和23iiL 20% SDS，涡旋，60。C水浴12min ;水浴后以3200g离心10min，取上清菌液; 而后在上清菌液中加入等体积的酚/氯仿混合液，再以14000g离心12min，取上清菌液；在 上清菌液中加0. 8倍体积的异丙醇，-20"静置1. 5h ;而后以4°C 14000g离心15min，取沉淀；在沉淀中加入700 ii L 70%预冷乙醇，并以14000g离心10min，取沉淀，即为对虾肠道微 生物DNA ;将所得沉淀对虾肠道微生物DNA在超净台下干燥，加50 ii L TE重悬，冻于_80°C 备用(参见图1中K3所示)。 以上述提取的基因组DNA为模板，扩增16S rDNA基因，PCR扩增引物为 27F(5' -AGAGTTTGATCMTGGCTC-3， ；M = A或C) ， 1387R(5' -GGGCGGWGTGTACAAGGC-3' ;W = A 或T)。PCR反应体系为:无菌双蒸水34. 5iiL，10XPCR缓冲液5iiL，2. 5mmol/L dNTP 4yL， 2. 5iimol/LPCR引物各2ii L，Taq酶O. 5ii L，模板DNA2ii L。PCR反应条件94。C预变性4min ; 94°C lmin， 65°C 45s， 72°C 45s，退火温度每个循环降低1 °C ，当退火温度降至55°C后，再以该 温度扩增25个循环；最后72t:补平10min。 PCR产物用1. 0%的琼脂糖凝胶进行电泳(参 见图2)。 从图2可知，本发明仅一次提取即得到高质量的模板DNA，在对16SrRNA基因的扩 增中，所有提取的DNA模板均能成功进行扩增。得到与预计大小相同的1500bp产物，且浓 度大、特异性强，本发明方法提取的DNA可以应用于分子生态学研究。 从上述结果可以看出，本发明方法不仅可以得到质量较好的DNA，而且此DNA用于
16S rDNA的PCR扩增，得到了特异性较好的产物。此外，本发明方法不需要额外的仪器设
备，因此本发明方法可以成为肠道微生物分子生态学研究中的一种简单易行、高质量、低成
本的肠道微生物DNA提取技术。 SEQUENCE LISTING 〈110〉中国科学院海洋研究所 〈120〉 一种对虾肠道微生物DNA的提取方法 〈130〉 〈160>3 〈170〉Patentln version 3. 1 〈210>1 〈211>18 〈212>DNA 〈213〉人工设计 〈220〉 〈221>CDS 〈222〉 (1) (18) 〈223>M = A或C 〈400〉 1 aga gtt tga tcm tgg etc 18 Arg ValXaa Trp Leu 1 5 〈210>2 〈211>18 〈212>DNA 〈213〉人工设计
〈220〉 〈221>CDS 〈222>(1). . (18) <223〉W = A或T 〈400>2 ggg egg wgt gta caa ggc 18 Gly Arg Xaa Val Gin Gly 1 5 〈210>3 〈211>6 〈212>PRT 〈213〉人工设计 〈220〉 〈22 l>misc—feature 〈222〉 (3). . (3) 〈223>The， Xaa， at location 3 stands for Ser， or Cys. 〈400>3 Gly Arg Xaa Val Gin Gly 1 权利要求
一种对虾肠道微生物DNA的提取方法，其特征在于1)将0.01-0.05g对虾肠道在液氮下研磨，并加入0.8-1.2mL PBS、15-25μL PVPP匀浆和200-300μL 0.5％Tween-80，均匀后吹打洗脱3-5min；2)将洗脱液在200g离心5-10min，取上清菌液待用；沉淀中加0.8-1.2mL PBS以200g离心取上清菌液，将两次离心所得上清菌液合并，合并上清液以300g离心5-10min，取上清菌液待用；3)将步骤2)所得上清菌液以1200g离心5-10min，收集上清菌液；4)将步骤3)所得上清菌液中加100-150μLCTAB提取液和10-15μL溶菌酶，放入37℃摇床，振荡30-40min；而后加15-20μL 20％(W/C)SDS和10-15μL蛋白酶K，60-70℃水浴1-2h；5)将水浴后菌液在4℃ 3200g离心8-15min，取上清菌液，而后加100-150μL CTAB液和20-25μL 20％SDS混匀后，涡旋，60-70℃水浴10-15min；6)将水浴后菌液以3200g离心8-15min，取上清菌液，而后加入与上述上清菌液等体积的酚/氯仿混合液，14000g离心10-15min，取上清菌液待用；7)将步骤6)所得上清菌液中加上清菌液体积0.6-0.8倍的异丙醇，而后于-20℃静置1-2h，再以4℃ 14000g离心10-15min，所得沉淀待用；8)将步骤7)所得沉淀中加入600-800μL 70％预冷乙醇，14000g离心10-15min，所得沉淀即为对虾肠道微生物DNA。
2. 根据权利要求1所述的对虾肠道微生物DNA的提取方法，其特征在于所述所得对 虫下肠道微生物DNA在超净台下干燥，加50 LTE重悬，冻于-S(TC备用。
3. 根据权利要求2所述的对虾肠道微生物DNA的提取方法，其特征在于所述TE溶液 成分为lOOmM Tris， ImM EDTA， 0. 1 % RNase， pH = 8. 0
4. 根据权利要求1所述的对虾肠道微生物DNA的提取方法，其特征在于所述步骤1) 中PBS溶液，其成分为2mM KH2P04， 10mM Na2HP04， 137mM NaCl，2. 7mM KCl， pH = 7. 4。
5. 根据权利要求1所述的对虾肠道微生物DNA的提取方法，其特征在于所述对虾肠 道放入无水乙醇中，冻于-S(TC保存待用。
6. 根据权利要求1所述的对虾肠道微生物DNA的提取方法，其特征在于所述步骤3) 离心后所得上清菌液用PBS洗涤2-3次。
7. 根据权利要求1所述的对虾肠道微生物DNA的提取方法，其特征在于所述步骤 4)中CTAB提取液，其成分为lOOmM Tris-HCl， lOOmM EDTA， lOOmM磷酸钠，1. 5M NaCl，l% CTAB， pH = 8.0 ;所述步骤4)中溶菌酶浓度为50mg/mL ;所述步骤4)中蛋白酶K浓度为 20mg/ml。
8. 根据权利要求1所述的对虾肠道微生物DNA的提取方法，其特征在于所述步骤4) 水浴时每隔15min将离心所得上清菌液上下翻转混匀。
全文摘要
本发明属于微生物学和分子生态学领域，具体涉及一种对虾肠道微生物DNA的提取方法。具体为过程采用液氮研磨，机械力破壁，溶菌酶，SDS裂解液裂解细胞，然后经分离、析出得到DNA沉淀，最后用TE溶解得到质量较好的DNA。本发明得到的产物DNA片段大于20Kb，可进行基因扩增和测序。本发明通用性好，适用于各种甲壳类水产动物肠道微生物DNA提取，仅一次提取即得到高质量的模板DNA，不需要重复实验，所获得的DNA可用于分子生态学、系统进化等研究。
文档编号C12N15/10GK101748118SQ20091026366
公开日2010年6月23日 申请日期2009年12月18日 优先权日2009年12月18日
发明者刘梅, 刘淮德, 王宝杰, 王雷, 蒋克勇 申请人:中国科学院海洋研究所