狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白第333位氨基酸突变株的利记博彩app

专利名称：狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白第333位氨基酸突变株的利记博彩app
技术领域：
本发明属于重组病毒疫苗领域。本发明涉及一种突变狂犬病病毒Flury-LEP弱毒 疫苗株，其表达的狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位氨基酸由精氨酸R突变为谷 氨酰胺Q。更具体地，本发明涉及狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位氨基酸突变株 rLEP333Q。本发明还涉及生产所述突变株的方法，以及所述突变株的应用。
背景技术：
狂犬病即疯狗症，又名恐水症，是由狂犬病病毒引起的、侵害中枢神经系统的急性 病毒性人兽共患性传染病。几乎所有的温血动物都对狂犬病病毒易感。犬类动物在传播人 狂犬病过程中起主要作用，是本病的主要宿主之一。此外，猫、浣熊、狐狸和蝙蝠等也会患病 并传播病毒。狂犬病传播途径主要是通过动物咬伤后，唾液中的狂犬病病毒经破损皮肤侵 入机体。此外，还可通过消化道、呼吸道以及动物密切接触等途径传播。狂犬病是迄今为止 人类病死率最高的急性传染病，一旦发病，病死率可高达100%。狂犬病是一种很重要的人 畜共患病，在世界范围内每年约有60，000余人死于狂犬病[1]，引起严重的公共健康问题， 主要分布在亚洲、非洲和拉丁美洲等发展中国家。中国也是受狂犬病危害最为严重的国家 之一。狂犬病的预防主要通过疫苗免疫的方式进行。狂犬病疫苗种类繁多，效果不一。 自从1940年，Koprowski等人从病死女孩脑内分离到狂犬病病毒Flury株，经1日龄雏鸡 脑内、鸡胚卵黄囊传代后，再经鸡胚传代178代以上，无论神经内、外接种都对动物丧失致 病力，但对于新生乳鼠和猴在脑内接种时仍具有残留毒力。在鸡胚传代68代以前的称为 “LEP” (鸡胚低代株)，高于136代的称为“HEP” (鸡胚高代株)。Flury-LEP株具有优良的 免疫原性，被广泛用作人或动物的狂犬病灭活疫苗种毒株，还被包括中国在内的许多国家 用作预防犬狂犬病的弱毒疫苗。科研工作者一直不间断地对狂犬病疫苗进行改进和创新， 取得了丰硕的成果，但仍然存在很多不足。我国目前生产ERA株和Flury株活疫苗。狂犬 病弱毒疫苗在体内的增殖过程与病原感染机体的过程相似，能诱导产生细胞免疫和体液免 疫，且产生的免疫反应较强，持续时间较长，在我国狂犬病防治工作中曾起到一定的积极作 用。但有的疫苗毒株本身对乳鼠致病，对怀孕动物、免疫机能不全的动物和幼小动物使用不 安全，而且存在毒力回升、返祖的潜在危险。因此，存在获得更加安全的减毒活病毒疫苗株 的需要。狂犬病病毒属于弹状病毒科、狂犬病毒属，为不分节段单股负链RNA病毒，其基因 组长约12kb，共编码5个结构蛋白核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、囊膜糖蛋白(G) 和RNA聚合酶(L)。囊膜糖蛋白G(简称糖蛋白或G蛋白)是狂犬病病毒最主要的致病因 子[2’3]。G蛋白主要功能包括，与细胞表面受体相互作用以介导病毒快速侵入细胞[4’5’6]，与 RNA-NP-M复合物相互作用使病毒出芽[7]。G蛋白的表达水平必须控制在一定的水平以防止 对感染神经细胞的功能性破坏[3]。多项研究表明G蛋白第333位为影响病毒毒力的关键位
占[2,8,9,10] W、O
Flury-LEP虽然已高度致弱，对狗没有致病性，但是脑内接种小鼠仍致死，且G蛋 白第333位仍是R。本研究采用负链RNA病毒反向遗传(reverse genetics)操作技术，对 Flury-LEP G蛋白第333位R进行人工突变，预期获得进一步致弱的狂犬病弱毒疫苗株。

发明内容
本发明属于重组病毒疫苗领域。本发明涉及一种突变狂犬病病毒Flury-LEP弱毒 疫苗株，具体地，所述突变弱毒疫苗株表达的狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位氨 基酸由精氨酸R突变为谷氨酰胺Q。更具体地，本发明涉及狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白 (G)第333位氨基酸突变株rLEP333Q，其中所述狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位 氨基酸由精氨酸R突变为谷氨酰胺Q。本发明还涉及生产所述突变株的方法，以及所述突变 株的应用。