专利名称：人源化重组尿酸酶及其突变体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及DNA重组技术和药物领域。更具体地，本发明涉及含有部分人源尿酸 酶氨基酸序列的具有酶活的哺乳动物来源尿酸酶的嵌合蛋白及其突变体蛋白，编码该嵌合 蛋白及其突变体的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用于基因工程制 备该蛋白的方法，以及该蛋白在高尿酸血症及其引起的通风的治疗的应用。
背景技术：
痛风是一种由嘌呤代谢紊乱所引起的疾病，早在公元前5世纪，希腊名医希波克 拉底就已记载了它的症状(Emmerson B T. N Engl J Med. 1996 ；334 ；445-451.)，其临床特 点为高尿酸血症，并因尿酸盐沉积在皮下、关节、肾脏而形成痛风石。人体内的嘌呤经过一 系列变化，最终形成的产物为尿酸，人体内血液尿酸浓度超过70mg/L时，便可引起高尿酸 血症，5%-12%的高尿酸患者可发展为痛风。在血液或滑囊液中，当尿酸钠浓度达到饱和状 态，即可形成尿酸钠盐的微晶体，导致痛风性关节炎(Nancy J G，Susan J K，Edna S，John S S etal. Arthritis Res Ther. 2005 ;8 (1)，R12)。随着时间的增长，慢性高尿酸血症也能 在关节周围、软组织中以及在某些器官里沉积产生破坏性的结晶尿酸沉积物，即可导致痛 风性急性关节炎、痛风石性慢性关节炎和关节畸形。而肾脏损害被认为是痛风的第二常见 临床表现。由慢性高尿酸血症渐进性，导致髓质、肾小管及肾间质内尿酸盐沉积，刺激局部， 引起炎症反应，称为慢性尿酸盐肾病；严重的高尿酸血症病人(如某些恶性肿瘤，特别是白 血病和淋巴瘤患者)，在短期内可有大量尿酸沉积于肾脏集合管、肾盂、肾盏及输尿管，造成 管腔阻塞、尿闭而引起急性肾功能衰竭(又称尿酸肾病)(Hershfield M S. Cecil Textbook of Medicine (20th). 1508-1515.)。如果对于上述症状的治疗不彻底还可导致并发痛风性 冠心病、高血脂等疾病。近几十年来，随着人们饮食和生活习惯的改变，高蛋白和高嘌呤食物摄取增加， 痛风患者的数量逐年增加。在欧洲，痛风患者的数量在过去的20年中增长了一倍(Jones D P, Staphleton F B, Kalwinsky D et al. Med Pediatr Oncol. 1990. 18 :283-286)。在 1998年的关于黄浦江流域的痛风病调查中，高尿酸血症发病率上升为10. 1%，通风发病率 为0. ；34%，介于美国20世纪80年代到20世纪90年代通风发病率(0. 275% -1.000% ) 之间(Chen S, Du H, Wang Y et al. Clin Med J. 1998. 111(3) :228-230) 如果高尿酸血 症没有出现临床症状，控制饮食即可；当出现了由其引起的临床症状时，则需要进行药物治 疗。目前临床使用的常规治疗手段包括镇痛消炎类药物，如秋水仙碱(colchicine)、布洛 芬(buprofen)、萘普生(naproxen)等，它们主要用于控制痛风性关节炎的急性发作症状， 消除关节局部疼痛、肿胀及炎症；促进尿酸排泄的促尿酸尿剂(如果肾功能降低则无效)， 如羧苯石黄胺(probenicid)、苯石黄唑酮(sulfinpyrazone)、苯溴马龙(benzbromarone)等； 抑制尿酸合成药物，如别嘌呤醇(allopurinol)。在患有痛风石性痛风、肾功能不全、白血 病和某些遗传病的病人方面，别嘌呤醇是主要的治疗药物，它能抑制黄嘌呤氧化酶，使次 黄嘌呤及黄嘌呤不能转换为尿酸，其本身则在人体内逐渐氧化，生成易溶于水的异黄嘌呤(oxipurinol)经尿排出。然而，所有的常规疗法很难治愈已形成痛风石的慢性痛风的患者。 