专利名称：IBDV抗原表位与HBcAg嵌合基因的分子设计的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及IBDV抗原表位与HBcAg嵌合基因的分子设计，具体涉及传染性法氏囊 病病毒(IBDV)抗原表位与乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)嵌合基因的分子设计、技术路 线、基因序列、表达质粒及其表达产物，属于生物制药领域。
背景技术：
传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)是当今危害最严重的禽病之 一，由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的以侵害雏鸡 中枢免疫器官-法氏囊为主要特征。该病不仅引起患病动物死亡，而且还导致机体免疫抑 制，使机体的免疫防御能力降低和疫苗免疫接种失败。每年因IBD发病、免疫失败、免疫抑 制造成的经济损失巨大[王永山等.近期引起免疫失败的传染性法氏囊病病毒VP2基因的 分子特征.中国兽医科学，2008,38(12) :1013-1019]。接种疫苗是当前防控IBD最有效的 方法，目前使用的中强毒力活疫苗存在着较大的生物安全问题，因为在不同IBDV毒株之间 潜在着基因重配的可能，灭活疫苗也存在着抗原制备的困难。由于该病毒易变，在生产实践 中要求IBD疫苗不断更新以应对新出现的IBDV变异株。IBDV属双RNA病毒科，基因组包括大㈧小⑶两个片段，有五种病毒蛋白VP1、 VP2、VP3、VP4和VP5。VPl由B片段编码，为病毒自身编码的依赖RNA的RNA聚合酶。其它 四种病毒蛋白由A片段编码的多聚蛋白加工而成VP2和VP3是病毒的主要结构蛋白，构成 病毒衣壳，VP4为病毒自身蛋白酶，VP5为病毒的非结构蛋白，与病毒的毒力和复制效率有 关。VP2是病毒的主要保护性抗原，病毒中和表位主要在VP2上，并且多为构象依赖性，其立 体结构对病毒中和表位的形成至关重要。以VP2为靶基因的IBD基因工程疫苗已进行了多 年研究。分析目前的研究进展，三个方面难以兼顾一是提高重组IBDV蛋白的表达量，二是 简化原核表达的重组IBDV蛋白复性工艺，三是解决源于一种毒株的重组蛋白不适用于其 它变异毒株的问题，由此导致的较高生产成本是影响兽用基因工程疫苗推广应用的主要原 因。因此，探索新的IBD基因工程疫苗技术路线是十分必要的。抗原表位是蛋白质抗原性的物质基础，重组蛋白的正确复性是构象依赖性表位形成的关键，构象依赖性中和抗原表位和免疫优势表位的丢失将影响到机体产生完全有效的 保护性免疫应答。此前，本专利申请人根据5个IBDV抗原表位基序构建线性串联模拟IBDV 多表位基因5印is，在多表位基因中，用线性化序列模拟了 IBDV空间构象依赖性抗原表位， 将人工合成的5印is在大肠杆菌中表达，重组多表位蛋白5EPIS可刺激机体产生抗IBDV感 染的保护性免疫应答[Wang YS(王永山)，et al (等)· Development of amulti-mimotope peptide as a vaccine immunogen for infectious bursal disease virus. Vaccine, 2007,25(22) :4447_4455.]。但这种单纯用抗原表位串联的方法得到的多表位分子量小，其 表达量、免疫原性以及免疫效力都有待进一步提高。因此，探索模拟IBDV抗原表位分子构 建模式，进一步增强其分子的稳定性、免疫原性及其免疫效力是十分必要的，这不仅可以拓 宽IBD新型检测试剂和表位型基因工程疫苗的研究策略，而且具有良好的应用前景。
发明内容
技术问题抗原表位是蛋白质抗原性的物质基础，重组蛋白的正确复性是构象依赖性表位形成的关键，构象依赖性中和抗原表位和免疫优势表位的丢失将影响到机体产生完全有效的 保护性免疫应答。近年来，随着对病毒抗原表位的分析，在一些分子量较大的病毒保护性 免疫原中除了与免疫保护有关的中和表位外，还有非中和表位、抑制性表位甚或是毒性表 位，这些表位会影响疫苗的免疫效果。单一抗原表位通常由数个氨基酸残基组成，其分子量 很小，在体内的稳定性和免疫原性都很弱，因此，在应用于表位型基因工程疫苗研究时，需 要采取多表位的方法，以增强其免疫原性、稳定性和免疫效力。已有的实验结果表明，采用 多个表位串联的方法可以增强免疫原性，多表位有利于提供更完全和更有针对性的免疫保 护，但并不是拷贝数越多越好，只有串联适量的拷贝数，才能够刺激机体产生最大量的中和 抗体。此外，抗原表位、连接方法以及表达系统等都会影响到多表位蛋白的免疫效力，表位 的加工效率也是影响多表位蛋白免疫原性的重要因素。由于表位自身性质和组合方式的不 同，对多表位疫苗的分子设计方案还没有一成不变的优化规律。