水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法

专利名称：：水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及水稻纹枯病菌融合群判定的鉴别方法。
背景技术：
："民以食为天，食以稻为先"。水稻是我国主要的粮食作物，在我国国民经济和农业生产上发挥了重要作用。近年来，由于各种水稻病害流行小种的爆发及其致病力的变异，危害程度加重，严重威胁水稻的生产安全。水稻纹枯病是世界上水稻产区广泛发生、危害严重的世界性病害之一。随着矮秆、多蘖杂交稻组合的大力推广、施肥量及种植密度的提高以及气候变暖等因素，水稻纹枯病在我国的发生及危害日益严重。20世纪70年代以前，该病在我国仅为零星发生；70年代后迅速蔓延，并于80年代在我国水稻种植区大面积爆发；90年代以后，该病的发生为害更为猖獗，南方稻区的发病面积普遍超过50%以上。据报道，1982年水稻纹枯病在全国的发病面积约为1000万hm、损失稻谷约为3.5Xl(fkg;1995年发病面积扩大到近1600万hi^，损失稻谷超过11X109kg。近几年，水稻纹枯病在我国发病面积为15002000万hm、每年损失稻谷约6X109kg，一般发病田块导致减产15%20%，严重时达60%70%，占水稻病虫害损失的40%50%。目前在我国南方大多数水稻种植区，纹枯病已经成为最重要的水稻病害，无论是发生面积或造成的为害损失均居病害之首，成为制约水稻生产的重要障碍之一。水稻纹枯病的病原菌为立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)，是丝核菌属真菌中最复杂、最庞大同时也是研究比较深入的一个集合种。R.solani是水稻、玉米、大豆、草坪草和高粱等作物的纹枯病和立枯病的致病菌，还能引起马铃薯黑痣病、油菜菌核病、甜菜烂根病、豌豆茎腐病以及许多作物(如大豆、花生和蚕豆)的网斑或叶枯病等主要病斑(陈延熙1985、喻大昭2000)。目前，主要根据菌丝融合群的方法来划分R.solani在生理上特异的菌株。0goshi等(1987)、李华荣(1999)研究认为当两个丝核菌分离物配对培养时，在光学显微镜下可以观察到菌丝生长和交叠。如果发生菌丝融合，观察到菌丝间的吸引和融合细胞的坏死，便称这两个分离物为相同的融合群；如果不发生融合，或不发生菌丝坏死，便不属于相同的融合群。根据菌丝融合与否，现已将R.solani分为14个融合群(AG-1AG-13，AG-BI)。融合群又可以分为融合亚群，如0goshi等根据AG-1融合群内的菌株致病性将其分为AG-1IA、AG-1IB、AG-1IC三个亚群。李华荣等(1990)对四川省东、南稻区采集的108个水稻纹枯病菌按菌丝融合的方法进行菌系鉴定，其中水稻纹枯病菌隶属于AG-1为97X，AG-4为1X，AG-Bb为2%。杨艮华等(2002)对来自云南省20多个县市采集的水稻纹枯病样本进行分离得到54个菌株，按照菌丝融合将水稻纹枯病菌分为AG-1IA、AG-1IC、AG-6GW、AG-Bb和AGI-II5个菌系。由于AG-1IA的致病力最强且分离获得比例最高，目前普遍认为AG-1IA是水稻纹枯病的主要致病菌。0goshi等(1987)和李华荣等(1999)认为，菌丝融合群分类法是当前丝核菌最成功的分类手段，但其不能提供R.solani融合群或亚群间以及融合群内或亚群内更多的遗传信息。因此，随着分子生物学及其相关科学的快速发展，以PCR为基础的分子生物学技术为解决立枯丝核菌的鉴定诊断提供了最有力的工具。直接测定立枯丝核菌的遗传物质(DNA)成为了分子诊断最有力的工具。在真菌的分子诊断和鉴定中，最有价值的基因组区域之一是核糖体DNA(ribosomalDNA，rDNA)重复单元，这是由于rDNA在基因组中有多个拷贝(100500)，并且每个单位的rDNA基因其保守区和可变区掺杂分布。White等(1999)公布的真菌rDNA特异性扩增的通用引物序列更是起了巨大的推动作用。在真菌分子分类研究过程中，rDNA的内转录间隔区(InternalTranscribedSpacerRegion，ITS)序列常作为种级分类群及种下个体差异研究的PCR选择区域。目前ITS-5.8SrDNA序列分析技术在R.solani融合群内和融合群间的分子特征及分子诊断研究中得到广泛的应用。K皿inaga等(1997)对隶属10个融合群17个亚融合群的45个立枯丝核菌的ITS-5.8SrDNA序列进行分析比较，结果表明，同一亚融合群不同菌株间的同源性达96%以上，不同亚融合群之间的同源性为66%100%，不同融合群之间的同源性为55%96%。结果说明，ITS-5.8SrDNA序列分析方法可对立枯丝核菌在融合群、融合亚群、甚至是亚亚群等分类单元进行有效的划分。Boysen等(1996)对AG-1和AG-4融合群的菌株进行rDNA-ITS序列比对，发现其序列差异较大。Takeshi等(2004)认为ITS-5.8SrDNA序列能将AG-1ID与AG-1的其它融合亚群进行有效区分。Salazar等(2000)利用ITS-5.8SrDNA序列分析法，对AG_2不同亚群及AG-2-2亚群的不同亚亚群进行了研究，表明ITS-5.8SrDNA序列分析能对这两个分类单元进行有效划分。