包含硫酯酶功能域的腊梅基因及其抗旱基因工程应用的利记博彩app

专利名称：包含硫酯酶功能域的腊梅基因及其抗旱基因工程应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属分子生物学与基因工程领域，具体涉及含硫酯酶功能域的腊梅基因克隆 及其应用。
背景技术：
在植物体中，质体的脂肪酸合成包括原核途径与真核途径。质体中的脂肪酸从头 合成能被质体酰基转移酶终止，将酰基基团从acyl-ACP转至质体的甘油脂类中，这为原核 途径；或者被acyl-ACP硫酯酶，将acyl-ACP水解，释放游离脂肪酸和ACP，然后将脂肪酸输 出质体，被辅酶A重新酯化送到辅酶A池中。作为内质网甘油脂类的源出，这是真核途径。 硫酯酶属酯酶家族酯酶，是水解酶的一种。可以将acyl-ACP水解，释放游离脂肪酸和ACP。脂肪酸的生物合成主要发生在质体的基质中，由乙酰辅酶A经一系列反应，生成 不同链长(C8 C18)的脂肪酰ACP。在质体中发生的最后一步反应，是硫酯酶将游离的脂 肪酸从ACP上释放出来，所以在脂肪酸从头合成中，acyl-ACP硫酯酶对于碳链的终止扮演 重要角色。根据氨基酸的序列比较和酶底物的特异性不同，植物中分为两种基本类型的酰 基-ACP硫酯酶。一类命名为FatA，对于18 P9-ACP活性最高，所以推测FatA决定着植物体 内18:1输出到质体外的水平。第二类以16:0-ACP硫酯酶为代表，对较短链的饱和酰基-ACP 活性最高。FatB 对底物的催化活性为 16:0-ACP > 18:”9_ACP > 18:0-ACP > 14:0-ACP0 因为酰基ACP硫酯酶具有底物特异性，所以它的活性影响着各种甘油脂类中脂肪酸成分之 间的比率，是决定脂肪酸的链长和饱和脂肪酸水平的主要因素。最近研究发现FatB基因在植物体内是古老的，存在植物的各器官中，在花中表达 量最高。推测FatA和FatB支系的分离比樟树植物的分离更早，估计分离约在1. 5_3. 0亿 年前，FatA是由FatB衍生的。中链的硫酯酶是在被子植物进化过程中，由16:0硫酯酶经 过几次进化过程演变而来的。硫酯酶具有酰基转移酶的功能域，可以将酰基从酰基-酰基载体蛋白上分离出来。脂酰-ACP硫酯酶催化FAS循环的终止，已从多种植物中纯化，编码基因也已从红 花、油菜和拟南芥菜等多种植物中克隆。不同的脂酰-ACP需要不同的酶，如红花中克隆的 硫酯酶对油酰-ACP特异，而拟南芥中克隆的硫酯酶对14 18碳饱和底物具特异性。酰基ACP硫酯酶成为脂类生物合成酶系中第一个经改造，并转入转基因植物以产 生经济产品的酶。生物技术公司Calgene的工作首先证明了存在中链酰基ACP硫酯酶，并 提供了生化证据。然后从加州月桂中克隆了 12:0-ACP硫酯酶。将编码单个中链酰基ACP 硫酯酶的基因转入植物可以明显改变种子油中所储存的脂肪酸的长度。除了月桂中的特 异于月桂酸的酰基ACP硫酯酶以外，特异于其他链长的硫酯酶也已从不同植物中鉴定出来 了。其他生产富含别种中链脂肪酸，如豆蔻酸和葵酸的转基因植物也已得到。在研究拟南芥突变体(Fatb-ko)时，发现突变体的生长速率低于野生型拟南芥，
3生长4周以后，突变体鲜重与野生型植物相比较减少50 %。而且突变体的种子发育能力 低，形态学发生改变。在突变体中，在不同的组织中，饱和脂肪酸总的数量比野生型减少 40% -50%，这种减少仅发生在细胞溶质中的脂肪酸组分、叶和茎表面的蜡层、种子中的三 酰基甘油中，而且发现突变体在植株生长和种子萌发都受到影响。腊梅是一种众所周知的多抗植物，其所具有的极强的抗低温、抗干旱、抗病虫能 力，这与腊梅的叶片表面含有大量的蜡质层有关，而蜡质层是由长链脂肪酸构成。在众多的 研究中，还没有看到有关含硫酯酶功能域的腊梅基因在植物的抗逆生理功能方面的相关报 道。

发明内容