本发明利用HBcAg具有形成病毒样颗粒并具有免疫佐剂功能的分子特征，用其作 为IBDV抗原表位的分子载体，将IBDV模拟多表位5印is嵌入HBcAg之中，构建IBDV抗原 表位与HBcAg嵌合基因，提高抗原表位的稳定性、免疫原性及其免疫效力，为新型颗粒化表 位型IBD基因工程疫苗提供技术和物质保证。技术方案模拟传染性法氏囊病病毒(IBDV)多表位5印is与乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg) 嵌合基因，该嵌合基因mHBc-5印is序列为SEQ ID NO. 1。上述模拟IBDV多表位5印is与乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)嵌合基因病毒样 颗粒重组蛋白，其序列为SEQ ID NO. 2。是通过分子设计和分子构建嵌合基因mHBc-5印is 表达质粒pET-mHBc-5印is，在大肠杆菌中高效表达获得的。其分子设计和技术路线分为四 个步骤进行3、根据权利要求2所述的重组蛋白，是通过分子设计获得的，具体包括第一步根据HBcAg基因序列设计引物，并在正向引物Pl与反向引物P2的5'端 分别加上酶切位点Nco I与Hind III Pl 5' -GATATACCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3‘P2 5' -GTTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAG-3‘以乙型肝炎患者血清为模板用PCR扩增HBcAg基因片段560bp，与pMD18_T载体连 接，转化E. coli T0P10感受态细菌，获得含有HBcAg基因的重组克隆质粒pMD-HBc ；第二步运用重叠延伸PCR技术在重组克隆质粒pMD-HBc中的HBcAg基因的231 232位核苷酸，即77 78位氨基酸残基之间插入BamH I和EcoR I酶切位点，在重叠延伸 PCR引物P3和引物P4的5'端分别加上酶切位点BamH I和EcoR I P3 5' -GAATTCTGGATCCTCCAAGTTATTACCCAC-3‘P4 5' -GGAGGATCCAGAATTCTCCCCAGCATCTAGG-3‘以pMD-HBc为模板，分别用引物Pl和P3，引物P4和P2扩增得到PCR产物P13禾口P42，再以P13和P42共同作模板，用引物P1和P2扩增得到PCR产物，用1. 0%琼脂糖凝胶 电泳分析，回收目的DNA片段，构建含BamH I和EcoR I位点的HBcAg修饰基因Modified HBc，简称mHBc，与pMD18-T载体连接，可见两条大小分别约为580bp和2700bp的条带，获 得含BamH I和EcoR I位点的HBcAg修饰基因mHBc重组克隆质粒pMD-mHBc ；将pMD-mHBc 和pET-28a分别用Ncol和Hindlll酶切，构建含有BamH I和EcoR I酶切位点的mHBc重 组原核表达质粒pET-mHBc ； 第三步根据模拟IBDV多表位基因5印is以及HBcAg修饰基因表达质粒pET-mHBc 的双酶切位点和阅读框，设计引物，并分别在正、反向引物的5'端加上酶切位点BamH I和 EcoR I 正向引物 5 ‘ -GCGGATCCCATGCCTAAGACTCATAATTCTGGTC-3 ‘反向引物5 ‘ -GCGAATTCAAACCAATTAGTAAAACCATGCCCATG-3 ‘以pET-5印is为模板，用PCR方法在5印is基因的5'和3'端分别加入BamH I 和EcoRI酶切位点，构建5印is亚克隆质粒pMD-5印is ；将第二步构建的mHBc重组原核表达质粒pET-mHBc与pMD-5印is分别用BamH I 和EcoR I双酶切，回收pET-mHBc片段和5印is片段，用T4 DNA连接酶连接，转化E. coli TOP 10感受态细菌，获得IBDV抗原表位嵌合基因mHBc-5印is表达质粒pET-mHBc_5印is。第四步将pET-mHBc-5印is转化宿主菌E. coli BL21 (DE3)，涂布1. 5%琼脂LB平 板该平板含卡那霉素100 U g/mL，挑取单菌落接种于含卡那霉素100 U g/mL的LB液体培养 基中，37°C，200r/min振摇16h，再按1 %的体积吸取菌液接种于含卡那霉素100 y g/mL的 LB液体培养基中，37°C，200r/min振摇至菌液A6(1(1 = 0. 6 0. 8，加IPTG至终浓度为lmmol/ L，37°C，200r/min,诱导培养4h，收集重组菌培养物，获得IBDV抗原表位5印is与HBcAg嵌 合基因病毒样颗粒重组蛋白。