此外，在长期服用上述药物以后，患者不可避免出现白细胞减少、心脏功能受损、肝肾功能 受损、刺激肠胃系统、再生障碍性贫血导致糖尿、痛风等并发症。人高尿酸血症与人在进化过程中尿酸酶基因突变失活有关，突变在人尿酸酶基因 编码序列中引入了提前终止密码子(Wu X，Lee C C,Muzny D Μ, Caskey C Τ. Proc Natl Acad SciUSA. 1989. 86 :9412-9416.)，人类因此不能自身合成活性尿酸酶，使得人的嘌呤分解代 谢终止于尿酸(Wu X，Muzny D M，Lee C C, Caskey C Τ. J Mol Evo 1. 1992. 34 :78-84.)。在 非人类灵长目动物和其他哺乳动物的肝过氧化物酶体中的活性尿酸酶可将溶解性较低的 尿酸盐( llmg/100ml水)转变为更易溶的尿囊素( 147mg/100ml水)，并能由肾更有 效的排泄(ffortmann R L,Kelley W N. Kelley's textbook of rheumatology(6th). 2001 1339-1376)。在欧美，由黄曲霉(Aspergillus flavus)制备的尿酸酶⑴ricozyme)在治 疗与肿瘤化疗有关的严重高尿酸血症方面的时间已达10年以上(Zittoun R, Dauchy F， Teilaud C, Barthelemy M, Bouchard P. Ann Med Interne. 1978. 127 :479-482.)；由法国 Sanofi公司研制的由啤酒酵母发酵生产的重组黄曲霉尿酸酶药物ELITEK已于2002年通 过FDA认证并用于由肿瘤化疗引起的严重高尿酸血症的短期治疗(Pui C H,Relling M V, Lascombes F, HarrisonP L, Struxiano A et al. Leukemia. 1997. 11 1813-1816.),同时， 证明ELITEK的输注还可以减小痛风石的体积(Potaux L,Aparicio M,Maurel C,Ruedas M E, Mart in C L. Nouv PresseMed. 1975. 4 :1109-1112.)。尿酸酶(Ε C 1. 7. 3. 3)广泛存在于微生物(苛求芽孢杆菌、单假丝酵母、黄曲霉)、 植物(大豆、鹰嘴豆)、动物(猪、牛、狗、狒狒)中(Suzuki K，Sakasegawa S，Misaki H， SugiyamaM. J Biosci Bioeng. 2004. 98 153-158)，在氧气存在的情况下它能催化尿酸氧 化尿囊素并放出二氧化碳(Retailleau P, Colloc' h, Denis V, Francoise B. Acta Cryst D. 2004. 60 :453-462.)。具有活性的尿酸酶是一四聚体蛋白，由相同的亚基组成，每个亚基分子量在34kD 左右，由301-304个氨基酸组成。每个溶液中尿酸酶的酶活力最高的pH值为8. O (Bayol A etal. Biophys Chem. 1995. 54 =229-235.) 在目前所知的所有来源的尿酸酶中，活性最 高的来源于黄曲霉，达到27IU/mg;其次是来源于苛求芽胞杆菌，它的活性保持在13IU/ mg(HuangS H, Wu T K. Eur J Biochem. 2004. 271 :517-523.)。另外，来源于豆类植物的 尿酸酶，其活性只有2-6IU/mg ；来源于哺乳动物的尿酸酶，经过重组表达以后，猪的尿酸 酶活性可以达到5IU/mg，狒狒的尿酸酶酶活性只有lIU/mg (Michael H，Susan J. K. 2006. US7056713B1)，而人源尿酸酶无活性。作为人体应用，微生物尿酸酶的高活性和哺乳动物尿酸酶的低免疫原性，使得这 两大来源的尿酸酶成了目前开发应用的重组尿酸酶的研究热点。但黄曲霉来源的尿酸酶与 推测出的人源尿酸酶的同源性不足40% (Lee C C, Wu X，Gibbs R A，Cook R G, Muzny D Μ, CaskeyC Τ. Science. 1988.239 :1288_1四1.)，人体易产生抗尿酸酶抗体，黄曲霉尿酸酶的 功效迅速减弱，同时引发严重过敏性反应，无法用于长期治疗。人类尿酸酶基因因突变而失 去活性，成为假基因。如果将其改造，恢复其降解尿酸的酶活性，必能降低酶的免疫原性，但 人源尿酸酶基因在进化过程中，由于缺乏选择压力，累积了部分错义突变，本发明人进行了 多种氨基酸的突变以恢复其尿酸酶活性，均未成功。