(1)提供一种DNA序列，其编码一种含硫酯酶功能域的腊梅基因，命名为 CpAcylTase ； (2)提供一种利用基因工程方法得到CpAcyITase编码的蛋白；(3)提供 CpAcylTase基因在植物抗旱方面的应用。本发明提供了 CpAcylTase基因，它具有如序列表中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序 列。从腊梅花冠cDNA文库中，利用PCR方法筛选克隆出CpAcylTase基因利用RNAiso Reagent (购自大连Takara公司)提取腊梅花冠总RNA，按照SMARTTM cDNA Library ConstructionKit合成腊梅花冠cDNA文库，随机挑取1000个文库克隆测序和生物信息学 分析，获得腊梅花冠抗性ESTs序列。从腊梅花ESTs序列中，发现编码CpAcylTase的cDNA 序列，根据此序列设计上下游引物，并以腊梅花cDNA文库为模板进行PCR扩增，克隆出 CpAcylTase的全长基因。CpAcylTase的基因由1110个碱基组成，含有一个完整的开放阅读框架，为序列表 中的SEQ ID N0:1序列。开放读码框的起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。本发明还提供了涉及CpAcylTase基因编码的蛋白，其具有序列表中SEQ ID NO 2 中所示的氨基酸序列，是含有369个氨基酸残基，其理论分子量大小为41. 7kDa，预测等电 点为7. 72。根据PSORT分析CpAcylTase蛋白前18个左右氨基酸为信号肽，该蛋白为稳定 蛋白。重组原核表达载体含有CpAcylTase基因，重组原核表达载体转化的宿主细胞为 大肠杆菌。重组植物表达载体含有CpAcylTase基因，重组植物表达载体转化的宿主细胞为 根瘤农杆菌，重组植物表达载体转化的转基因宿主细胞为植物细胞。如实施例二所述，还可利用基因工程的方法，在高效大肠杆菌表达系统中表达出 具有生物活性的CpAcylTase蛋白。关于CpAcylTase基因在植物抗旱方面的应用CpAcylTase基因在培育抗逆性植物上的应用，包括用构建的表达载体转化植物细 胞，将转化的植物细胞培育成植株。将CpAcylTase基因编码区克隆入植物表达载体pETV7 中，通过农杆菌侵染法将其导入烟草叶片，获得过量表达的烟草株系，来提高转CpAcylTase 基因烟草(简称转基因烟草)抗旱的能力。在对野生烟草与转基因烟草进行保水性实验发现，转CpAcylTase基因烟草可以极大地降低水分的损失，其气孔关闭后的失水率相比野生烟草降低了 30%。通过干旱胁迫，发现转基因烟草的抗干旱能力明显高于野生烟草，在干旱胁迫10 天后，野生型烟草严重萎蔫达到100 %，而转基因烟草严重萎蔫还不到2 %，说明转基因烟 草相对野生烟草表现出了较强的抗干旱胁迫损伤的能力。本发明的有益效果在于提供了一种CpAcylTase基因及蛋白，构建了植物表达载 体，并获得转基因植物，CpAcylTase基因能提高转基因植物的抗旱能力。


图1为以腊梅花冠cDNA为模板，PCR扩增电泳图其中M:marker 自上到下大小为1850bp、1470bp、1090bp、740bp、420bp、280bp1 目的条带图2为SDS-PAGE原核表达全蛋白电泳图其中M:Marker,分别为 66、43、31 (KDa)1、2、3 含有重组克隆质粒pET_28a: CpAcylTase的BL21宿主菌全蛋白CK 含有空载体质粒pET_28a的BL21宿主菌全蛋白图3为CpAcylTase植物表达载体的构建过程示意4为转基因烟草阳性苗RT-PCR鉴定电泳图其中:M :marker 自上到下大小为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bpLine_l、 Line-2、Line_3、Line-4 转基因烟草阳性苗RT-PCR ff 野生型烟草RT-PCR图5为干旱胁迫对转基因烟草与野生烟草的影响比较示意图其中W 野生烟草 T 转基因烟草图6为野生烟草、转基因烟草保水性分析比较示意图