上述嵌合基因重组蛋白可以在IBD新型检测试剂或基因工程疫苗方面得到应用。有益效果本发明的特点和优点如下IBDV属双RNA病毒科，基因组包括大(A)小⑶两个片段，有五种病毒蛋白VP1、 VP2、VP3、VP4和VP5。VP1由B片段编码，为病毒自身编码的依赖RNA的RNA聚合酶。其它 四种病毒蛋白由A片段编码的多聚蛋白加工而成VP2和VP3是病毒的主要结构蛋白，构成 病毒衣壳，VP4为病毒自身蛋白酶，VP5为病毒的非结构蛋白，与病毒的毒力和复制效率有 关。VP2是病毒的主要保护性抗原，病毒中和表位主要在VP2上，并且多为构象依赖性，其立 体结构对病毒中和表位的形成至关重要。以VP2为靶基因的IBD基因工程疫苗已进行了多 年研究。分析目前的研究进展，三个方面难以兼顾一是提高重组IBDV蛋白的表达量，二是 简化原核表达的重组IBDV蛋白复性工艺，三是解决源于一种毒株的重组蛋白不适用于其 它变异毒株的问题，由此导致的较高生产成本是影响兽用基因工程疫苗推广应用的主要原 因。因此，探索新的IBD基因工程疫苗技术路线是十分必要的。病毒样颗粒(Virus like particles, VLP)疫苗作为预防性疫苗具有以下几个方 面的优势(1)不含病毒DNA，无感染性；(2)免疫原性强，可刺激机体产生特异性体液免疫 和细胞免疫；(3)稳定性好，不易失活。基于VLP设计的疫苗，是一种理想的疫苗形式。乙型肝炎病毒核心抗原Ofepatitis B core antigen, HBcAg)是由乙型肝炎病毒 基因组的C区基因编码，从第二个AUG起始翻译，形成长约183 185个氨基酸残基的多肽。HBcAg的第48位和第61位上的半胱氨酸可与另一 HBcAg上相应位点的半胱氨酸通过二硫键形成二聚体。以二聚体为基本单位，HBcAg可自身聚合成两种排列形式、直径分别为 30nm和34nm的核心颗粒T = 3型，由180个HBcAg分子组成的20面体结构；T = 4型，由 240个HBcAg分子组成的20面体结构。两种颗粒的局部排列相似，表面有特征性的刺突和 核孔。HBcAg氨基端的第78 83位、127 133位氨基酸残基位于颗粒表面，并且前者是 刺突尖部的组成部分。而HBcAg羧基端的150 177位氨基酸残基则位于颗粒的内部，为 HBcAg的核酸结合区域，在大肠杆菌合成的HBcAg颗粒内部包含有细菌的RNA，能使机体免 疫反应向Thl方向极化。由HBcAg组成的VLP，既有颗粒抗原的一般特征，也具有免疫佐剂 的作用。因此，HBcAg颗粒被认为是抗原表位理想的分子载体。本发明针对IBD流行现状和基因工程疫苗研究中存在的主要问题，利用HBcAg具 有形成病毒样颗粒并具有免疫佐剂功能的分子特征，用其作为IBDV抗原表位的分子载体， 进行分子设计和嵌合基因mHBC-5epiS表达质粒的构建。构建的IBDV抗原表位嵌合基因分 子载体，使用方便、容量大、表达量高、表达产物呈病毒样颗粒，具有成为颗粒化表位型IBD 基因工程疫苗的应用前景。用SDS-PAGE分析，重组嵌合蛋白的分子量约29kDa，表达量约占 菌体总蛋白的47. 6%;在Western-blotting试验中，重组嵌合蛋白与IBDV抗体反应形成1 条特异性蛋白带。将重组菌超声破碎，用电镜检查，可见重组嵌合蛋白呈病毒样颗粒(VLP)， 直径约60nm 80nm ；用IBDV抗体夹心ELISA检测，抗原效价达到2. OX 102。
四
图lHBcAg修饰基因mHBc的序列结构图2嵌合基因mHBc-5印is表达质粒的分子图谱图3HBcAg修饰基因mHBc表达质粒pET-mHBc酶切图谱图4嵌合基因表达质粒pET-mHBC-5epiS酶切图谱图5嵌合基因mHBc-5印is的序列图6嵌合基因重组菌pET-mHBc-5印is分析结果图7嵌合基因mHBc-5印is重组蛋白电镜检查结果
五具体实施例方式1实验材料含有模拟IBDV多表位基因5印is的重组原核表达质粒pET-5印is由本实验室构 建[公知公用，Wang YS (王永山)，et al (等) Development of a multi-mimotope peptide as avaccine immunogen for infectious bursal disease virus. Vaccine, 2007,25(22) 4447-4455.]。 鸡抗IBDV高免血清系用IBD弱毒疫苗(B87株，购自南京天邦生物科技有限公司) 对SPF鸡(购自南京天邦生物科技有限公司)免疫5次获得，用DEAE纤维素(DE32)纯化 (刘玉斌，苟仕金主编.动物免疫学实验技术.长春吉林科学技术出版社，1989，8-15)；