上述结果证明，ITS-5.8SrDNA序列分析方法在立枯丝核菌不同级别的分类、鉴定中具有不可取代的地位。因此，利用立枯丝核菌ITS区进行PCR扩增、测序及序列分析后再设计特异性引物，可以对该病原菌引起的病害进行诊断和检测，这将对病害的防治具有实际的生产意义。特异性引物PCR或多重PCR技术是近年来真菌分子诊断取得的重要进展。通过PCR扩增就可以在混合样本中特异性地检测出病原菌。基于核糖体DNA(rDNA)而构建的特异性引物进展较快，在诊断病原真菌上取得了突破性进展。US5585238号专利针对ITS区分别设计了鉴定S印toria，Pseudocercosporella禾口Mycosphaerella的特异性弓l物。US5800997号专利针对ITS区设计了鉴定Cercospora，Helminthosporium，Kabatiella和Puccinia的特异性引物。W095/29260号专利针对ITS区设计了鉴定Fusarium的特异性引物。在丝核菌(Rhizoctonia)检测方面，US6485907号专利针对ITS序列，设计了用于检测禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)的特异性引物。Carling等(2002)根据立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)AG2融合群内rDNAITS序列差异，分别设计了特异性引物检测AG-2-l、AG-2-2IIIB、AG-2-2VI、AG-2-2LP、AG-2-3和AG-2-4。Andrea等(1998)根据与水稻纹枯病有关的3种真菌复合体Rhizoctoniasolani、Rhizoctoniaoryzae和Rhizoctoniaoryzae-sativae的ITS序列分析结果，从ITS1和ITS2区域的差异中设计了多对引物，利用这些引物可以快速、准确地区分这3种病原菌。然而，水稻纹枯病菌是个集合种，现有的对水稻纹枯病菌的鉴别方法是远远不够的，尚需要新的技术进一步补充完善。传统的菌丝融合判定标准具有较多的主要因素，不利于客观准确的判断水稻纹枯病菌的融合群类型。现时的分子技术只能判定少数融合群类型，无法区别多个融合群类型。
发明内容针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种快速、准确判定水稻纹枯病菌融合群类型的技术方案。本发明根据ITS-5.8SrDNA序列设计不同菌丝融合群鉴别的特异性引物，作为水稻纹枯病菌融合群判定的鉴别引物，并通过水稻纹枯病菌DNA提取，利用特异性鉴别引物和-对通用引物配对，进行一步双重PCR扩增，根据电泳图谱鉴定水稻纹枯病菌的融合群类型。所述的水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征包括以下步骤1)隶属于立枯丝核菌不同菌丝融合群AG-lIA、AG-lIB、AG-2-l、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8和AG-BI的标准菌株RlR8，分别采用改良的CTAB法提取其基因组总DNA;2)设计判定水稻纹枯病菌融合群类型的特异性引物以步骤1)得到的不同融合群标准菌株DNA为模板，以ITSl和ITS4为通用引物，分别进行各个菌丝融合群标准菌株ITS-5.8SrDNA序列的PCR扩增，扩增后均得到单一的700bp的扩增条带，序列测定分析后，得到立枯丝核菌不同融合群菌株ITS区的核苷酸序列，找到区分不同菌丝融合群菌株ITS-5.8SrDNA序列的特异性碱基位点，设计出判定水稻纹枯病菌融合群类型的特异性鉴别引物。ITSl核苷酸序列如SEQNo.1所示，ITS4核苷酸序列如SEQNo.2所示，菌丝融合群AG-1IA标准菌株Rl的ITS苷酸序列如SEQNo.3所示，菌丝融合群AG-1IB标准菌株R2的ITS苷酸序列如SEQNo.4所示，菌丝融合群AG-2-1标准菌株R3的ITS苷酸序列如SEQNo.5所示，菌丝融合群AG-4标准菌株R4的ITS-5酸序列如SEQNo.6所示，菌丝融合群AG-5标准菌株R5的ITS-5酸序列如SEQNo.7所示，菌丝融合群AG-6标准菌株R6的ITS-5酸序列如SEQNo.8所示，菌丝融合群AG-8标准菌株R7的ITS-5酸序列如SEQNo.9所示，菌丝融合群AG-BI标准菌株R8的ITS-5.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQNo.10所示，菌丝融合群AG-1IA标准菌株Rl的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.11所示，全序列包括了3'端18SrDNA小亚基的部分核苷酸序列、内转录间隔区1的序列(18S与5.8S之间)、5.8SrDNA基因序列、内转录间隔区2的序列(5.8S与28S之间)、以及5'端28SrDNA大亚基的部分序列；菌丝融合群AG-1IB标准菌株R2的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.12所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8SrDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌丝融合群AG-2-1标准菌株R3的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.13所示，-5.