具体实施例方式实施例一克隆CpAcylTase基因1.提取 RNA 取500mg腊梅花冠用RNAiso Reagent提取腊梅花总RNA。2.构建 cDNA 文库取总RNA，按照 SMARTTM cDNA Library Construction Kit 合成腊梅花 cDNA文库， 随机挑取1000个文库克隆测序和生物信息学分析，获得腊梅花抗性ESTs序列。3.克隆CpAcylTase基因片段的克隆根据腊梅花ESTs序列中找出的编码CpAcylTase的cDNA序列，设计上下游引物， 并以腊梅花cDNA文库为模板进行PCR扩增。特异性引物如下CpAcylTase-Pl 5 ‘ -CCC AAGCTT CTAGTAATGAGCATGATTGCC- ‘ 3，斜体碱基为 HindHI酶切位点；CpAcylTase-P2 5 ‘ -CCG CTCGAG CTAATGCGATATGGAATTAGGGT- ‘ 3，斜体碱基为 Xhol酶切位点。克隆PCR反应条件为94°C预变性3min ；94°C变性50sec ；54°C退火30sec ；72°C延伸lmin，30个循环；72°C延伸lOmin。扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测，在IOOObp位置 上有一特异性的条带(图1)。进而按常规方法将片段克隆到PMD18-T Vector (购白大连 Takara公司)中，并经上海生物工程公司进行测序。CpAcylTase基因的序列分析经测序该基因cDNA序列开放阅读框包含1110bp，含有一个完整的开放阅读框架，为序列表中的SEQ ID N0:1序列。编码369个氨基酸，具有序列表中SEQ ID NO :2中所示 的氨基酸序列，分子量大小为41. 7kDa，预测等电点为7. 72。结果表明获得了全长基因的 cDNA序列。禾Ij 用 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi)对该基 因编码的氨基酸进行保守区域分析，结果表明该蛋白属于acyl-ACP硫酯酶。在NCBI网站上对CpAcylTase基因编码的氨基酸序列进行BLAST，与已确定功 能的其他物种氨基酸序列进行进化分析和同源性分析=CpAcylTase与肉豆蔻acyl-ACP thioesterase编码的氨基酸进化距离最近，与拟南芥同种氨基酸序列同源性为48%。根据PSORT分析CpAcylTase前18个左右氨基酸为信号肽，是稳定蛋白。用SOPMA 对CpAcylTase进行二级结构预测，发现含有39. 84%的α螺旋(h)，5.42% β转角(t)， 14. 09%的延伸链(e)，40. 65%的随机卷曲(C)。实施例二 =CpAcylTase在大肠杆菌中的高效表达1.原核表达载体的构建为了表明CpAcylTase基因的编码功能，将CpAcylTase基因克隆到pET_28a(+)的 HindIII和BamH I位点之间，并转化大肠杆菌BL21，获得高效表达。设计并合成一对特异性引物5 ‘ -CGC GGATCC CTAGTAATGAGCATGATT-‘ 3 (斜体碱基为 BamHI 的酶切位点)5 ‘ -CCC AAGCTT GTAGTTCCTTATGCGATA-‘ 3 (斜体碱基为 Hindi11 的酶切位点)按分子克隆常规实验程序，用PCR的方法扩增出两端带有特定酶切位点的基因编 码序列，将基因和载体PMD18-T连接，验证正确。