兔抗鸡IgG抗体和HRP标记的兔抗鸡IgG抗体参照文献制备(刘玉斌，苟仕金 主编.动物免疫学实验技术.长春吉林科学技术出版社，1989,150-151 ；王永山，郝崇， 侯世宽，刘子，马从林，殷震.抗鸡IgG单克隆抗体的研究.兽医大学学报，1989，9(2)109-114)。Ex Taq DNA 合成酶、T4DNA 连接酶、BamHI、EcoRI、DNA Marker、X_gal、IPTG、 MiniBEST质粒纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、克隆载体pMD18-T simple Vector均购自 TaKaRa 公司。原核表达载体pET-28a、E. coli BL21 (DE3)、E. coli TOP 10 均购自 Invitrogen 公 司。DAB显色液购自武汉博士德生物工程有限公司。引物合成、DNA序列测定由Invitrogen 公司完成。2实验方法2. lHBcAg基因克隆质粒的构建根据HBcAg 基因序列(GenBank 登录号AM282986 ；Panjaworayan N, 等 HBVRegDB -annotation, comparison, detection and visualization of regulatory elements in hepatitis B virussequences.Viro J,2007,4:136 doi 10. 1186/1743-422X-4-136.)设计引物，并在正向引物PI与反向引物P2的5'端分别加上 酶切位点Nco I与Hind III。P1 5' -GATATACCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3‘P2 5' -GTTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAG-3‘取住院乙型肝炎患者血清25iiL，加入等量裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH 7.5， 0. 3% NP-40)，充分混勻，100°C水浴5min, 13000r/min离心lOmin，取3 u L上清液作模板， PCR 扩增 HBcAg 基因片段。PCR 条件95°C预变性 2min ；94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s，循环 30次；72°C延伸5min。用1. 0%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，可见一条大小约为560bp的 目的DNA带(图3中2泳道)，与HBcAg基因实际大小相符合，回收目的DNA片段，DNA胶回 收试剂盒纯化，与PMD18-T simple Vector载体连接，转化E. coliTOPIO感受态细菌，涂布 于1. 5%琼脂LB平板(含Amp 100 u g/ml)，挑白色菌落培养，抽提质粒，用Nco I与Hind III双酶切鉴定，可见两条大小分别约为560bp和2700bp的DNA带(图3中3泳道)，与理 论大小相符合测序分析，获得含有HBcAg基因的重组克隆质粒pMD-HBc。2. 2HBcAg修饰基因mHBc表达质粒的分子设计与构建运用重叠延伸PCR技术在重组克隆质粒pMD-HBc中的HBcAg基因的231 232位 核苷酸(77 78位氨基酸残基)之间插入BamH I和EcoR I酶切位点。在重叠延伸PCR 引物P3和引物P4的5'端分别加上酶切位点BamH I和EcoR I。P3 5' -GAATTCTGGATCCTCCAAGTTATTACCCAC-3‘P4 5' -GGAGGATCCAGAATTCTCCCCAGCATCTAGG-3‘以pMD-HBc为模板，分别用引物P1和P3，引物P4和P2扩增得到PCR产物P13 (大 小 251bp)，和 P42(大小 354bp), PCR 扩增条件为:95°C预变性 2min ;94°C 30s，55°C 30s, 72°C 30s，循环 30 次；72°C延伸 5min。再以P13和P42共同作模板，用引物P1和P2扩增得到PCR产物，用1. 0%琼脂糖 凝胶电泳分析，可见一条大小约为580bp的DNA条带(图3中4泳道)，与理论大小相符合， 回收目的DNA片段，与pMD18-T simple Vector载体连接，经氨苄抗性与蓝白斑筛选，Nco I 与Hind III双酶切鉴定，用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，可见两条大小分别约为580bp和 2700bp的条带(图3中5泳道)，与理论大小相符合，DNA测序结果与实验设计序列一致