在第一方面中，本发明构建了 Flury-LEP全长基因组cDNA (SEQ IDN0:1)克隆 pCI-LEP 和 cDNA 片段克隆 pCI_F2，pCI_F3，pCI_F31，pBlue-Fl，pBlue_F2 和 pBlue_F3，以 及转录辅助质粒系统pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG_L，所述转录辅助质粒分别包括编码狂犬病 病毒Flury-LEP核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)及聚合酶蛋白(L)基因的开放阅读框架(ORF)的 cDNA序列。在第二方面中，本发明利用第一方面构建的Flury-LEP全长基因组cDNA片段克隆 pBlue-F2和pCI-F31，设计带有糖蛋白(G)第333氨基酸位点突变(R333Q)的PCR引物，成 功构建了 Flury-LEP G333突变全长基因组cDNA重组载体pCI_LEP333Q。在所述重组载体 PCI-LEP333Q中，编码狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)的核苷酸包含碱基突变，使得糖蛋白 (G)第333位氨基酸由精氨酸R突变为谷氨酰胺Q。然而，本领域技术人员应该理解，用于构建狂犬病病毒Flury-LEP全长基因组 cDNA重组载体以及构建Flury-LEP G333突变全长基因组cDNA重组载体的质粒包括，但不 限于，PCI，只要携带CMV启动子的质粒都可以用于本发明，例如，pCAGG等。利用携带CMV 启动子的质粒的优点在于，携带CMV启动子的质粒利用细胞内的RNA聚合酶II进行转录， 而无需传统的T7聚合酶系统，因此理论上可以在任何真核细胞系中拯救病毒。另外，本领域技术人员还应该理解，本发明第一方面和第二方面所述的构建狂犬 病病毒Flury-LEP全长基因组cDNA突变重组载体的策略可以适用于构建在Flury-LEP全 长基因组cDNA中引入任何突变的重组载体。在第三方面中，本发明利用构建的Flury-LEP G333突变全长基因组cDNA重组载 体PCI-LEP333Q,和辅助质粒系统pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG_L，在293T细胞中拯救了突变的 重组病毒株rLEP333Q。在第四方面中，本发明鉴定了突变株rLEP333Q的生物学活性。本发明人检测了野 生株LEP(WtLEP)和突变株rLEP333Q在神经元细胞NA和非神经元细胞BHK-21上的生长动 力学曲线，如图3所示，rLEP333Q在两种细胞上的生长性能与wtLEP没有显著差异，这表明糖 蛋白(G)第333位的精氨酸R突变为谷氨酰胺Q后并不影响其生长特性。此外，本发明人 还检测了 wtLEP、突变株rLEP333Q和无毒株HEP的嗜神经指数，结果显示在表4中，wtLEP的 嗜神经指数为0. 8，而rLEP333Q的嗜神经指数已下降与无毒株Flury-HEP —样接近于零。最 后，本发明人还检测了 wtLEP、rLEP333Q以及HEP对小鼠的致病性，测定了 wtLEP和rLEP333Q的LD5tl，分别为8. 8个FFU和80个FFU。结果表明，rLEP333Q突变病毒株脑内接种小鼠感染 仍致死，但与wtLEP相比，丧失了体外嗜神经性，致病性略微下降。这表明本发明的狂犬病 病毒突变株rLEP333Q作为更安全的活毒疫苗应用的潜力。在第五方面中，本发明提供上述生产突变狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株的方 法，所述方法包括(1)构建转录质粒，所述转录质粒包括在其中引入狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白 (G)第333位氨基酸突变的狂犬病病毒Flury-LEP全长基因组cDNA序列；(2)构建一个或多个转录辅助质粒，所述辅助质粒包括编码狂犬病病毒 Flury-LEP核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)及聚合酶蛋白(L)基因的开放阅读框架(ORF)的cDNA 序列；(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染允许狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗 复制的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；(4)收获上清液，鉴定突变病毒株。在一个优选实施方案中，所述转录质粒为pCI-LEP333Q，在所述转录质粒中，编码狂 犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)的核苷酸包含碱基突变，使得糖蛋白(G)第333位氨基酸 由精氨酸R突变为谷氨酰胺Q。