取pMD18 CpAcylTase质粒和pET_28a (+) 质粒(购于上海鼎国生物公司)分别用BamHI、HindIII双酶切、再连接，将连接产物转化 大肠杆菌BL21菌株(购于凯基生物公司)中，并用含lOOug/ml卡那霉素的LB平板筛选 重组子。经质粒酶切鉴定和PCR鉴定后，将筛出的连接正确的重组子进行测序，证明插入 载体的DNA序列的阅读框架是正确的。把构建成带有CpAcylTase基因的表达载体，命名 pET-28a: CpAcylTase，用于诱导表达分析。2.原核表达将含有pET-28a::CpAcylTase重组子的菌株，接种于LB培养基(1L 蛋白胨10g， 酵母提取物5g，NaCLlO克)，37°C培养至菌液OD6tltl = 0. 4-0. 6。将BL21重组表达菌研磨及 超声破碎，我们得到了含有重组克隆质粒pET-28a: CpAcylTase的BL21宿主菌粗酶液。进 行12% SDS-PAGE电泳检测，从图2中可以看出，CpAcylTase基因在BL21中高效表达。实施例三含有CpAcylTase基因的植物表达载体的构建，及转基因烟草的制备将本发明的CpAcylTase基因编码区克隆入植物表达载体pTEV7(吉林大学植物分 子生物学研究室保存，殷君华，腊梅花水通道蛋白CpTIP cDNA的克隆及功能研究，中国知网 收录，2008.)中，通过农杆菌侵染法将其导入烟草中，制作过量表达的烟草株系，来提高烟草抗旱能力。1.植物表达载体的构建设计一对引物，分别引入HindIII和XhoI的酶切位点，CpAcylTase-Pl 5 ‘ -CCC AAGCTT CTAGTAATGAGCATGATTGCC- ‘ 3，斜体碱基为 HindIII酶切位点；CpAcylTase-P2 5 ‘ -CCG CTCGAG CTAATGCGATATGGAATTAGGGT- ‘ 3，斜体碱基为 XhoI酶切位点。按分子克隆常规实验程序，用PCR的方法扩增出目的片段，将片段克隆到pMDIS-T Vector,测序。将经测序鉴定正确的阳性重组质粒pMD18 CpAcylTase和植物表达载 体PETV7进行HindIII和XhoI双酶切。并将酶切产物回收、连接，构建成目的载体 PTEV7: CpAcylTase (构建过程见图3)并转化到根瘤农杆菌EHA105中。2.利用叶盘侵染法转化烟草(1)挑取经鉴定的农杆菌接种到液体培养基中，28°C、250rpm振荡培养约48h，至 对数生长后期，离心、弃上清，菌体用1/2MS液体培养液(1/2XMS大量元素，IXMS微量元 素，1 XMS维生素，1 X铁盐，pH5. 7-5. 8)悬浮稀释至0D600 = 0. 5左右；(2)取无菌烟草叶片，去掉主叶脉，将其剪成小块；(3)将剪好的烟草叶片置于MS分化培养基中(1 XMS大量元素，IXMS微量元素， 1 XMS 维生素，1 X 铁盐，蔗糖 30g/L, 6-BA 3mg/L, NAA 0. 2mg/L,琼脂粉 8g/L，ρΗ5· 7-5. 8)， 28°C、光照时间16h/天、光照强度2000LX，培养2天；(4)将培养2天的烟草叶片浸入第一步所述刚准备好的菌液中lOmin，在无菌滤纸 上吸干菌液，将叶片置于MS培养基上，28°C暗培养2天；(5)共培养后的叶片在其周围出现微菌落后先用含头孢霉素300mg/L的无菌水洗 涤3次，再用含头孢霉素300mg/L的MS培养液洗1次，然后用无菌滤纸吸干，转入含有卡那 霉素的MS筛选培养基上，恒温培养(条件同预培养)，每15天更换一次培养基；(6)待芽长至Icm左右时，切下并移入生根培养基中，促其生根。待根系发育后，对 转化苗进行编号，并移入盛有无菌土的花盆中，用塑料薄膜保湿2天，室温常规管理。以RT-PCR方法验证转基因烟草1.