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核-5.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核-5.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷全序列包括了18SrDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8SrDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌丝融合群AG-4标准菌株R4的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.14所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8SrDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌丝融合群AG-5标准菌株R5的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.15所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8SrDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌丝融合群AG-6标准菌株R6的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.16所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8SrDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌丝融合群AG-8标准菌株R7的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.17所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8SrDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌丝融合群AG-BI标准菌株R8的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.18所示；全序列包括了18SrDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8SrDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28SrDNA的部分序列。3)从水稻纹枯病感病茎杆或叶片中分离、纯化水稻纹枯病菌；4)采用改良的CTAB法提取水稻纹枯病菌的总基因组DNA;5)以步骤4)得到的水稻纹枯病菌DNA为PCR模板，用步骤2)中区分不同菌丝融合群菌株AG-lIA、AG-lIB、AG-2-l、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8或AG-BI的特异性鉴别引物作为水稻融合群判定的鉴别引物，同时加入通用引物ITS4和ITS1，进行一步双重PCR，若能同时扩增出500bp和700bp的两条特异性片段，即可判断出水稻纹枯病菌隶属于对应的菌丝融合群；若只能扩增出700bp的单一条带，即可判断出水稻纹枯病菌不属于该菌丝融合群。所述的水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征在于步骤1)和步骤4)中立枯丝核菌标准菌株或水稻纹枯病菌基因组DNA采用改良的CTAB法提取取O.2g菌丝，液氮研磨后加入800iiLDNA提取液，65。C下水浴保温30min，10000g离心10min;取上清液用等体积的氯仿/异戊醇(V:V=24:1)抽提，10000g离心10min;用氯仿/异戊醇(V:V=24:1)抽提再抽提1次；上清液加入等体积的DNA沉淀液，充分混匀，10000g离心10min;弃上清，在沉淀中加入1MNaCl300iiL，重新溶解，再加入等体积的氯仿/异戊醇(V:V=24:1)抽提，10000g离心10min;取上清液加入2.5倍体积的冷冻异丙醇，置于冰上30min沉淀DNA，4t:下10000g离心10min，弃上清液，用70%的酒精清洗，抽干后加TE缓冲液充分溶解，即得到菌株的基因组总DNA，在-201:下保存备用。所述的水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征在于步骤2)中不同菌丝融合群标准菌株ITS-5.8SrDNA序列的PCR扩增。PCR反应体系为25yL总体积中含有10XTaqreactionbuffer2.5iiL，25mMMgCl2，2.5mMdNTP，10iiM引物ITS1，10iiM引物ITS4，标准菌株DNA100ng，0.5UTaqDNApolymerase,加ddH20补足体积至25iiL。