所述转录辅助质粒是pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L。所述 宿主细胞是真核细胞。在第六方面中，本发明提供狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位氨基酸突 变病毒株rLEP333Q的应用，所述突变株rLEP333Q可以用作高安全性的活毒疫苗，其可以单独 或与其它疫苗一起使用，还可以作为口服疫苗，对野生动物进行投食免疫，也可以在灭活后 进一步用于人免疫，等等。在第七方面中，本发明提供Flury-LEP G333突变全长基因组cDNA重组载体的应 用，其可以作为狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株的反向遗传操作系统进行进一步的应用，例 如，其可以对除G蛋白333位氨基酸以外的Flury-LEP株基因组毒力相关的其它位点进行 定点突变修饰，以研究不同毒力相关位点间的作用，寻找安全性更好的活毒疫苗；还可以在 所述病毒基因组插入导致病毒减毒或增强免疫反应的外源基因，插入额外的G基因以增强 免疫原性，或者从基因组中删除某个完整的病毒基因，使病毒无法繁殖而失去毒力。因此， 本发明的狂犬病病毒Flury-LEP G333突变全长基因组cDNA重组载体还可以用于构建表达 犬瘟热等其它重要病原保护性免疫原的重组病毒，研制出可同时预防狂犬病及犬瘟热等其 它疫病的重组二联活载体疫苗。


从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中图1显示狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株全长基因组cDNA的重组载体pCI_LEP的 构建示意图。图2显示向编码LEP G蛋白的基因中引入点突变，构建rLEP333Q。(A)rLEP和 rLEP333Q的基因组图示；(B)左图间接免疫荧光检测拯救病毒rLEP333Q感染BHK-21细胞， 右图阴性对照，以阴性血清(即，没有狂犬病病毒抗体的血清)为一抗观察IFA结果；(C) 重组病毒基因组RNA经RT-PCR扩增，用BECKMAN CEQ 8000自动测序仪进行测序，测序显示病毒基因组内的碱基由GG突变为AA，突变部分用边框表示。图3显示野生型LEP (wtLEP)和突变的rLEP333Q在NA细胞(A)和BHK-21细胞⑶ 上的生长动力学曲线。图4显示pCI系列质粒(A)、pCAGG质粒(B)和pBluescriptSK+质粒(C)的图谱。
具体实施例方式以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明 的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。实施例1狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白第333位氨基酸突变株的构建及其生物学 活性鉴定1 材料1. 1质粒、细胞株和病毒质粒pCAGG、pCI_RBz购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，pBluescriptSK (+) 购自 clonetech。BHK-21 细胞(ATCC CC1-10)，293T 细胞(CRL-11268)购自 ATCC，培养基均 为含10%胎牛血清的DMEM(购自GIBC0)。小鼠脑神经瘤细胞NA细胞来自军事医学科学院 军事兽医研究所，培养基为含10%胎牛血清的MEM(购自GIBC0)。狂犬病病毒Flury-LEP 和HEP购自中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心，在BHK-21细胞上扩 增，-70°C冻存备用。1.2主要试剂和仪器T4 DNA连接酶，限制性内切酶Sph I，Mlu I等均购自TaKaRa公司。Phusion 超保真DNA聚合酶。SuperScript III反转录试剂盒、无血清培养基Opti-MEM，转染试剂 Lipofectamine 2000均购自Invitrogen公司。犊牛血清购自Gibco公司。LB培养基成 分均购自OXOID公司。胶回收试剂盒(Gel Extraction Mini Kit)及质粒小量提取试剂盒 (Plasmid Mini Kit)均购自OMEGA公司。质粒中量提取试剂盒QIAfilter Plasmid Midi Kit购自QIAGEN公司。鼠抗狂犬病病毒高免血清由本研究室制备。FITC标记的羊抗鼠荧光 二抗购自Sigma公司。