7(图1、图5)。获得含BamH I和EcoR I位点的HBcAg修饰基因(Modified HBc, mHBc)重 组克隆质粒pMD-mHBc。将pMD-mHBc和pET_28a分别用NcoI和HindIII酶切，采用实验室常规方法(萨 姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.著(金冬燕，黎孟枫，侯云德，等.译校).分子克隆 实验指南.第2版，北京科学出版社，1995，846 847，888 898)构建含有BamH I和 EcoR I酶切位点的mHBc重组原核表达质粒pET-mHBc，用Nco I和Hind III对HBcAg修饰 基因mHBc表达质粒pET-mHBc进行双酶切，可见两条大小分别约为580bp和5200bp的DNA 带(图3中6泳道)。将pET-mHBc转化宿主菌E. coli BL21 (DE3)，涂布1. 5%琼脂LB平板(含卡那霉 素100 μ g/mL)，挑取单菌落接种于LB液体培养基中(含卡那霉素100 μ g/mL)，37°C，200r/ min振摇16h。再按1 %的体积吸取菌液接种于LB液体培养基中(含卡那霉素100 μ g/mL)， 37°C，200r/min振摇至菌液A_ = 0. 6 0. 8，加IPTG至终浓度为lmmol/L，诱导培养4h，离 心沉淀菌体，用SDS-PAGE分析(萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.著(金冬燕，黎孟 枫，侯云德，等.译校).分子克隆实验指南.第2版，北京科学出版社，1995，846 847， 888 898)，在分子量2IkDa处可见表达产物蛋白条带，与重组mHBc的理论推算值相符合。2. 3嵌合基因表达质粒的分子设计与构建根据模拟IBDV多表位基因5印is以及HBcAg修饰基因表达质粒pET-mHBc的双酶 切位点和阅读框，设计引物，并分别在正、反向引物的5'端加上酶切位点BamHI和EcoRI。正向引物5 ‘ -GCGGATCCCATGCCTAAGACTCATAATTCTGGTC-3 ‘反向引物5 ‘ -GCGAATTCAAACCAATTAGTAAAACCATGCCCATG-3 ‘以pET-5印is为模板，用PCR方法在5印is基因的5'和3'端分别加入BamH I 和EcoRI酶切位点，构建5印is亚克隆质粒pMD-5印is，将pMD_5印is用BamH I和EcoR I 双酶切，1. O%琼脂糖凝胶电泳分析，可见两条约250bp和2700bp的DNA片段，与5印is和 PMD载体的理论长度相符合(图4中3泳道)。将pET-mHBc与pMD-5印is分别用BamH I禾Π EcoR I双酶切，回收pET-mHBc片段 和5印is片段，用T4DNA连接酶连接，转化E. coli TOPlO感受态细菌，获得IBDV抗原表位 嵌合基因mHBc-5印is表达质粒pET-mHBc-5印is，用MiniBEST质粒纯化试剂盒提取质粒， BamH I和EcoR I双酶切鉴定，可见两条约250bp和5800bp的DNA片段(图4中4泳道)。 mHBc-5印is测序结果(SEQ ID NO. 1)与实验设计一致(图5)2. 4嵌合基因表达产物的分析2. 4. 1SDS-PAGE将pET-mHBc-5印is转化宿主菌E. coli BL21 (DE3)，涂布1. 5%琼脂LB平板(含卡 那霉素100 μ g/mL)，挑取单菌落接种于LB液体培养基中(含卡那霉素100 μ g/mL)，37°C， 200r/min振摇16h。再按的体积吸取菌液接种于LB液体培养基中(含卡那霉素100 μ g/ mL)，37°C，200r/min振摇至菌液 A6qq = 0. 6 0. 8，加 IPTG 至终浓度为 lmmol/L，37°C，200r/ min,诱导培养4h。收集重组菌培养物，用15% SDS-PAGE电泳分析，在分子量29kDa处可见 表达蛋白(SEQ ID N0. 2)产物，与嵌合基因mHBc-5印is编码蛋白的分子量理论值相符合。 用Bandscan 5. O软件分析，表达量占菌体总蛋白的47. 6% (图6中3、4泳道)。2. 4. 2ffestern blotting