用常规方法从导入了 CpAcylTase基因的烟草叶片中提取总RNA，以野生烟草为 阴性对照，结果表明28S和18S条带型整齐，且28S条带明显亮于18S条带，说明总RNA完 整性很好，没有发生降解，可以用作进一步的反转录鉴定。将提取的转CpAcylTase基因的 烟草RNA以CpAcylTase-P2为引物经反转录得到单链cDNA。2.再以 cDNA 为模板，然后以 CpAcylTase-Pl、CpAcylTase_P2 为引物进行 PCR 扩 增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在相应位置上有一特异性的条带，与CpAcylTase 基因部分片段大小一致，而在野生型植株阴性对照的泳道上没有该条带，说明检测的转基 因植株为阳性。这初步证明了 CpAcylTase基因已经整合入烟草基因组中，而且在RNA水平 上得到了表达(如图4)。实施例四干旱胁迫对转基因烟草与野生烟草的影响选取饱满野生和转基因烟草种子播撒在土中(蛭石草木炭为1 1)中25°C、光 照时间16h/天、光照强度2000LX。两周后，选择生长一致的小苗，移栽到盆中。恢复生长2周后，选取生长状况一致的健康植株对其共同进行停水干旱胁迫处理，8天后发现野生型烟 草萎蔫达到100%时，转基因烟草却没有出现萎蔫情况(如图5)。实施例五离体叶片的失水速率测定取同等培养条件下大小相近，质量相同的野生烟草及转基因烟草叶片，称取鲜重 后放入28°C培养箱中。为使叶片气孔完全关闭，在150min之后开始测量水分减少情况，此 后每隔lh称取叶片的质量共测定5次，计算两种叶片的失水率(如图6)失水率=(鲜重_失水后重量)/鲜重结果表明气孔关闭后转基因烟草单位时间内失水率相对野生烟草降低了 30%。序列表SEQ ID NO. 1 的序列⑴序列特征(A)长度1110bp ；⑶类型核苷酸；(C)链性单链。(ii)分子类型核苷酸
0089](iii)序列描述:SEQ ID NO. 10090]1ATGAGCATGATTGCCAGCAGTGTAGGTGCTGCTTTTTTTCCAGCCCAAGGCATCATCAAG0091]61TCCAAGCCGGCTGGGTTGCACGTGAMGCAAATGGCCGAGCCTCCCCCAGCATTGACGGT0092]121CCGAAGGTGACCGTCGGCCTAGAGGGCACGAACGCCTCGTCCACMGGAAATTCATGAAC0093]181TTGTTGCCTGACTGGAGCATGCTACTTGCCGCCTTTACAACCATCTTTGAGAAGCAGAAG0094]241GTTGTGGTCGACCAGTTTCGATTCGGCCATGACAGGCTGGTTTACAGTGAGAATTTCACA0095]301ATAAGGTCATATGAGATAGGTGCTGATCAGACGGCATCAATAGAGACAGTGATGAATCTT0096]361TTGCAGGAGACTGGAATCAACTGTTTTAGGAGCCTTGGGCTTTTACTTGATGGTTTTGAT0097]421TCAACAGTGGAGATGTGTAAGAGAGATCTTATATGGGTTGTGACTCGTATGCAGGTTATC0098]481GTTGATCACTATCCTTCTAGGGGTGATACTGTTGAAGTAGAGACACACTGCGGTGCATAT0099]541GGAAAGCATGGCCACCGCCGAGAATGGCTAATCCGGAACAGCAAMCTGGTCAMTTCTT0100]601ACACGAGCTACCAGTGTTCTGGTGGTGATGMTAAGCGGACGAGGAGATTGTCCATATTA0101]661CCTGATGAAGTTAGAAGGGAATTAGAGCCTTATTTCATGGAGAATCTTAGTGTGATGAAG0102]721GACCAAGGCAGAAAACTTCCCAAGGTCGATCATAGCATTGCAGATTACGTCCGACAAGGG0103]781TTGACTTGTCMTGGAGTGATTTGGATATCAATCAGCATGTAAACCATATCAAATACGTT0104]841AMTGGATTTTTGAGAGTGTTCCGGTTTCTATCTTAGAAAGTCACGAGATTTCCAGCATG0105]901ACTCTTGAATTTAAGAGAGAGTGCGGCMGGATAGCATGTTGCAGTCTCTGACTGCCGTC0106]961GTGTCCGGTCGCAGGGTTGACGGATCAGTAGAAGMACTGACGTTGAATTTCAGCACTTG0107]1021CTCCAGCTTGMGATGGGCCTGAGGTCATGAGGGGAACAACAAAGTGGAGACCCAAGAGT0108]1081ACCCTGTTCCCTAATTCCATATCGCATTAGSEQIDN0. 2 的序列(i)序列特征(A)长度369个氨基酸；⑶类型氨基酸；(C)链性单链。(ii)分子类型多肽(iii)序列描述:SEQ ID NO. 21 MSMIASSVGA AFFPAQGIIK SKPAGLHVKA NGRASPSIDG41 PKVTVGLEGT NASSTRKFMN LLPDWSMLLA AFTTIFEKQK81 VVVDQFRFGH DRLVYSENFT IRSYEIGADQ TASIETVMNL
121
161
201
241
281
321
361
LQETGINCFR SLGLLLDGFD STVEMCKRDL IWVVTRMQVI VDHYPSRGDT VEVETHCGAY GKHGHRREWL IRNSKTGQIL TRATSVLVVM NKRTRRLSIL PDEVRRELEP YFMENLSVMK DQGRKLPKVD HSIADYVRQG LTCQWSDLDI NQHVNHIKYV KWIFESVPVS ILESHEISSM TLEFKRECGK DSMLQSLTAV VSGRRVDGSV EETDVEFQHL LQLEDGPEVM RGTTKWRPKS TLFPNSISH*
权利要求
一种包含硫酯酶功能域的腊梅基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.一种蛋白，其特征在于它是由权利要求1所述的包含硫酯酶功能域的腊梅基因序列 编码、具有序列表中SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
3.—种重组原核表达载体，其特征在于含有如权利要求1所述的包含硫酯酶功能域的 腊梅基因。
4.一种重组植物表达载体，其特征在于含有如权利要求1所述的包含硫酯酶功能域的 腊梅基因。
5.一种用权利要求3的重组原核表达载体转化的宿主细胞为大肠杆菌。
6.一种用权利要求4的重组植物表达载体转化的宿主细胞为根瘤农杆菌。
7.一种用权利要求4的重组植物表达载体转化的转基因宿主细胞为植物细胞。
8.权利要求1所述的包含硫酯酶功能域的腊梅基因，在植物抗旱方面的应用。
全文摘要
包含硫酯酶功能域的腊梅基因及其抗旱基因工程应用属分子生物学与基因工程领域，本发明提供了包含硫酯酶功能域的腊梅基因和蛋白，同时提供了基因相应的表达载体和宿主细胞，本发明的有益效果在于包含硫酯酶功能域的腊梅基因的应用，能提高转基因植物的抗旱能力。
文档编号C12N15/70GK101870983SQ200910254000
公开日2010年10月27日 申请日期2009年12月9日 优先权日2009年12月9日
发明者于慧美, 刘金亮, 张世宏, 张莉弘, 殷君华, 潘洪玉, 胡军, 阳晓红 申请人:吉林大学