专利名称：一种新橙皮苷的高通量酶法合成方法
技术领域：
本发明涉及食品添加剂领域，特别涉及低热值甜味剂新橙皮苷二氢查耳酮(NHDC) 的酶法合成，具体是提供了一种新橙皮苷(NH)的高通量酶法合成方法。
背景技术：
NHDC是一种安全的低热值甜味剂(蔗糖甜度的1500 1800倍)和苦味抑制 剂，热稳定性好，应用pH范围广，在食品和医药领域广为使用，常以新橙皮苷为前体通过 酶法或化学法合成(中国发明专利ZL02806186、 ZL200510055397和ZL200410042658)。 在其合成中，底物NH来源受限是主要的技术瓶颈。NH既可从枳实和枳壳中提取(中 国发明专利ZL200710111229、 ZL200810036498、 ZL200410025729、 ZL200710017735和 ZL200310112480)，也可通过柚皮苷转化而来(中国发明专利03124495)，但是这两种原 料在中国都极为有限。另一方面，在2007年中国柑橘种植面积(191万公顷)和产量 (2095吨)分别跃居世界第一，柑橘加工产业中富含大量橙皮苷的橙皮废弃物(约占果 重的1/3，90%橙皮所含黄烷酮中都是橙皮苷占优势，约占果皮重的7%，见中国发明专利 ZL200710034378)和工业废水需要处理(含橙皮苷约1% )。因此，以来源广泛的橙皮苷向 其同分异构体新橙皮苷的高效转化，是值得关注的课题既可解决市场前景广阔的甜味剂
NHDC合成前体NH来源问题，又可解决中国柑橘废弃橙皮和加工废水的处理和资源利用问 题。 研究报道的橙皮苷向NH的转化方法主要有一种是酶法，以橙皮苷酶酶解橙皮苷 为葡萄糖基橙皮素糖苷(HG)，再以为葡萄糖基转移酶作用HG得橙皮素，再把橙皮素接技 新橙皮糖后即可，相应中国发明专利ZL200610052962、 ZL200610051963 ;另一种是水解， 即以高温酸水解橙皮苷为GH，再把GH分离后按酶法合成新橙皮苷，相应中国专利包括 ZL200810099008。上述技术存在如下问题 (1)底物橙皮苷水溶性差，即使在8(TC高温下也只是微溶(小于lg/L)，影响橙皮
苷酶酶解效率。虽然国内已有关于水溶性橙皮苷制备的专利方法(如添加磺酸基、金属离
子配位或是甲基化等)，但都是以提高橙皮的生物活性或是拓展橙皮苷的应用范围为目的，
而不是以改进新橙皮苷的制备方法为目的，而且水溶性橙皮苷的分子结构和化学基团都已
发生变化，成为另一种物质，不一定适合于新橙皮的酶法或化学法制备。 (2)在高温下对橙皮苷进行水解，水解副产物多，包括橙皮素、芸香糖、鼠李糖、葡
萄糖、葡萄糖基橙皮素等，使得目的产物GH的分离纯化困难，还产生大量工业废水需要处理。 (3)由于酶解反应效率低，或是橙皮苷化学法水解的分离纯化过程复杂，上述二种 方法都难以工业化。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，通过配位改性制备水溶性橙皮苷金属配合物，再以此为底物，利用反应条件温和、副反应少、易于工业化的固定化橙皮苷酶和鼠李 糖基转移酶，高通量酶法制备目的产物NH，解决长期以来甜味剂NHDC合成前体(NH)来源受 限的技术瓶颈问题，提出一种解决中国柑橘工业废弃橙皮的环境污染和高值化资源利用问 题的新方法。 本发明的目的通过下述技术方案实现 —种新橙皮苷的高通量酶法合成方法，包括下述步骤 (1)橙皮苷与金属离子溶液通过配合反应制备橙皮苷金属配合物水溶液； (2)加固定化橙皮苷酶到步骤(1)所得橙皮苷金属配合物水溶液中，发生酶解反
应，得橙皮苷酶解产物； (3)加固定化鼠李糖基转移酶l，2-RhaT到步骤(2)所得橙皮苷酶解产物中，发生 酶解反应，得到新橙皮苷盐； (4)去除步骤(2)所得新橙皮苷盐中的金属离子，得新橙皮苷。 作为优选，所述橙皮苷金属配合物常温下的溶解度在1. 85g/L以上。 作为优选，步骤(1)中，所述配合反应的介质要求是50% 80%甲醇，配合反应温
度为40°C 85°C。 作为优选，步骤(2)中，所述酶解反应的温度为45t: 65t:，反应体系pH值为2 4，反应时间为20min 60min。 作为优选，步骤(3)中，所述酶解反应的反应温度为25t: 35t:，反应时间为 24h 48h。 上述方法中，所述金属配合物中所用金属离子优选能与氨水络合，并在碱性条件 下可生成沉淀。此种条件下，步骤(4)中，所述的去金属离子化，就可以通过氨水和新橙皮 苷与金属离子的竞争络合，并在pHll. 5 13下通过曝气吹氨氮法沉淀金属离子来实现。