普通显微镜，购自OLYMPUS公司；荧光显微镜，购自ZEISS公司。PCR 仪购自Applied Biosystem公司。核酸测序采用BECKMAN CEQ 8000自动测序仪，所用试剂 为BECKMAN公司产品。P2级生物安全柜购LABC0NC0自公司。二氧化碳培养箱购自Thermo Electron公司。不同型号离心机均购自BECKMAN公司。-70°C超低温冰箱购自NBS公司。 普通冰箱冰柜购自海尔公司。全自动净水机MILI-Q购自BIOCEL公司。各种规格细胞培养 瓶及细胞培养板均购自CORNING公司。1.3 引物参照Gene Bank中所提供的Flury-HEP株基因组序列(Gene Bank序列号 AB085828)，和 Flury-LEP 基因序列(Gene Bank 序列号 DQ099524，Flury-LEP 全长基因组 cDNA序列见SEQ ID NO 1)，将Flury-LEP基因组分为3段(即，Fl，F2和F3)分别设计PCR 引物。其中，片段Fl为Flury-LEP基因序列的1-4063核苷酸序列(SEQ ID N0:2)，片段F2 为Flury-LEP基因序列的4013-8254核苷酸序列(SEQ ID NO :3)，片段F3为Flury-LEP基 因序列的8187-11925核苷酸序列(SEQ ID NO :4)。构建全长基因组cDNA所用引物(表1) 和构建辅助质粒所用引物(表2)均由上海英俊生物技术有限公司合成。根据Flury-LEP基因组序列，设计将G蛋白第333位精氨酸突变为谷氨酰胺的引物(表3)，突变碱基用边框 表示，所述引物也由上海英俊生物技术有限公司合成。表IRT-PCR和全长基因组cDNA构建所用的引物
引物名称引物序列
GTTAA^PrCTGAfdTG 丁CCdfdACJCMUdmCTAT^UdA/^CKMjiffddJW F1-PF .^G7rACGCTTAACAACAAAACCAAAGAA-3'
Fl-PR 5'- GGCACGCGTACTCCACATAACTTGAGTTTGC -3' F2-PF 5'- AGGCCTGTATAAGTCTTTAAAGGGAGCA -3' F2-PR 5'- ATCGGGGTTCCCGGCCTCTTGACACAAC -3' F3-PF 5'- TATGCTAGCTCTGGTTAAGCTCCCACGAATC -3'
F3-PR 5'-ATACCC/i CCGCGA GG AGGTGG A GA TGCCA TGCCGA CCCACGCTTAACAAATAAACAATAA AG -3'______注cDNA片断与图1相一致。下划线部分为病毒特异序列，黑体表示酶切位点，锤 头状核酶(HamRz)和丁肝病毒核酶(HdvRz)用斜体表示。表2辅助质粒构建所用的引物
引物名称
L-N- PF L-N - PR L-P 一 PF L-P - PR L-L-PF L-L-PR
引物序列
5'- GGCGAATTCGCC/jCCATGGATGCCGACAAGATTGT -3' 5'- CCGGGTACCTC囚TTATGAGTCACTCGAATACG -3' 5'- GGCGAATTCGCC/^CCATGAGCAAGATCTTTGTTAA -3'
5'- CCGGGTACCTCATTAGCATGATGTGTAGCGATCC -3'
5'- GGCGAATTCGCC/jCCATGCTGGATCCGGGAGAGGTTTA -3' 5'- CCGGGTACC|TTA|TTACAAACAACTC}TAGTCTA -3' 注下划线部分为病毒特异序列，黑体表示酶切位点，突变碱基用字符边框表示， Kozak序列用斜体表示。 表3G333定点突变所用的引物
引物名称
引物序歹Ij
F2-PF RtoQ-PR
RtoQ-PF F2-PR
5·- AGGCCTGTATAAGTCTTTAAAGGGAGCA -3'(丨司表 1 中F2-PF)
5'-TCAAACACCCTTTTGAGGGGATGATCTCATTCCAGGTfTT|GGACAGACTTG
TAGTGAGCATCAGCCTCCATCAAGGT-3'
5'-GTCTGTCC|A^CCTGGAATGAGATCATCCCCTCAAAAGGGTGTTTGA-3' 5'- ATCGGGGTTCCCGGCCTCTTGACACAAC -3' (iwj表 1 中F2-PR)
注突变碱基用字符边框表示。
1. 4构建Flury-LEP基因组全长cDNA克隆和cDNA片段克隆以及辅助质粒系统
7