SDS-PAGE电泳完毕后，将蛋白条带转印到硝酸纤维素膜(NC膜)上，转印后的NC 膜用5%脱脂奶粉4°C封闭过夜，先后用第一抗体(鸡抗IBDV高免血清1 100稀释)和 第二抗体(HRP标记的兔抗鸡IgG抗体1 1000稀释)与转印后的NC膜反应，DAB底物显 色，重组菌诱导物与鸡抗IBDV高免血清反应，在分子量29kDa处出现一条带，与SDS-PAGE 的分析结果一致(图6中6泳道)。2. 4. 3电镜检查将诱导后的重组菌超声破碎，3000r/min离心5min，取上清液 ，部分用电镜负染技 术观察；部分与鸡的IBDV高免血清混合，37°C反应Ih后，4°C过夜，3000r/min离心5min， 取上清液，用电镜负染技术观察，均可见病毒样颗粒(virus-like particles，VLP或者 subviral particle, SVP)，直径约为 60 80nm(图 7)。2. 4. 4 夹心 ELISA用纯化的鸡抗IBDV IgG包被ELISA反应板，浓度5 μ g/mL，100 μ 1/孔，4°C过夜， PBST洗涤，用含10%小牛血清的PBST封闭。将超声破碎的重组菌悬浮液分别加入ELISA板 反应孔，100μ 1/孔，37°C，2h，PBST洗涤；加入1 1000稀释的HRP标记的鸡抗IBDV IgG， 100 μ 1/孔，370C，lh, PBST洗涤，加入TMB显色液，用2Μ H2SO4终止，测A450值，分析结果。实 验同步设立IBDV抗原为阳性对照、Ε. coli BL21(DE3)为阴性对照、PBST为空白对照。超声 破碎的重组菌悬浮液抗原效价达到2Χ102，IBDV抗原为阳性；而Ε. coli BL21(DE3)和PBST 则均为阴性。序列表<110>中国人民解放军南京军区军事医学研究所江苏省农业科学院<120>IBDV抗原表位与HBcAg嵌合基因的分子设计<1；30> 说明书<160>8<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>798<212>DNA<213>人工合成<220><221> 嵌合基因 mHBc-5印is<222>(1). . (798)<223><400>1atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60tctgactttt ttccttccgt cagagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgggaa 120gccttagagt ctcctgagca ttgctcacct caccatactg cactcaggca agcaattctc 180tgctgggggg aattgatgac tctagctacc tgggtgggta ataacttgga ggatcccatg 240cctaagactc ataattctgg tcgttctaat gtggatggtg gaggttcgac gcttcatctg 300ccgcatttgt ggcggcctct ttctggtgga ggttcgcata atgcgaagta tgtgtcggct 360
gagtcttggg gtggaggttc gcatccggat agtattcatc cgtttctggc gtctcctggt 420ggaggttcgg atactcttca tgggcatggt tttactaatt ggtttgaatt ctccccagca 480tctagggatc tagtagtcaa ttatgttaat actaacatgg gtttaaagat caggcaacta 540ttgtggtttc atatatcttg ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc 600tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta 660tcaacacttc cggaaactac tgtggttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga 720agaactccct cgcctcgcag acgcagatct caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct 780cgggaatctc aatgttag798<210>2<211>265<212>PRT<213>人工合成<220><221>嵌合基因的重组蛋白<222>(1). . (265)<223><400>2Met Asp lie Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu151015Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp202530Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys354045Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala lie Leu Cys Trp Gly Glu505560Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Met65707580Pro