PCR反应条件为:94"C预变性4min;94。C变性50s，55。C退火50s，72。C延伸50s，共30个循环；循环结束后72t:再延伸10min。PCR反应结束后，在扩增产物中加入2.5yL的10Xloadingbuffer于1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，用1XTAE作为电泳缓冲液，100V下电泳40分钟，经EB染色后在紫外凝胶透射仪下观察结果。所述的水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征在于步骤5)中水稻纹枯病菌融合群判定的双重PCR反应体系25iiL总体积中含有10XTaqreactionbuffer2.5iiL，25mMMgCl2，2.5mMdNTP，10yM水稻纹枯病菌融合群判定的特异性鉴别引物，10yM引物ITSl，10iiM引物ITS4，水稻纹枯病菌DNAlOOng，O.5UTaqDNApolymerase,加ddH20补足体积至25iiL，PCR反应条件为94t:预变性4min;94"变性50s，55"退火50s，72"延伸50s，共30个循环；循环结束后72t:再延伸10min。PCR扩增后扩增产物中加入2.5yL的10Xloadingbuffer于1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，用1XTAE作为电泳缓冲液，100V下电泳40分钟，经EB染色后在紫外凝胶透射仪下观察结果。所述的水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征在于所述的DNA提取液为1L溶液中含有20gCTAB、1.4MNaCl、100mMTris-HCl、20mMEDTA禾口lmlP-巯基乙醇，pH值为8.0。所述的水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征在于所述的DNA沉淀液为1L溶液中含有10gCTAB、50mMTris-HCl和10mMEDTA，pH值为8.0。本发明利用特定的重复多拷贝ITS-5.8SrDNA序列，通过ClustalX分析软件对立枯丝核菌不同菌丝融合群菌株的ITS-5.8SrDNA序列分析比较。结果显示，不同菌丝融合群标准菌株ITS-5.8SrDNA序列之间有较大的差异。通过分析比较得到的变异位点为鉴别引物，能很好地区分各个菌丝融合群类型，并且有效地判定水稻纹枯病菌隶属的菌丝融合群。该发明会使水稻纹枯病用PCR技术进行田间早期诊断，有利于及早掌握病原菌田间发生的类型及发展情况。使水稻纹枯病的研究向定性检测方向发展，能够利用特异性引物定性检测出田间纹枯病菌的病原菌类型，对水稻纹枯病菌的检疫检验和生产实践中的识别提供快速准确的分子检测方法，为制定引起的水稻纹枯病的病原物的综合治理策略提供理论参考，对进出境其它由丝核菌引起重要的检疫性真菌病害的分子检测具有实际借鉴意义。本发明设计了8条特异性鉴别引物，用双重PCR的扩增图谱辨别水稻纹枯病菌的融合群类型，具有准确快捷、公正客观、经济实用的特点。图1为不同菌丝融合群标准菌株的ITS-5.8SrDNA扩增电泳图；图2为水稻纹枯病菌融合群判定的一步双重PCR扩增电泳图。图中M为标准DNA分子标记(100bp);1为阴性对照(H20);2_9分别为隶属于融合群AG-BI、AG-8、AG-6、AG-5、AG-lIA、AG-4、AG-2-l和AG-1IB的标准菌株R8、R7、R6、R5、R1、R4、R3禾PR2。具体实施例方式以下通过实施例来进一步说明本发明。本发明的实验选用的材料大田自然发病的水稻纹枯病样品，以及实验室保存的分别隶属于不同菌株融合群AG-1IA、AG-1IB、AG-2-l、AG-4、AG_5、AG_6、AG_8、AG-BI的标准菌株Rl、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8。8主要试剂10XTaqreactionbuffer、MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH20、lOObpDNAmarker、DNA凝胶回收试剂盒(TAKARA)、E.coliDH5a、X-gal、IPTG、pMD18_TeasyVector(TAKARA)、弓|物均由上海生物工程有限公司合成。实施例1从感病的水稻茎杆上分离、纯化水稻纹枯病菌从中国水稻研究所浙江富阳试验基地水稻田，采集感纹枯病的国稻六号杂交稻的水稻茎杆，带回实验室。将病杆组织经无菌水冲洗3次，用灭菌过的滤纸吸干组织表面的水分。再将病组织剪成长宽为5mm的小块，将其放置于2%水琼脂(琼脂20g，水lOOOmL)培养基中，置2『C培养箱下培养，2436h后病组织周围长出丝核菌特征的菌落，用无菌的刀片切取单菌丝尖端移植于PDA(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL)培养基中进行纯化，置28°C培养箱中纯化培养后，保存于4°C冰箱中备用。