1.4. 1病毒基因组的提取、反转录和PCR取Flury-LEP病毒液250 μ L，加入750 μ L Trizol，经常规方法提取基因组RNA。 提取的RNA用SUperSCriptTMIII反转录试剂盒进行反转录反应(反转录引物见表1)按该 试剂盒说明书进行操作，获得末端部分重叠的3个病毒cDNA片段Fl、F2和F3片段。1. 4. 2RT-PCR 产物的克隆整个基因组分为末端部分重叠的3个片断进行RT-PCR扩增，PCR产物经琼脂 糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒(购自OMEGA公司)回收Fl、F2和F3片段，分别克隆至 pBluscript IIKS (+/-) (Clontech)的EcoR ν位点，转化感受态细胞DH5 α，选择并提取阳 性质粒pBlue-Fl，pBlue-F2和pBlue_F3，测序确保克隆的基因组片段与病毒基因组RNA序 列完全一致(具体方法见《分子克隆试验指南》，J.萨姆布鲁克编，2008年第三版，科学出版 社译)。1. 4. 3Flury-LEP基因组全长cDNA克隆和cDNA片段克隆的构建利用基因组cDNA片段F1、F2和F3相邻重叠部分存在的限制酶切位点进行连接组 装(示意图见图1)。具体地，首先将F3段cDNA经Nhe I和Rsr II位点克隆进pCI-RBz，所得 质粒命名为PCI-F3，再将Fl段经Nhe I和Mlu I插入到pCI_F3，所得质粒命名为pCI_F31。 最后将F2段经Sph I和Mlu I克隆进pCI-F31，至此Flury-LEP全基因组cDNA组装完成， 构建成的病毒基因组转录质粒命名为pCI-LEP。该克隆在CMV启动子之下、两个核酶之间的全长cDNA可以在真核细胞RNA聚合酶 的作用下得到转录，并且由于核酶的自身催化功能，可以保证转录产物的3'末端与病毒基 因组精确一致。1. 4. 4构建转录辅助质粒系统以pCI-LEP为模板，PCR扩增编码核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)及聚合酶蛋白(L)基因 的开放阅读框架(ORF) cDNA序列(核苷酸序列分别为SEQ ID NOs :5_7，引物序列见表2)， 分别克隆在PCAGG质粒的多克隆位点(MCS)。在起始密码子前引入Kozak序列(GCCACC)，以 增强蛋白表达[3’4]；在原有终止密码子后增加一个终止密码子，以有效终止辅助质粒mRNA 的转录。构建成的辅助质粒分别命名为pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG_L。1. 5 G333突变全长基因组的构建以在1. 4. 2中构建好的pBlue-F2为模板，分别以F2-PF和RtoQ-PR、RtoQ-PF和 F2-ra为引物分别进行PCR扩增，将2个PCR产物回收后，再以2个PCR产物为模板，以F2-PF 和F2+R为引物进行PCR扩增出全长的F2’片段(含有G蛋白333位氨基酸突变，由精氨 酸R突变为谷氨酰胺Q)。将PCR产物克隆至pBluscript IIKS(+/_)的多克隆位点，将阳性 克隆质粒pBlue-F2’ (G333Q)进行测序，确保突变成功以及克隆的基因组片段与病毒基因组 RNA序列完全一致。最后将G333R突变为Q的F2’段经Sph I和Mlu I克隆进在1. 4. 3中已 构建好的PCI-F31，至此Flury-LEP G333突变全基因组cDNA组装完成，构建成的病毒基因 组转录质粒命名为pCI-LEP333Q。本领域技术人员应该理解，本发明上述方面所述的构建狂犬病病毒Flury-LEP全 长cDNA突变重组载体PCI-LEP333Q的策略可以适用于构建在Flury-LEP全长cDNA基因中 引入任何突变的重组载体。1. 6病毒拯救
在转染前一天，将293T细胞传到35mm 6孔板上，当细胞密度达到80%以上时即 可进行转染。将 pCI-LEP333Q、pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L 分别以 4 μ g、2 μ g、1 μ g、1 μ g 的 比例加入到250 μ 1无血清培养基OPTI-MEM中，混勻；取15 μ 1 Lipofectamine 2000溶于 250 μ 1 OPTI-MEM中，混勻后在室温静置5min ；然后将Lipofectamine 2000与转染质粒 (即 pCI-LEP333Q、pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L 各 4 μ g、2 μ g、1 μ g、1 μ g)混合均勻，室温孵 育30min。在此期间用OPTI-MEM洗涤293T细胞两次，然后每孔加入OPTI-MEM 1ml，最后将 Lipofectamine 2000-质粒混合液500 μ 1加入细胞培养孔中，置于37°C CO2培养箱中培 养8h后吸弃转染液，加入10% DMEM继续培养。72小时后，仔细吹落培养板上的细胞，将培 养液及细胞混合物全部接种BHK-21细胞。