在有关哺乳动物尿酸酶的公开专利和文献中，杜克大学(Duke University)和山 景公司(Mvient)进行了猪来源和狒狒来源嵌合尿酸酶研究(Michael H, Susan J. K. 2006. US7056713B1)。该研究的方法是在保证酶活性不明显减少的情况下，将猪全长尿酸酶序列 中的1-9个精氨酸置换为赖氨酸，从而有利于随后的PEG修饰，PEG化的猪狒狒尿酸酶嵌合 蛋白实现了在人体适用中降低免疫原性的目标。本发明提供了另一全新的哺乳动物来源尿酸酶的C末端通过引入部分人源尿酸 酶氨基酸序列后，在不影响其酶催化活性的同时，降低了在人体中的免疫原性。通过一系列 的研究证实，该种形式哺乳动物尿酸酶及其突变体具有更高的体内稳定性，适合作为治疗 高尿酸血症等相关疾病的药物或药物组合物。发明目的本发明的目的就是提供新型的哺乳动物尿酸酶蛋白，即含有部分人源尿酸酶氨基 酸序列的具有酶活的哺乳动物来源尿酸酶的嵌合蛋白及其突变体蛋白。本发明的另一目的是提供编码所述嵌合蛋白及其突变体蛋白的DNA分子、含该 DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞。本发明的另一目的是提供一种成本低廉和/或步骤简便的生产所述有部分人源 尿酸酶氨基酸序列的具有酶活的哺乳动物来源尿酸酶的嵌合蛋白及其突变体蛋白。本发明的另一目的是提供一种可以降低血液尿酸浓度的蛋白药物，可用于高尿酸 血症及其引起的通风的治疗。发明概述在本发明的第一方面，提供了一种嵌合蛋白，它包括含有部分人源尿酸酶氨基 酸序列的具有酶活的哺乳动物来源尿酸酶的嵌合蛋白及其突变体蛋白。更具体的，该嵌合 蛋白的N端前240个氨基酸为猪、狗、牛、等哺乳动物来源尿酸酶蛋白第1-240位氨基酸， 剩下的64个氨基酸为人源尿酸酶的第M1-304位氨基酸。所述嵌合蛋白的突变体蛋白 包含以下至少一种突变第245位亮氨酸被组氨酸取代，第246位丝氨酸被苏氨酸取代， 第248位丝氨酸被甘氨酸取代，第249位精氨酸被谷氨酰胺取代，第252位丙氨酸被谷氨 酸取代，第253位异亮氨酸被甲硫氨酸取代，第266位苯丙氨酸被亮氨酸取代。更优的， 突变体蛋白选自下述具有2-5种突变的序列SM6T-S248G-R249Q ；L245H-A252E-I253M ； S246T-S2486-R249Q-F266L ；L245H-A252E-I253M-F266L(突变用三联体表示字母-数 字-字母，其中的数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变设计的氨基酸，数字 后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸，其中L代表亮氨酸、S代表丝氨酸、T代表苏 氨酸、G代表甘氨酸、Q代表谷氨酰胺、A代表丙氨酸、E代表谷氨酸、I代表异亮氨酸、M代 表甲硫氨酸、F代表苯丙氨酸、R代表精氨酸)。本发明同样提供了上述嵌合蛋白及其突变 体蛋白的C末端或/和N末端截断的形式。更优的，N末端截断1-7个氨基酸，C末端截断 1-3个氨基酸，这种缺失截短形式具有更好的不易降解的稳定性。在本发明的第二方面，提供了一种DNA分子，它编码本发明上述的嵌合蛋白及其 突变体蛋白。在本发明的第三方面，提供了含有上述DNA分子的表达载体，以及构建该表达载 体的方法。在本发明的第四方面，提供了包含上述表达载体的宿主细胞以及可能的转化或转染的方法。 在本发明的第五方面，提供了一种重组产生本发明嵌合蛋白及其突变体蛋白的方 法，它包括以下步骤在合适表达所述融合蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞，表达出所 述的融合蛋白；分离纯化所述的融合蛋白的方法。
