专利名称：一种能源植物小桐子基因组dna提取方法
技术领域：
本发明涉及基因组DNA提取方法，具体为一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法。
背景技术：
传统的植物基因组DNA提取方法中，多采用的是CTAB(2%)法，但小桐子属于大戟 科，是多乳汁型的植物，即使是在叶片中乳汁含量也很高，含有大量的多糖和多酚成分，传 统的阳离子型去污剂十六烷及三甲基溴化铵(2%CTAB)法是无法有效去除这些杂质以获 得高质量的基因组DNA。
发明内容
本发明正是针对以上技术问题，提供一种能有效去除杂质，优化DNA提取和纯化 操作流程的一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法。本发明的具体技术方案如下一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法，包括以下步骤a)DNA的提取先采集小桐子新鲜的嫩叶片，用蒸馏水清洗干净，将叶片表面水分 擦净；将叶片0. 1-0. 2克在研钵中加液氮磨成粉末，研磨的时候加入约IOmg聚乙烯吡咯 烷酮(PVP-40)以防止氧化；再将研磨的粉末转移到2mL离心管，加入0.5ml 65°C预热的 4父07^抽提缓冲液(4%07^，201111 EDTA,3. 5MNaCl, IOOmM Tris-HCl pH 8.0和2% β-巯 基乙醇)，充分摇勻，再于65°C水浴90分钟，每5分钟缓慢摇动一次，使混合物进一步充分 混勻；待混合物冷至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇(24 1，V V—1)轻柔混勻并抽提， 每次抽提时间为5分钟；以8000转/分钟高速离心8分钟后取上层液体；用氯仿/异戊醇 (24 1,V V—1)重复抽提一次；定量移取上层清液于新的2ml离心管中，再加入5M NaCl (在 混合液中达到终浓度为2M)和0. 6倍体积的异丙醇，室温孵育1小时；移取上清液，加入2 倍体积80%乙醇，并在室温放置10分钟，以使DNA沉淀；以10，000转/分钟高速离心15分 钟；弃上层液体，获得DNA沉淀，并用70 %乙醇漂洗2次后，室温或通气风干DNA，用200uLTE 溶液溶解。b) DNA的纯化在粗DNA的TE溶液中加入20uL 10mg/mL的RNA酶，于37"C处理 30分钟以去除RNA ；加入等体积的Tris饱和酚，混合均勻(注意动作轻柔，避免引起DNA断 裂)，直至形成乳白状混合物；以10，000转/分钟高速离心5分钟；将上清液移至新的2mL 离心管；再用氯仿/异戊醇(24 1, V V—1)抽提两次；移取的上清液用0.6倍体积的异丙 醇(NaCl终浓度为2. 0M)孵育10分钟；移取上清液，加入20uL醋酸钠和1倍体积的80%乙 醇，静置30分钟，以10，000转/分钟高速离心15分钟，收获DNA沉淀；沉淀的DNA用70% 乙醇洗涤2次，风干后用50uL TE溶液溶解。C)于_20°C下保存备用。d)用紫外分光光度计在260nm、280nm和230nm下对DNA进行纯度和浓度检测。
一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法中增加了提取缓冲液CTAB的浓度，达到 了 4%。提取缓冲液的NaCl浓度达到了 3. 5M，优化了能源植物小桐子基因组DNA的提取。一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法中，在DNA的纯化中增加了用Tris饱和 酚单独抽提的步骤，纯化了能源植物小桐子基因组DNA的提取。一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法中，使用的是在2. OM NaCl条件下用 80%乙醇进行DNA的沉淀，且所有步骤可以在室温下操作这样获得小桐子优质的基因组 DNA适于各种分子遗传研究方面应用。本发明的技术效果表现在可提取高质量的能源植物小桐子基因组DNA，并能用 于小桐子的种群遗传学、系统进化、分子标记辅助育种等研究。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进一步说明实施例一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法，包括以下步骤a)DNA的提取先采集小桐子新鲜的嫩叶片，用蒸馏水清洗干净，将叶片表面水分 擦净；将叶片0. 1-0. 2克在研钵中加液氮磨成粉末，研磨的时候加入约IOmg聚乙烯吡咯 烷酮(PVP-40)以防止氧化；再将研磨的粉末转移到2mL离心管，加入0.5ml 65°C预热的 4父07^抽提缓冲液(4%07^，201111 EDTA,3. 5MNaCl, IOOmM Tris-HCl pH 8.0和2% β-巯 基乙醇)，充分摇勻，再于65°C水浴90分钟，每5分钟缓慢摇动一次，使混合物进一步充分 混勻；待混合物冷至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇(24 1, V V—1)轻柔混勻并抽提， 每次抽提时间为5分钟；以8000转/分钟高速离心8分钟后取上层液体；用氯仿/异戊醇 (24 1,V V—1)重复抽提一次；定量移取上层清液于新的2ml离心管中，再加入5M NaCl (在 混合液中达到终浓度为2M)和0. 