实施例2菌株基因组DNA的提取菌丝的获取将保存于斜面培养基上的立枯丝核菌标准菌株或分离得到的水稻纹枯病菌经平板活化后，挑取一小块菌丝块(约0.5mmX0.5mm)移入装有100mLPDB(马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL)培养基的250mL三角瓶中，于28。C摇床振荡培养56d。将获得的培养物用灭菌水冲洗2次，然后用真空泵将培养物充分抽干，保存于-2(TC冰箱中备用。DNA提取采用改良的CTAB法提取菌株总基因组DNA。取0.2g吸干的菌丝，液氮研磨，力B800iiLDNA提取液(1L溶液中含有20gCTAB、1.4MNaCl、100mMTris-HCl、20mMEDTA和lml|3-巯基乙醇，pH值为8.0)，在1.5mL的离心管中65"下保温30min，保温期间轻摇3-4次，10000g离心10min;取上清至一新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(V(氯仿)V(异戊醇)=24:1)混合液，充分混匀，10000g离心10min;再取上清至一新的离心管中，再次加入等体积的氯仿/异戊醇(v(氯仿)v(异戊醇)=24:i)混合液，充分混匀，10000g离心10min;取上清加入等体积的DNA沉淀液(1L溶液中含有10gCTAB、50mMTris-HCl禾P10mMEDTA，pH值为8.0)，充分混匀，10000g离心10min;弃上清，沉淀中加入lMNaCl300iiL，重新溶解，再加入等体积的氯仿/异戊醇(V(氯仿)V(异戊醇)=24:1)混合液，充分混匀，10000g离心10min;取上清至一新的离心管中，加入2.5倍体积的冷冻异丙醇，冰上放置30min沉淀DNA;4。C下10000g离心10min，弃上清，用70%的酒精洗涤沉淀2次，晾干，加TE缓冲液(10mMTris-HCl，lmMEDTA，pH值为8.0)充分溶解后，在-201:下保存备用，即得到菌株的总基因组DNA。DNA浓度测定，将样品用核酸_蛋白仪检测DNA的浓度和纯度(结果见表1)，将样品稀释为100ng/iU，用于PCR扩增。表l菌株总基因组DNA的纯度和浓度检测结果9菌株代号菌丝融合群A260細0浓度ng/化水稻纹枯病菌1.861.971.601.851.791.731.901.891.9024.3722,6222.5924.3521.5822.2443.0029.5443.00RlR2R3R4R5R6R7R8AG-1IAAG-1IBAG-2-1AG-4AG-5AG-6AG-8AG—BI实施例3不同菌丝融合群标准菌株的ITS-5.8SrDNA序列的PCR扩增对隶属于不同菌丝融合群菌株AG-11A、AG-11B、AG-2-1、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8或AG-BI的标准菌株RlR8，进行ITS-5.8SrDNA序列的PCR扩增。采用White等(1990)设计的通用引物ITS1和ITS4，由上海生物工程有限公司合成，ITS1和ITS4的序列分别为ITS1(5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，;SEQNo.1)，ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，;SEQNo.2)。PCR反应体系为25iiL总体积中含有lOXTaqreactionbuffer2.5iiL，25mMMgCl2，2.5mMdNTP，10iiM引物ITSl，10iiM引物ITS4，标准菌株DNAlOOng，O.5UTaqDNApolymerase，加ddH20补足体积至25yL。PCR反应条件为94。C预变性4min;94。C变性50s，55。C退火50s，72。C延伸50s，共30个循环；循环结束后72。C再延伸10min。PCR反应结束后，在扩增产物中加入2.5iiL的10Xloadingbuffer于1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，用1XTAE作为电泳缓冲液，100V下电泳40分钟，经EB染色后在紫外凝胶透射仪下观察结果，如图l所示。结果表明，阴性对照H20未出现条带，不同菌丝融合群的菌株均能产生单一的扩增条带，目的片段大小为700bp。实施例4不同菌丝融合群标准菌株ITS-5.8SrDNA序列的克隆及测序将上述各个菌丝融合群标准菌株ITS-5.8SrDNA序列扩增的700bp产物，经琼脂糖凝胶电泳分离后切割目的条带，使用大连宝生物公司的DNA回收试剂盒分别对PCR产物进行回收和纯化，按《分子克隆》GaCl2方法制备感受态细胞(Jos印hSambrook，2001)，将纯化产物连接到pMD18-TVector载体上，转化到大肠杆菌感受态细胞E.coliDH5a中，用预先涂有X-gal和IPTG的氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆子，碱法提取克隆质粒DNA，再用pMD18-TVector两端通用引物M13F和M13R在自动测序仪上进行测序，用ClusterX软件对序列进行分析，人工删除载体序列和引物序列，得到立枯丝核菌不同融合群菌株Rl(SEQNo.11)、R2(SEQNo.12)、R3(SEQNo.13)、R4(SEQNo.14)、R5(SEQNo.15)、R6(SEQNo.16)、R7(SEQNo.17)或R8(SEQNo.18)的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列。