在本发明的第六方面，提供了 一种该重组人源性尿酸酶嵌合蛋白及其突变体蛋白 的药物组合物，它包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效剂量的本发明的 嵌合蛋白。发明详述狗、猪、牛、羊等哺乳动物尿酸酶氨基酸与人源尿酸酶氨基酸同一性均在88%以 上，活性区域高度一致(附图1)。利用嵌合的方法，在具有酶活的哺乳动物尿酸酶氨基酸序 列中，通过替换引入部分不影响酶催化活性的人源尿酸酶氨基酸序列，可达到既保留非人 源哺乳动物尿酸酶活性，又增强与推导出的无活性人源尿酸酶同源性，从而实现降低人体 中免疫原性的目的。本发明人经过系统的研究，发现推导出的人源尿酸酶第M1-304位氨基酸对尿酸 酶活性无明显影响，将该序列与狗、猪、牛、羊等来源尿酸酶N端第1-240位氨基酸嵌合后， 形成的嵌合形式的人源化尿酸酶，其活性与狗、猪、牛、羊来源尿酸酶相比无酶催化活性降 低，但嵌合蛋白氨基酸序列与人源尿酸酶氨基酸序列同一性可以提高至91 %以上，将具有 降低引起免疫原性的风险。本领域众所周知，在研制重组蛋白质药物中需尽量克服蛋白的物理和化学不稳定 性。尿酸酶蛋白的高疏水性等生物物理性质决定了相对高浓度的蛋白质溶液(>5mg/ml) 处于非生理条件下(如高温或弱酸性PH值)时会加速其交联和聚集(即较差的物理稳定 性和不利于制备成生物制品的特性)。本发明人经研究发现，在本发明前述的人源化尿酸酶 氨基酸序列的基础上，经过2-5个氨基酸的突变，在保留原蛋白的高酶活性和低免疫原性 时，增强或改善了嵌合蛋白的理化性质(减少了疏水介导的聚集、提高了与溶剂的相容性、 增加了体外热稳定性、延长了体内代谢半衰期等)。已知哺乳动物尿酸酶蛋白C末端后三个氨基酸(SKL或SRL)为过氧化物酶体识 别位点(Satoshi MIURA, Toshiaki ODA, Tsuneyoshi FUNAI. Eur. J. Biochem. 1994. 223 141-146)，主要用于蛋白定位(在过氧化物酶体中)，对维持酶活性无贡献，目前的尿酸酶 结构研究发现，上述三个氨基酸突出在三维结构表面，容易被免疫系统识别，可能引起免疫 反应。因此，本发明通过重组技术缺失C末端三个氨基酸序列可以进一步降低蛋白的免疫 原性。位于N末端的前7个氨基酸在哺乳动物来源尿酸酶序列间同源性低，对维持酶活性 无影响，同理，本发明通过重组技术缺失N末端1-7个氨基酸序列同样实现降低该蛋白的免 疫原性。至此，本发明提供新型尿酸酶嵌合蛋白，它包括含有人源尿酸酶氨基酸序列和其 他哺乳动物来源尿酸酶氨基酸序列组成的嵌合蛋白及其突变体蛋白。如本文所用，术语“人源尿酸酶氨基酸序列”指所述嵌合蛋白中第M1-304位氨基 酸序列来源于人(SEQ ID No :1)，术语“哺乳动物尿酸酶序列”指所述嵌合蛋白中第I-MO 位氨基酸序列来源于猪(SEQ ID No :2)、狗(SEQ ID No :3)、牛(SEQ ID No 4)尿酸酶氨基 酸序列。优选的哺乳动物尿酸酶序列为狗源尿酸酶序列。