72h后，在BHK-21细胞上用间接免疫荧光(IFA) 检测病毒滴度，简言之，即以鼠抗狂犬病病毒高免血清为一抗，相同倍数稀释的小鼠阴性血 清为对照，荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG(Sigma)为二抗，最后用荧光显微镜观察结果。 收获上清液，获救突变病毒株，获救病毒株命名为rLEP333Q株。1.7种毒的制备及滴定将拯救的病毒在BHK-21细胞上进行扩增，10% DMEM 37°C培养3天。在NA细胞或 BHK-21细胞上培养48h后，以IFA(步骤同1. 6)确定病毒滴度。病毒滴度用病灶形成单位 (focus forming unit) FFU 表不。1. 8病毒生长动力学曲线的测定为测定病毒生长动力学曲线，以M.0. I.为0.01分别感染单层NA细胞和BHK-21细 胞。感作Ih后，用无菌PBS洗2次后，分别加含0. 2% FBS的MEM 2ml和2% DMEM 2ml于 37°C培养。分别于接种后24h、72h和120h取细胞培养液上清，在NA细胞和BHK-21细胞上 测定滴度，绘制病毒生长动力学曲线。1. 9小鼠半数致死量(LD5tl)的测定将HEP、wtLEP和rLEP333Q用灭菌的PBS作10倍倍比稀释至10"，将1(Γ4 10"各 稀释度分别取30 μ 1脑内接种5只5 6周龄的Balb/c雌性小鼠。连续观察21天，记录每 组小鼠的平均体重变化和死亡情况。利用Reed-Muench法计算小鼠半数致死量(LD5tl)[11]。2.结果2. 1从突变的全长cDNA克隆拯救突变病毒rLEP333Q为了从克隆的cDNA中拯救感染性RV，首先以pCI_LEP333Q及表达RVN、P、L蛋白 的辅助质粒共转染293T细胞。3天后收获细胞液，盲传一代后IFA检测呈阳性结果(图 2B)。对拯救病毒进行RT-PCR及基因组序列分析结果显示，救获病毒糖蛋白(G)第333位 精氨酸R(CGG)已经突变为谷氨酰胺Q(CAA)，和预期完全相符(图2C)。结果表明，通过反 向遗传操作技术，成功拯救出具有感染性的糖蛋白(G)第333位突变为谷氨酰胺的子代病 毒 rLEP333Q。2. 2拯救的Flury-LEP突变株(rLEP333Q)生物学特性的鉴定2. 2.1动力学曲线wtLEP和rLEP333Q在神经元细胞NA和非神经元细胞BHK-21上的生长动力学曲线 如图所示(图3)，可见两种病毒的生长性能并没有显著差异，这表明糖蛋白(G)第333位的 精氨酸突变为谷氨酰胺后并不影响其生长特性。2. 2. 2嗜神经指数
狂犬病病毒的体外嗜神经指数是指病毒在NA细胞相对于BHK-21细胞上的感染性 比例[12]，嗜神经指数为1即表示病毒在神经元细胞上感染的能力比在非神经细胞上的高10 倍。致病性毒株与弱毒株相比通常具有较高的嗜神经指数。致病性毒株的嗜神经指数一般 大于1，而弱毒株的嗜神经指数通常接近于0[12’13’14]。WtLEP和rLEP333Q的嗜神经指数分别 为0. 8和0 (表4)。与wtLEP相比，rLEP333Q的嗜神经指数已下降与无毒株Flury-HEP —样 接近于零。表4wt LEP、rLEP333Q和HEP的体外嗜神经性
滴度(ffU/mla) 体外嗜神经指 _4]母NA细胞_BHK-21 数匕_
wtLEP 3.7X IO85.3 XIO7 0.8
rLEP333Q 3.0X IO73.3 XIO7 0^￡
HEP 5. QX IQ6_5. OXlO6 0_a同一种毒在NA细胞和BHK-21细胞上的滴度b体外嗜神经指数=log (NA上的滴度)-log (BHK-21上的滴度)2. 2. 3对小鼠的致病性为了确定wtLEP、rLEP333Q以及HEP对小鼠的致病性，每只小鼠脑内接种病毒 105FFU/30y L· HEP感染的小鼠只表现出轻微的症状如毛微乱、体重略减；而感染wt LEP和 rLEP333Q的小鼠则表现出麻痹、兴奋，体重减轻等中枢神经系统疾病的临床症状(数据未显 示)。所有的老鼠在11天内全部死亡。此外，我们测定了 wtLEP和rLEP333Q的LD5tl，分别为 8. 8个FFU和80个FFU。结果表明，rLEP333Q毒株脑内接种小鼠感染仍致死，但与wtLEP相 比，致病性下降。3 讨论狂犬病病毒的G蛋白是很重要的致病因子，与细胞粘附、诱导细胞凋亡和免疫 应答等有关。G蛋白的第333位氨基酸位点对小鼠的致病性至关重要。本研究发现将 Flury-LEP糖蛋白(G)第333位的R突变为Q后，虽然小鼠脑内接种仍能致死，但病毒丧失 了体外嗜神经性，对小鼠的致病性有所下降。目前已报道的狂犬病病毒的细胞受体有烟碱乙酰胆碱受体 (nicotinicacetylcholine receptor) [15]> 神经细胞粘附分子(neural cell adhesion molecule, NCAM)[16]和低亲和力神经营养因子受体(low-affinity neurotrophinreceptor, p75NTR)[17]。