6倍体积的异丙醇，室温孵育1小时；移取上清液，加入2 倍体积80%乙醇，并在室温放置10分钟，以使DNA沉淀；以10，000转/分钟高速离心15分 钟；弃上层液体，获得DNA沉淀，并用70 %乙醇漂洗2次后，室温或通气风干DNA，用200uLTE 溶液溶解。b) DNA的纯化在粗DNA的TE溶液中加入20uL 10mg/mL的RNA酶，于37"C处理 30分钟以去除RNA ；加入等体积的Tris饱和酚，混合均勻(注意动作轻柔，避免引起DNA断 裂)，直至形成乳白状混合物；以10，000转/分钟高速离心5分钟；将上清液移至新的2mL 离心管；再用氯仿/异戊醇(24 1, V V—1)抽提两次；移取的上清液用0.6倍体积的异丙 醇(NaCl终浓度为2. 0M)孵育10分钟；移取上清液，加入20uL醋酸钠和1倍体积的80%乙 醇，静置30分钟，以10，000转/分钟高速离心15分钟，收获DNA沉淀；沉淀的DNA用70% 乙醇洗涤2次，风干后用50uL TE溶液溶解。C)于_20°C下保存备用。d)用紫外分光光度计在260nm、280nm和230nm下对DNA进行纯度和浓度检测。一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法中增加了提取缓冲液CTAB的浓度，达到 了 4%。提取缓冲液的NaCl浓度达到了 3. 5M，优化了能源植物小桐子基因组DNA的提取。一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法中，在DNA的纯化中增加了用Tris饱和 酚单独抽提的步骤，纯化了能源植物小桐子基因组DNA的提取。
一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法中，使用的是在2. OM NaCl条件下用 80%乙醇进行DNA的沉淀，且所有步骤可以在室温下操作这样获得小桐子优质的基因组 DNA适于各种分子遗传研究方面应用。运用一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法可提取高质量的能源植物小桐子 基因组DNA，并能用于小桐子的种群遗传学、系统进化、分子标记辅助育种等研究。
权利要求
一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法，其特征在于包括以下步骤a)DNA的提取先采集小桐子新鲜的嫩叶片，用蒸馏水清洗干净，将叶片表面水分擦净；将叶片0.1 0.2克在研钵中加液氮磨成粉末，研磨的时候加入约10mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP 40)；再将研磨的粉末转移到2mL离心管，加入0.5ml 65℃预热的4×CTAB抽提缓冲液(4％CTAB，20mM EDTA，3.5M NaCl，100mM Tris HCl pH 8.0和2％β 巯基乙醇)，充分摇匀，再于65℃水浴90分钟，每5分钟缓慢摇动一次；待混合物冷至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1，V V 1)轻柔混匀并抽提，每次抽提时间为5分钟；以8000转/分钟高速离心8分钟后取上层液体；用氯仿/异戊醇(24∶1，V V 1)重复抽提一次；定量移取上层清液于新的2ml离心管中，再加入5M NaCl(在混合液中达到终浓度为2M)和0.6倍体积的异丙醇，室温孵育1小时；移取上清液，加入2倍体积80％乙醇，并在室温放置10分钟，以使DNA沉淀；以10,000转/分钟高速离心15分钟；弃上层液体，获得DNA沉淀，并用70％乙醇漂洗2次后，室温或通气风干DNA，用200uLTE溶液溶解。b)DNA的纯化在粗DNA的TE溶液中加入20uL 10mg/mL的RNA酶，于37℃处理30分钟以去除RNA；加入等体积的Tris饱和酚，混合均匀直至形成乳白状混合物；以10,000转/分钟高速离心5分钟；将上清液移至新的2mL离心管；再用氯仿/异戊醇(24∶1，V V 1)抽提两次；移取的上清液用0.6倍体积的异丙醇(NaCl终浓度为2.0M)孵育10分钟；移取上清液，加入20uL醋酸钠和1倍体积的80％乙醇，静置30分钟，以10,000转/分钟高速离心15分钟，收获DNA沉淀；沉淀的DNA用70％乙醇洗涤2次，风干后用50uL TE溶液溶解。c)于 20℃下保存备用。d)用紫外分光光度计在260nm、280nm和230nm下对DNA进行纯度和浓度检测。
全文摘要
本发明涉及基因组DNA提取方法，具体为一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法。一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法，其特征在于包括以下步骤a)DNA的提取；b)DNA的纯化；c)于-20℃下保存备用；d)用紫外分光光度计在260nm、280nm和230nm下对DNA进行纯度和浓度检测。通过一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法可提取高质量的能源植物小桐子基因组DNA，并能用于小桐子的种群遗传学、系统进化、分子标记辅助育种等研究。
文档编号C12N15/10GK101985618SQ200910263600
公开日2011年3月16日 申请日期2009年12月28日 优先权日2009年12月28日
发明者尹春英, 焦娟玉, 胡尚连, 阮莉萍, 陈珂 申请人:陈珂