如本文所用，术语“突变体蛋白，，指在上述嵌合体蛋白氨基酸序列基础上经过一个 或几个氨基酸的置换、N末端或/和C末端截短而成具有相同生物活性的蛋白。突变体蛋白包含以下至少一种置换第245位亮氨酸被组氨酸取代，第246位 丝氨酸被苏氨酸取代，第248位丝氨酸被甘氨酸取代，第249位精氨酸被谷氨酰胺取代， 第252位丙氨酸被谷氨酸取代，第253位异亮氨酸被甲硫氨酸取代，第266位苯丙氨酸被 亮氨酸取代。更优的，突变体蛋白选自下述具有2-5种突变的序列SM6T-SM8G-RM9Q ； L245H-A252E-I253M ；S246T-S248G-R249Q-F266L ；L245H-A252E-I253M-F266L (突变用三联 体表示字母-数字-字母，其中的数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变设 计的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸)。本发明同样提供了上 述嵌合蛋白及其突变体蛋白的C末端或/和N末端截短的形式。更优的，N末端截短1至7 个氨基酸，C末端截短1至3个氨基酸。在本发明的一个优选实施方案中，提供了一种重组狗和人嵌合尿酸酶(代号 UHC)，该嵌合蛋白(SEQ ID No 5)的N端前240个氨基酸为狗源尿酸酶蛋白第1-240位氨 基酸，随后的64个氨基酸为人源尿酸酶的第M1-304位氨基酸，该序列与人源尿酸酶蛋白 氨基酸序列(SEQ ID No 1)同一性达到91.4%，同时催化活性为狗源尿酸酶蛋白的112%。在本发明的另一个优选实施方案中，突变体蛋白是指在嵌合蛋白UHC的基础上， 进行了以下至少一个氨基酸置换即第245位亮氨酸被组氨酸取代，第246位丝氨酸被 苏氨酸取代，第248位丝氨酸被甘氨酸取代，第249位精氨酸被谷氨酰胺取代，第252位 丙氨酸被谷氨酸取代，第253位异亮氨酸被甲硫氨酸取代，第266位苯丙氨酸被亮氨酸取 代。更优的，突变体蛋白选自下述具有2-5种突变的序列SM6T-SM8G-RM9Q(SEQ ID No 6) ；L245H-A252E-I253M(SEQ ID No 7) ；S246T-S248G-R249Q-F266L(SEQ ID No 8)； L245H-A252E-I253M-F266L (SEQ ID No :9)(突变用三联体表示字母-数字-字母，其中的 数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变设计的氨基酸，数字后的字母表示用 于置换数字前氨基酸的氨基酸)，上述突变体蛋白的物理化学性质与突变前相比均得到增 强(如减少疏水介导的聚集、提高与溶剂的相容性、增加体外热稳定性、延长体内代谢半衰 期等)。本发明也包括RNA形式或DNA形式的编码上述嵌合蛋白及其突变体蛋白的多核苷 酸形式，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及人工合成DNA。DNA可以为双链或单链。编码 本发明嵌合蛋白及其突变体蛋白的编码序列可由冗余或遗传密码的兼并而有所不同。本发明的编码上述嵌合蛋白突变体的多核苷酸序列可用本领域技术人员熟知的 DNA重组、PCR等各种技术来获得，例如包括，但不局限于本发明较佳实施方案中采用的两 轮交错延伸PCR法以及Strantagene的quick change中描述的定点突变方法。编码本发明嵌合蛋白及其突变体蛋白的多核苷酸可包括以下仅该嵌合蛋白及其 突变体蛋白的编码序列、嵌合蛋白及其突变体蛋白编码序列及额外的编码序列(如前导或 分泌序列或前蛋白质序列)；嵌合蛋白及其突变体蛋白的编码序列及非编码序列(如内含 子，或突变蛋白编码序列5’和/或3’端的非编码序列)。因此，术语“编码嵌合蛋白及其 突变体蛋白的多核苷酸”所指的多核苷酸可能不仅含有嵌合蛋白及其突变体蛋白的编码序 列，还含有包括额外编码序列和/或非编码序列的多核苷酸。将本发明的多核苷酸与相应表达载体进行有效连接后，转化或转导入宿主细胞中表达。上述载体可以以附加体或整合到宿主染色体的形式在宿主生物中进行复制。在适当 的启动子控制下，尿酸酶嵌合蛋白及其突变体蛋白可以在哺乳动物细胞、昆虫、酵母、细菌 或其它细胞中表达，也可以利用本发明DNA构建体衍生的RNA、通过无细胞翻译系统产生所 述蛋白质。优选的，选择大肠杆菌克隆本发明的多核苷酸。