G 蛋白结合 p75NTR 的能力依靠于第 330 位的 lysine 或是333位的R。因此，P75NTR可能与LEP获得在CNS中传播和扩增有关系。表4显示LEP 和LEP333Q体外的嗜神经指数有显著差异，表明333位上的R改变了病毒结合细胞种属的特 性。狂犬病病毒在细胞间的传递有两种假设模式一是神经细胞内的病毒直接侵入到 毗邻的细胞神经细胞，二是自由的病毒粒子侵入到神经细胞内[18]。病毒在神经系统内的传 播以前者为主，333位的R对细胞间的传递极为重要。将LEP333位R突变后，其嗜神经性降 低与无致病性毒株Flury-HEP —致。因此，本发明人认为， 毒神经嗜性的减弱能极大地提高其作为活毒疫苗使用时的安全性。所以，本发明的突变株rLEP333Q可以用作一种更加安 全的疫苗，同时还可以作为口服疫苗，对野生动物进行投食免疫，也可用于人免疫等。实施例2突变重组病毒rLEP333Q对比格犬的免疫试验为了评价突变重组病毒rLEP333Q对比格犬的免疫效果，将3月龄12只比格犬随 机分成两组，6条后腿肌肉注射IO6FFU的rLEP333Q，6条注射IO6FFU的wtLEP。免疫后3周 采血、分离血清，用于中和抗体滴度检测。中和试验血清样品首先56°C水浴处理30min灭活，随后连续20倍至1280倍倍比稀释，同 时设阴性、标准血清对照。攻击病毒采用标准固定毒CVS株，将稀释好的血清与含10000个 FFU的病毒等体积混合，37°C孵育lh，然后取100 μ 1加到过夜生长的24孔ΒΗΚ-21细胞上。 每个样品作3个重复。感染后48h进行IFA检测。被检血清的中和抗体滴度为使荧光灶抑 制等于50%的血清最高倍数。标准血清的起始稀释效价为2IU/ml，待测抗体单位(IU/ml) =待测血清中和滴度/标准血清中和滴度X2。突变重组病毒rLEP333Q对比格犬的免疫保护性根据0. I. E标准测定rLEP333Q和WtLEP诱导比格犬中和抗体水平实验结果显 示rLEP333Q免疫比格犬诱导产生的中和抗体达18. 7士6. 5IU/ml，wtLEP免疫比格犬诱 导产生的中和抗体滴度为20士9. 7IU/ml，两组数据并无显著性差异。可见，突变重组病毒 rLEP333Q可诱导与wtLEP相当的中和抗体水平，且安全性较wtLEP更好，因此该病毒作为活 疫苗更具有优势。应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述， 但是本领域的普通技术人员应该理解，可以在其中进行各种形式和细节的变化，而不背离 由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围。参考文献[l]Martinez L. Global infectious disease surveillance. Int J Infect Dis, 2000,4(4) :222-8.[2]Dietzschold B, Wunner WH, Wiktor TJ, et al.Characterization of anantigenie determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity ofrabies virus. Proc Natl Acad Sci USA,1983,80(1) :70-4.[3]Morimoto K, Hooper DC, Spitsin S, et al. Pathogenicity of different rabiesvirus variants inversely correlates with apoptosis and rabies virus glycoproteinexpression in infected primary neuron cultures. J Virol,1999,73(1) 510-8.[4]Dietzschold B, Wiktor TJ, Trojanowski JQ, et al.Differences in cell-to-cellspread of pathogenic and apathogenic rabies virus in vivo and in vitro. J Virol. 1985,56(1) :12-8.[5] Faber M, Pulmanausahakul R, Nagao K, et al. Identification of viralgenomic elements responsible for rabies virus neuroinvasiveness. Proc NatlAcad Sci USA,2004，101(46) :16328_32.[6]Lentz TL, Burrage TG, Smith AL, et al. Is the acetylcholine receptor