上述方法中，步骤(1)所述的配合反应完成后要求回收有机溶剂，不要求回收水 分。步骤(2)和(3)中橙皮苷酶和鼠李糖基转移酶l，2-RhaT是以固定化的形式使用，固 定化的方法可参考以下两篇文献1、盛雪飞等，橙皮苷改性技术研究进展，食品与发酵工 业，2008，34(9) :109-112 ;2、 Ah證Frydman， et al. ， Metabolic Engineering of Plant Cells for Biotransformation of Hesperedin intoNeohesperidin， a Substrate for Production of the Low—Calorie Sweetener and FlavorEnhancer NHDC. ， J. Agric. Food Chem. ，2005,53(25) :9708-9712.。步骤(2)和(3)中，根据酶活确定底物添加量。步骤(2) 的酶解产物不需分离，直接用作步骤(3)中鼠李糖基转移酶的作用底物。
本发明两步酶解反应的基本原理橙皮苷酶作用位点为橙皮苷糖基中的鼠李糖和 葡萄糖之间的糖苷键，而橙皮苷与铜等金属离子配位后，不仅没有改变橙皮苷中的鼠李糖 和葡萄糖之间的糖苷键，相反通过金属离子配位对非水溶性的橙皮素的"集中效应"，是水 溶性糖基部分暴露在外，提高橙皮苷水溶性，更有利于酶解。鼠李糖基转移酶1，2-RhaT来 自烟草或胡萝卜植物细胞，可在25t: 35t:连续使用24h 48h，其作用底物为水相中的鼠 李糖和葡萄糖基橙皮素糖苷(HG)金属配合物，产物为新橙皮苷金属配合物。
本发明与现有技术相比，具有如下优点 (1)酶作用底物是橙皮苷金属配合物，水溶性明显提高，提高了酶作用效率，为中 药废弃橙皮的高附加值利用开辟新途径。
(2)原料来源广、成本低廉、反应条件温和、操作简便、无环境污染、酶回收容易，适 合NHDC特别是新橙皮苷的工业化生产应用。 (3)酶反应产物不需分离，节约了产物分离纯化成本。例如橙皮苷酶解产物HG金
属配合物和鼠李糖不需分离，直接用作鼠李糖基转移酶为1，2-RbaT作用底物。 (4)縮短了反应路径。按传统方法，橙皮苷酶解后要合成新橙皮苷还需三步①产
物HG和鼠李糖分离；②HG经葡萄糖酶解去葡萄糖，得橙皮素；③橙皮素和新橙皮糖接枝。
本发明直接把HG-Cu和鼠李糖结合得新橙皮苷，虽然后面存在NH3竞争络合和曝气脱NH3以
去配位，但都是极其简易的步骤。
图1是本发明橙皮苷酶法转化为新橙皮苷的技术路线图(方法中金属离子以Cu2+ 为例)。
具体实施例方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施不限于 此。 实施例1 如图1所示，实现橙皮苷向新橙皮苷的高通量酶法转化新方法，主要通过以下四
步来是实现橙皮苷与金属离子的配对a)、橙皮苷金属配合物的橙皮苷酶酶解(n)、橙皮
苷酶解产物的生物转化，即新橙皮苷金属配合物的高通量酶法合成(III)和新橙皮苷金属 配合物的去配位(IV)。 用80%甲醇配置6X 10—3mol/L橙皮苷和3X 103mol/L CuCl2溶液，在40。C水浴中 密闭反应lh，旋转蒸发回收甲醇和HC1，得橙皮苷铜配合物水溶液，浓度1. 85g/L，比橙皮苷 的溶解度高出IOO倍以上(1)。以戊二醛交联法固定化橙皮苷酶，作用上述橙皮苷金属配合 物水溶液，反应温度为45°C，反应pH4. 0，反应时间60min，此时反应产物在200nm 400nm 下以紫外可见光谱扫描，不再出现橙皮苷铜配合物在382nm处的特征吸收峰。酶解产物不 需分离，直接用作鼠李糖基转移酶作用底物(11)。同样以戊二醛交联法固定化来自烟草或 胡萝卜植物细胞的鼠李糖基转移酶l，2-RhaT，在35t:下作用上述橙皮苷酶解产物，即水相 中的葡萄糖基橙皮素糖苷(HG)金属配合物和鼠李糖，该固定化酶可连续使用24h，产物为 新橙皮苷铜配合物(III)。新橙皮苷铜配合物在室温下和过量氨水混合，通过氨水的竞争络 合，使新橙皮苷去配位，再加片碱调节pH13，曝气吹氨氮至不再产生Cu (OH) 2沉淀为止，过滤 后即使可得新橙皮苷配合物水溶液，去水分后即可得目的产物新橙皮苷(IV)(请提供该产 物的化学分析数据？)，实现由橙皮苷向新橙皮苷的高通量酶法转化，无需针对酶解产物的 复杂分离纯化过程。