其他适用的微生物宿主包括枯 草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)、沙雷氏菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)和 葡萄球菌属(Maphylococcus)等。也可以在这些原核宿主中制备表达载体，还可能具有众 多公知启动子中的任一种，如乳糖启动子系统、色氨酸启动子系统、β内酰胺酶启动子系统 或噬菌体λ或Τ7来源的启动子系统。通常这些启动子会控制表达，且具有核糖体结合位 点序列等，以便起始和完成转录及翻译。酵母或真菌等的其他微生物也可用于表达。优选的酵母宿主为毕赤酵 母(Pichiapastoris) > S Sl # (Saccharomyces cerevisiae) > ^ S ^ M Sl # (Schizosaccharomycespombe)以及嗜甲醇毕赤酵母(Pichia angusta)。真菌宿主包括黑 曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)及裂裙菌(Schizophyllum commune)，但也可选择使用其他真菌。哺乳动物细胞培养也可用于表达生产本发明的蛋白。优选的细胞包括CH0细胞 系、多种COS细胞系、NSO细胞、叙利亚地鼠(Syrian Hamster)卵巢细胞系、Hela细胞或人 胎肾细胞系(即HEK293、HEK29犯BNA)。可以通过公知的方法将含有目的多核苷酸序列(如尿酸酶嵌合蛋白及其突变体 蛋白以及表达控制序列)的载体转移到宿主细胞内，所采用的方法取决于细胞宿主的类 型。例如，对原核细胞通常采用氯化钙转染法，而对于其他细胞宿主可以使用磷酸钙处理或 电穿孔法。如前获得的本发明重组尿酸酶嵌合蛋白及其突变体蛋白可以从宿主细胞内部或 外部(如培养基)分离得到，且纯化为高纯度的均一蛋白。此种蛋白分离纯化的方法不限 于任何特定方法。事实上，可用任何本领域已公知的方法，例如柱层析法、过滤法、超滤法、 盐析法、等电点沉淀法、透析法等。对于层析，例如亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶 过滤层析、反相层析、吸附层析等都可以应用。这些层析可用液相层析如HPLC和FPLC来操 作。可用通用的蛋白检测方法检测蛋白浓度和纯度，例如HPLC法、SDS-聚丙烯酰胺电泳法、 等电点电泳法、BCA法、Lowry法、Western Blot法等。因此，本发明可提供高纯度重组的尿 酸酶嵌合蛋白及其突变体蛋白。至此已对本发明进行了详细描述，参照以下实例能够对之有更清楚的理解，所述 实例仅为说明目的而并不旨在对本发明进行限制。说明书
附图1 不同哺乳动物来源尿酸酶氨基酸序列比对图附图2 =UHC嵌合蛋白重组表达SDS-PAGE电泳图谱(从左起，条带1 :marker，条带 2 诱导前对照，条带3 诱导4小时)附图3 交错延伸PCR示意图附图4 纯化后UHC嵌合蛋白SDS-PAGE电泳图谱(A，从左起，条带1 :marker，条带 2 =UHC纯化后蛋白)和反相HPLC图谱(B)附图5 纯化后UHC嵌合蛋白质谱分子量图
具体实施例方式实例1人狗嵌合尿酸酶蛋白UHC在大肠杆菌中重组表达在本实施例中，所涉及的嵌合蛋白N端前240个氨基酸为狗来源尿酸酶序列，第 241-304为人源尿酸酶氨基酸序列。根据上述氨基酸序列，并按照大肠杆菌偏爱的密码子， 委托宝生物(大连)有限公司进行全基因合成，其核苷酸序列分别为(Seq ID No 10) =CAT ATG GCC CAT TAT CAT AAT GAT TAT AAA AAA AAT GAT GAA GTT GAA TTT GTT CGT ACC GGT TAT GGTAM GAT ATG GTT AAA GTT CTG CAT ATT CAG CGT GAT GGT AAA TAT CAT TCT ATT AAA GAA GTT GCC ACCTCT GTT CAG CTG ACC CTG TCT TCT AAA AAA GAT TAT GTT