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12
<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>11925<212>DNA<213>狂犬病病毒<400>1acgcttaacaSLCSLSLSLSLCCSLSLagaagaagcagacagcgtcagttgcaaagcaaaaatgtaa60
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13
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一种突变狂犬病病毒Flury LEP弱毒疫苗株，其表达的狂犬病病毒Flury LEP糖蛋白第333位氨基酸由精氨酸R突变为谷氨酰胺Q。
2.生产权利要求1的突变狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株的方法，所述方法包括(1)构建转录质粒，所述转录质粒包括在其中引入狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白第333 位氨基酸由精氨酸R突变为谷氨酰胺Q的狂犬病病毒Flury-LEP全长基因组cDNA序列；(2)构建一个或多个转录辅助质粒，所述辅助质粒包括编码狂犬病病毒Flury-LEP核 蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L基因的开放阅读框架的cDNA序列；(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染允许狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株复 制的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；(4)收获上清液，获救突变病毒株。
3.权利要求2的方法，其中所述转录质粒为pCI-LEP333Q。
4.权利要求2的方法，其中所述转录辅助质粒是pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG_L。
5.权利要求2-4中任一项的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞。
6.权利要求1的突变狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株的应用，其用作高安全性的活 毒疫苗，单独或与其它疫苗一起使用。
7.狂犬病病毒Flury-LEPG333突变全长基因组cDNA重组载体，其表达的狂犬病病毒 Flury-LEP糖蛋白第333位氨基酸由精氨酸R突变为谷氨酰胺Q。
8.权利要求7的狂犬病病毒Flury-LEPG333突变全长基因组cDNA重组载体的应用， 其与分别编码LEP的核蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L的转录辅助质粒一起用于拯救狂 犬病病毒弱毒疫苗株的一种反向遗传操作系统。
9.权利要求7的狂犬病病毒Flury-LEPG333突变全长基因组cDNA重组载体的应用， 其用于构建预防狂犬病和其它疫病的重组二联活载体疫苗。
10.权利要求8或9的应用，其中所述狂犬病病毒Flury-LEPG333突变基因组cDNA重 组载体是 PCI-LEP333Qt全文摘要
本发明属于重组病毒疫苗领域。本发明涉及一种突变狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株，其表达的狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位氨基酸由精氨酸R突变为谷氨酰胺Q。更具体地，本发明涉及狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位氨基酸突变株rLEP333Q。本发明还涉及生产所述突变株的方法，以及所述突变株的应用。
文档编号C12N15/85GK101942418SQ20091024450
公开日2011年1月12日 申请日期2009年12月30日 优先权日2009年12月30日
发明者步志高, 王喜军, 葛金英, 陶丽红 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所