菌丝融合群AG-1IA标准菌株Rl的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.11所示，全序列包括了3'端18SrDNA小亚基的部分核苷酸序列、内转录间隔区1的序列(18S与5.8S之间)、5.8SrDNA基因序列、内转录间隔区2的序列(5.8S与28S之间)、以及5'端28SrDNA大亚基的部分序列；菌丝融合群AG-1IB标准菌株R2的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.12所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8SrDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌丝融合群AG-2-l标准菌株R3的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.13所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8SrDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌丝融合群AG-4标准菌株R4的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.14所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8SrDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌丝融合群AG-5标准菌株R5的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.15所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8SrDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌丝融合群AG-6标准菌株R6的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.16所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8SrDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌丝融合群AG-8标准菌株R7的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.17所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8SrDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌丝融合群AG-BI标准菌株R8的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.18所示；全序列包括了18SrDNA的部分序列、内转录间隔区1的序列、5.8SrDNA基因序列、内转录间隔区2的序列、以及28SrDNA的部分序列。实施例5水稻纹枯病菌融合群判定的特异性引物的设计根据不同融合群AG-lIA、AG-lIB、AG-2-l、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8或AG-BI的标准菌株R1R8的ITS-5.8SrDNA序列分析的比对结果，分别构建了不同菌丝融合群菌株的特异性引物WG3(SEQNo.3)、WG4(SEQNo.4)、WG5(SEQNo.5)、WG6(SEQNo.6)、WG7(SEQNo.7)、WG8(SEQNo.8)、WG9(SEQNo.9)和WG10(SEQNo.10)，如表2所示，作为水稻纹枯病菌融合群判定的特异性引物。表2不同融合群菌株的特异性引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例6水稻纹枯病菌融合群判定的双重PCR检测以提取的水稻纹枯病菌总基因组DNA为模板，鉴别不同菌丝融合群菌株AG-1IA、AG-1IB、AG-2-l、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8或AG-BI特异性引物WG3WG10为引物，分别进行水稻纹枯病菌融合群判定的双重PCR检测。PCR反应体系25iiL总体积中含有10XTaqreactionbuffer2.5iiL，25mMMgCl2，2.5mMdNTP，10iiM特异性鉴别引物(WG3或WG4或WG5或WG6或WG7或WG8或WG9或WG10)，10iiM引物ITS1，10iiM弓|物ITS4，水稻纹枯病菌DNAlOOng，O.5UTaqDNApolymerase,加ddH20补足体积至25iiL。PCR反应条件为94。