TAT GGT GAT AAT TCT GAT ATT ATT CCA ACCGAT ACC ATT AAA AAT ACC GTT CAT GTT CTG GCC AM TTT MA GGT ATT AAA TCT ATT GAA ACC TTT GCCATG AAT ATT TGT GAA CAT TTT CTG TCT TCT TTT AAT CAT GTT ATT CGT GCC CAG GTT TAT GTT GM GAAGTT CCA TGG AAA CGT TTT GAA AAA AAT GGT GTT AAA CAT GTT CAT GCC TTT ATT CAT MT CCA ACC GGTACC CAT TTT TGT GM GTT GM CAG ATG CGT TCT GGT CCA CCA GTT ATT QVT TCT GGT ATT MA GAT CTGAAA GTT CTG AAA ACC ACC CAG TCT GGT TTT GAA GGT TTT ATT AAA GAT CAG TTT ACC ACC CTG CCA GAAGTT AAA GAT CGT TGT TTT GCC ACC AAA GTT TAT TGT AAA TGG CGT TAT CAT CAG GGT CGT GAT GTT GATTTT GAA GCC ACC TGG GAT ACC GTT CGT GAT ATT GTT CTG GAA AAA TTT GCC GGT CCT TAT GAT AAA GGTGAA TAT TCT CCA TCT GTT CAG AAA ACC CTG TAT GAT ATT CAG GTT CTG TCT CTG TCT CGT GTT CCA GCCATT GAA GAT ATG GAA ATT TCT CTG CCA AAT ATT CAT TAT TTT AAT ATT GAT ATG TCT AAA ATG GGT CTGATT AAT AAA GAA GAA GTT CTG CTG CCA CTG GAT AAT CCT TAT GGT AAA ATT ACC GGT ACC GTT AM CGTAM CTG TCT TCT CGT CTG TGA TAA GGA TCC将全基因合成的重组质粒扩增后，用Nde I和BamH I双酶切，回收目的片段，用 T4DNA连接酶与同样经Nde I和BamH I酶切回收的质粒pET_3C (Invitrogen)连接，利用如 《CurrentProtocols in Molecular Biology))中所述的标准方法将连接混合物转入大肠杆 菌克隆宿主菌DH5a。在LB/AMP平板上进行转化反应，过夜生长转化体后，挑取转化后单克隆菌落以制 备质粒用酶切和PCR验证的方法筛选重组质粒pET-3C-UHC，经DNA测序(TAKARA，大连)后 确定含有所需嵌合蛋白UHC cDNA的阳性重组质粒中尿酸酶序列与理论序列完全一致。将 上述测序正确的重组质粒转化大肠杆菌表达宿主菌并进行表达。使用大肠杆菌BL21(DE3)、BL21 Mar (DE3)或 BL21 Mar (DE3) plysS、表达 UHC 嵌 合蛋白。这些菌株仅是许多适用于表达嵌合蛋白中的一些，它们可以分别通过商业渠道自 Novagen, Invitrogen及Stratagen获得。利用转化体在含有AMP的LB平板上的生长能力 可将其鉴别出来。使含有UHC重组质粒的大肠杆菌表达重组菌在含有50um/ml的AMP的液体LB培 养基中培养过夜，将上述培养液接种大型的培养物，接种比例为1 25-1 200。待这些细 胞生长至600nm处光密度为一定值后，加入IPTG使其终浓度为0. 4mM诱导表达目标蛋白， 继续培养细胞3至12个小时。随后通过离心收获细胞，用50mM Tris缓冲液洗涤沉淀，离 心放置-20度保存，并进行SDS-PAGE检测(附图2)。