实施例2 实施例2和实施例1类似。不同之处在于将步骤I中的甲醇浓度调整为50%， 由Cu (N03) 2提供Cu2+和橙皮苷配位，反应温度调整为85°C ;将步骤II中的橙皮苷酶作用温 度调整为65t:，反应pH调整为2. O，此时反应时间仅需20min，说明此条件下酶活比实施例 l高；将步骤(III)中鼠李糖基转移酶l，2-RhaT作用温度调整为25°C，此固定化酶同样可重复使用24小时；将步骤IV中曝气吹氮的pH调整为11. 5，也可沉淀铜氨络合物中Cu2+'，
实现橙皮苷向新橙皮苷的高通量酶法转化。
实施例3 用70%甲醇配置6X 10—3mol/L橙皮苷和3X 103mol/L FeCl2溶液，在65。C水浴中 密闭反映lh，旋转蒸发回收甲醇和HC1，得橙皮苷-亚铁配合物水溶液，浓度2. 01g/L，比橙 皮苷的溶解度高出110倍以上(1)。以戊二醛交联法固定化橙皮苷酶，作用上述橙皮苷亚 铁配合物水溶液，反应温度为55°C ，反应pH3. 0，反应时间40min，此时反应产物在200nm 400nm下以紫外可见光谱扫描，不再出现橙皮苷亚铁配合物在380nm附近处的特征吸收峰。 酶解产物不需分离，直接用作鼠李糖基转移酶作用底物(11)。同样以戊二醛交联法固定化 来自烟草或胡萝卜植物细胞的鼠李糖基转移酶l，2-RhaT，在3(TC下作用上述橙皮苷酶解 产物，即水相中的葡萄糖基橙皮素糖苷亚铁配合物和鼠李糖，该固定化酶可连续使用48h， 产物为新橙皮苷亚铁配合物(III)。新橙皮苷亚铁配合物在室温下和过量氨水混合，通过氨 水的竞争络合，使新橙皮苷去配位，再加片碱调节PH12. 5，曝气吹氨氮至不再产生Fe (OH) 2 沉淀为止，过滤后即使可得新橙皮苷配合物水溶液，去水分后即可得目的产物新橙皮苷 (IV)，实现由橙皮苷向新橙皮苷的高通量酶法转化，无需针对酶解产物的复杂分离纯化过 程。 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种新橙皮苷的高通量酶法合成方法，其特征在于包括下述步骤(1)橙皮苷与金属离子溶液通过配合反应制备橙皮苷金属配合物水溶液；(2)加固定化橙皮苷酶到步骤(1)所得橙皮苷金属配合物的水溶液中，发生酶解反应，得橙皮苷酶解产物；(3)加固定化鼠李糖基转移酶1，2-RhaT到步骤(2)所得橙皮苷酶解产物中，发生酶解反应，得到新橙皮苷盐；(4)去除步骤(2)所得新橙皮苷盐中的金属离子，得新橙皮苷。
2. 根据权利要求书1所述的新橙皮苷的高通量酶法合成方法，其特征在于步骤(1) 中，所述橙皮苷金属配合物常温下的溶解度在1. 85g/L以上。
3. 根据权利要求书1所述的新橙皮苷的高通量酶法合成方法，其特征在于步骤(1) 中，所述配合反应的介质为50% 80%甲醇，温度为40°C 85°C。
4. 根据权利要求书1所述的新橙皮苷的高通量酶法合成方法，其特征在于步骤(2) 中，所述酶解反应的温度为45t: 65t:，反应体系pH值为2 4，反应时间为20min 60min。
5. 根据权利要求书1所述的新橙皮苷的高通量酶法合成方法，其特征在于步骤(3)中，所述酶解反应的温度为25°C 35t:，反应时间为24h 48h。
6. 根据权利要求1 5中任一项所述的新橙皮苷的高通量酶法合成方法，其特征在于 步骤(1)中，所述金属离子溶液中所用金属离子能与氨水络合，在碱性条件下生成沉淀。
7. 根据权利要求6所述的新橙皮苷的高通量酶法合成方法，其特征在于步骤(4)中， 所述去除步骤(2)所得新橙皮苷盐中的金属离子，是通过氨水和新橙皮苷与金属离子的竞 争络合，并在pHll. 5 13下通过曝气吹氨氮法沉淀金属离子。
全文摘要
本发明公开了一种新橙皮苷的高通量酶法合成方法，该方法包括橙皮苷的金属配位，以橙皮苷酶和鼠李糖基转移酶1，2-RhaT实现橙皮苷金属配合物向新橙皮苷的生物转化和新橙皮苷金属配合物去配位的步骤。该方法适用于低热值甜味剂NHDC的工业化生产，克服向新橙皮苷生物转化时橙皮苷水溶性差的技术瓶颈，实现NHDC合成前体新橙皮苷的高通量酶法合成，解决NH来源受限问题，同时为工业废弃橙皮的资源利用和橙皮苷的高附加值化开辟了新途径。
文档编号C12P19/60GK101709316SQ200910193529
公开日2010年5月19日 申请日期2009年10月30日 优先权日2009年10月30日
发明者于淑娟, 何树珍, 朱思明 申请人:华南理工大学