Lys Thr His Asn Ser Gly Arg Ser Asn Val Asp Gly Gly Gly Ser859095Thr Leu His Leu Pro His Leu Trp Arg Pro Leu Ser Gly Gly Gly Ser100105110His Asn Ala Lys Tyr Val Ser Ala Glu Ser Trp Gly Gly Gly Ser His115120125Pro Asp Ser lie His Pro Phe Leu Ala Ser Pro Gly Gly Gly Ser Asp130135140Thr Leu His Gly His Gly Phe Thr Asn Trp Phe Glu Phe Ser Pro Ala145150155160Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys165170 175
lie Arg Gln Leu Leu Trp Phe His lie Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg180185190Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp lie Arg Thr195200205Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro lie Leu Ser Thr Leu Pro210215220Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg225230235240Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg245250255Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys260265<210>3<211>30<212>DNA<213> 人工<220><221>P1<222>(1). . (30)<223><400>3gatataccat ggacattgac ccttataaag30<210>4<211>32<212>PRT<213> 人工<220><221>P2<222>(1). . (32)<223><400>4Gly Thr Thr Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala Ala151015Cys Ala Thr Thr Gly Ala Gly Ala Thr Thr Cys Cys Cys Gly Ala Gly202530<210>5<211>30<212>DNA<213>IBDV单克隆抗体
<220><221>P3<222>(1). . (30)
<223><400>5gaattctgga tcctccaagt tattacccac30<210>6<211>31<212>PRT<213> 人工<220><221>P4<222>(1). . (31)<223><400>6Gly Gly Ala Gly Gly Ala Thr Cys Cys Ala Gly Ala Ala Thr Thr Cys151015Thr Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Thr Cys Thr Ala Gly Gly202530<210>7<211>34<212>DNA<213> 人工<220><221>嵌合基因表达质粒正向引物<222>(1). . (34)<223><400>7gcggatccca tgcctaagac tcataattct ggtc34<210>8<211>35<212>PRT<213> 人工<220><221>嵌合基因表达质粒反向引物<222>(1). . (35)<223><400>8
Gly Cys Gly Ala Ala Thr Thr Cys Ala Ala Ala Cys Cys Ala Ala Thr
151015Thr Ala Gly Thr Ala Ala Ala Ala Cys Cys Ala Thr Gly Cys Cys Cys202530Ala Thr Gly3权利要求
模拟传染性法氏囊病病毒IBDV多表位5epis与乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg嵌合基因，该嵌合基因mHBc-5epis序列为SEQ ID NO.1。
2.权利要求1所述嵌合基因的重组蛋白，其序列为SEQID NO. 2。