实例2人狗嵌合尿酸酶蛋白UHC突变体DNA构建以及在大肠杆菌中重组表达以UHC蛋白DNA序列为原始模板，用交错延伸PCR法突变制备含有目标突变的 DNA (附图；3)。下面以制备 S246T-S248G-R249Q 和 S246T-S248G-R249Q-F266L 为例进行说明
权利要求
1.一种人源化重组尿酸酶蛋白，其特征在于哺乳动物来源尿酸酶中含有部分人源尿酸 酶氨基酸序列的嵌合蛋白及其突变体蛋白。
2.如权利要求1所述的嵌合蛋白，其特征在于N端前240个氨基酸为哺乳动物来源尿 酸酶蛋白第1-240位氨基酸，剩下的64个氨基酸为人源尿酸酶的第M1-304位氨基酸。
3.如权利要求2所述的嵌合蛋白，其特征在于所述的哺乳动物包括狗、猪、牛。
4.如权利要求3所述的嵌合蛋白，其特征在于优选的哺乳动物为狗。
5.如权利要求1所述的嵌合蛋白突变体蛋白，其特征在于将权利要求2所述的嵌合 蛋白经一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同活性的突变蛋白。
6.如权利要求5所述的突变体蛋白，其特征在于它包含以下至少一种突变 -第245位亮氨酸被组氨酸取代。-第246位丝氨酸被苏氨酸取代。 -第248位丝氨酸被甘氨酸取代。 -第249位精氨酸被谷氨酰胺取代。 -第252位丙氨酸被谷氨酸取代。 -第253位异亮氨酸被甲硫氨酸取代。 -第266位苯丙氨酸被亮氨酸取代。
7.如权利要求5所述的突变体蛋白，其特征在于它选自下述具有2-5种突变的突变体 蛋白，各突变用三联体表示字母-数字-字母，其中的数字表示突变氨基酸的位置，数字前 的字母对应突变设计的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸S246T-S248G-R249Q L245H-A252E-I253M S246T-S248G-R249Q-F266L L245H-A252E-I253M-F266L
8.如权利要求5所述的突变体蛋白，其N端可截短1至7个氨基酸序列。
9.如权利要求5所述的突变体蛋白，其C端可截短1至3个氨基酸序列。
10.DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1-8中任一项尿酸酶蛋白。
11.表达载体，其特征在于，它含有权利要求10中所述的DNA分子。
12.宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求11中所述的表达载体。
13.如权利要求12中所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包括大肠杆菌细胞、酵母细 胞、CHO细胞。
14.产生权利要求1中所述的融合蛋白的方法，其特征在于，它包括步骤 在权利要求12的宿主细胞中表达所述蛋白；分离、纯化所述蛋白。
15.药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效剂 量的权利要求1的蛋白。
16.如权利要求15中所述的药物组合物，其特征在于，用于治疗具有高尿酸血症及其 引发的通风的病人。
全文摘要
本发明提供了含有部分人源尿酸酶氨基酸序列的具有酶活的哺乳动物来源尿酸酶的嵌合蛋白及其突变体蛋白，以及编码该嵌合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该嵌合蛋白及其突变体蛋白的方法和药物组合物。本发明的嵌合蛋白及其突变体蛋白保留了哺乳动物来源尿酸酶活性，能降低人体适用的免疫原性。同时增强或改善了哺乳动物来源尿酸酶蛋白的理化性质，更适用于高尿酸血症及其引起的痛风的治疗。
文档编号C12N9/06GK102051348SQ200910191240
公开日2011年5月11日 申请日期2009年10月27日 优先权日2009年10月27日
发明者张淳, 梅翔, 胡春兰, 范开, 马雪丰 申请人:重庆富进生物医药有限公司