3.根据权利要求2所述的重组蛋白，是通过分子设计获得的，具体包括第一步根据HBcAg基因序列设计引物，并在正向引物Pl与反向引物P2的5'端分别 加上酶切位点Nco I与Hind III Pl 5' -GATATACCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3‘ P2 5' -GTTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAG-3‘以肝炎患者血清为模板用PCR扩增HBcAg基因片段500bp，与pMD18_T载体连接，转化 E. coli TOPlO感受态细菌，获得含有HBcAg基因的重组克隆质粒pMD_HBc ；第二步运用重叠延伸PCR技术在重组克隆质粒pMD-HBc中的HBcAg基因的231 232 位核苷酸，即77 78位氨基酸残基之间插入BamH I和EcoR I酶切位点，在重叠延伸PCR 引物P3和引物P4的5'端分别加上酶切位点BamH I和EcoR I P3 5' -GAATTCTGGATCCTCCAAGTTATTACCCAC-3‘ P4 5' -GGAGGATCCAGAATTCTCCCCAGCATCTAGG-3‘以pMD-HBc为模板，分别用引物Pl和P3，引物P4和P2扩增得到PCR产物P13和P42， 再以P13和P42共同作模板，用引物Pl和P2扩增得到PCR产物，用1.0%琼脂糖凝胶电泳分 析，回收目的DNA片段，构建含BamH I和EcoR I位点的HBcAg修饰基因Modified HBc,简 称mHBc，与pMD18-T载体连接，可见两条大小分别约为580bp和2700bp的条带，获得含BamH I和EcoR I位点的HBcAg修饰基因mHBc重组克隆质粒pMD-mHBc ；将pMD-mHBc和pET_28a 分别用NcoI和HindIII酶切，构建含有BamH I和EcoR I酶切位点的mHBc重组原核表达 质粒 pET-mHBc ；第三步根据模拟IBDV多表位基因5印is以及HBcAg修饰基因表达质粒pET-mHBc的 双酶切位点和阅读框，设计弓丨物，并分别在正、反向引物的5'端加上酶切位点BamH I和EcoR I 正向引物 5 ‘ -GCGGATCCCATGCCTAAGACTCATAATTCTGGTC-3 ‘ 反向引物 5 ‘ -GCGAATTCAAACCAATTAGTAAAACCATGCCCATG-3 ‘以pET-5印is为模板，用PCR方法在5印is基因的5'和3'端分别加入BamH I和 EcoRI酶切位点，构建5印is亚克隆质粒pMD-5印is ；将pET-mHBc与pMD-5印is分别用BamH I禾口 EcoR I双酶切，回收pET-mHBc片段和 5印is片段，用T4 DNA连接酶连接，转化E. coli TOPlO感受态细菌，获得IBDV抗原表位嵌 合基因 mHBc-5epis 表达质粒 pET-mHBc_5epis。第四步将pET-mHBc-5印is转化宿主菌E. coli BL21 (DE3)，涂布1. 5%琼脂LB平板该 平板含卡那霉素100 μ g/mL，挑取单菌落接种于含卡那霉素100 μ g/mL的LB液体培养基中， 370C，200r/min振摇16h，再按1 %的体积吸取菌液接种于含卡那霉素100 μ g/mL的LB液 体培养基中，37°C，200r/min振摇至菌液A6tltl = 0. 6 0. 8，加IPTG至终浓度为lmmol/L， 37°C，200r/min,诱导培养4h，收集重组菌培养物，获得IBDV抗原表位5印is与HBcAg嵌合 基因病毒样颗粒重组蛋白。
4.权利要求2或3所述嵌合基因重组蛋白在IBD新型检测试剂或基因工程疫苗方面的 应用。
全文摘要
本发明涉及IBDV抗原表位与HBcAg嵌合基因的分子设计，属于生物制药领域。运用重叠延伸PCR技术，构建HBcAg修饰基因表达质粒pET-mHBc。将传染性法氏囊病病毒多表位基因5epis定向插入到该表达质粒mHBc基因中，获得表达质粒pEt-mHBc-5epis，在大肠杆菌中表达。重组嵌合蛋白的分子量约29kDa，表达量约占菌体总蛋白的47.6％；呈病毒样颗粒直径约60nm～80nm；抗原效价达到2.0×102。本发明构建成功5epis与HBcAg嵌合基因，在大肠杆菌中高效表达了具有IBDV抗原反应性的重组嵌合蛋白并形成了病毒样颗粒，具有成为颗粒化表位型IBD基因工程疫苗的应用前景。
文档编号C12N15/62GK101818162SQ20091023240
公开日2010年9月1日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者刘小娟, 唐雨德, 欧阳伟, 王忠灿, 王晓丽, 王永山, 诸玉梅 申请人:中国人民解放军南京军区军事医学研究所;江苏省农业科学院