C预变性4min;94t:变性50s，55t:退火50s，72"延伸50s，共30个循环；循环结束后72t:再延伸10min，PCR扩增后产物中加入2.5yL的10Xloadingbuffer于1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，用1XTAE作为电泳缓冲液，100V下电泳40分钟，经EB染色后在紫外凝胶透射仪下观察结果。从图2可以看出，当以WG3和ITS1和ITS4为引物时，从PCR产物中可以检测到500bp和700bp两条特异性片段；而以其它特异性引物为引物时，只可以检测到700bp的单条带，而没有扩增出500bp的特异性片段，也没有其它的额外片段。说明500bp的DNA片段是该水稻纹枯病菌的特异性片段，是融合群AG-1IA的标准菌株R1的特异性鉴别引物WG3和通用引物ITS4共同扩增的结果。结果表明，该水稻纹枯病菌属于AG-1IA菌丝融合群。序列表〈110〉中国水稻研究所〈120〉水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法〈130>1〈160>18〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>19〈212>DNA〈213>通用引物ITS1〈400>1tccgtaggtgaacctgcgg19〈210>2〈211>20〈212>DNA〈213>通用引物ITS4〈400>2tcctccgcttattgatatgc20〈210>3〈211>21〈212>DNA〈213〉水稻菌丝融合群AG-1IA标准菌株Rl的特异性鉴别引物WG3〈400>3agttggtggatttaattccat21〈210>4〈211>19〈212>DNA〈213〉水稻菌丝融合群AG-1IB标准菌株R2的特异性鉴别引物WG4〈400>4tcaaggtcctttggggttg19〈210>5〈211>19〈212>DNA〈213〉水稻菌丝融合群AG-2-1标准菌株R3的特异性鉴别引物WG5〈400>5atggggaatttacttgttg19〈210>6〈211>19〈212>DNA〈213〉水稻菌丝融合群AG-4标准菌株R4的特异性鉴别引物WG6〈400>6atgttttgtgggggggaag19[O川]〈210>7〈211>19〈212>DNA〈213〉水稻菌丝融合群AG-5标准菌株R5的特异性鉴别引物WG7〈400>7atggggaatttattgattg19〈210>8〈211>19〈212>DNA〈213〉水稻菌丝融合群AG-6标准菌株R6的特异性鉴别引物WG8〈400>8aagtgggacttttaattta19〈210>9〈211>19〈212>DNA〈213〉水稻菌丝融合群AG-8标准菌株R7的特异性鉴别引物WG9〈400>9atgggggaatttattcatt19〈210>10〈211>19〈212>DNA〈213〉水稻菌丝融合群AG-BI标准菌株R8的特异性鉴别引物WG10〈400〉10acggggg腿tttttattt19〈210〉11〈211〉618〈212〉DNA〈213〉水稻菌丝融合群AG-IIA标准菌株Rl的ITS-5.8SrDNA序列〈400〉11tgagttgttgctggccttttctecctteatttggc郷agggggratgtg60cacaccttctctttcatccatcaraccccctgtgcacttgategttggtg120gattteattccatccatttgctgtctecttcactctectt180gatgteacgcatcteatectaagtttcaacaacggatctcttggctctcg240catcgatg^g皿cgcagcga^tgcgateagteatgtgaattgcag^ttcagtgaatc300atcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtettccttggagratgcctgtttgagt360atcatga^tcttcaaagteaaccttttgtggtcttttttactttggttt420tettgcagcttcacacctgctcctctttgtgcattegctggatctcagtg■ttetgcttggttccactcggcgtgateagttetctetcgctgaggacacccgtea朋朋g540gtggc咖ggte皿tgc3gatgaaccgcttcteategtccattgacttggacaatettct600attttetgatctgatctc618〈210〉12〈211〉624〈212〉DNA〈213〉水稻菌丝融合群AG-1IB标准菌株R2的ITS-5.8SrDNA序列〈400〉12tgagttgtegctggcctttttgtgcacactcttctctttc60ccctgtgcacttgtgagacagtcaaggtcctttggggttggggggc卿g120ctttettgcaaaaccctttttccccttttgcctttgctgtctectcaatttetecacact180tgteattgatgteacgcatcteatecteagtttcaacaac240ggatctcttggctctcgcatcgatg皿g皿CgC3gCg皿3tgcgateagt朋tgtg朋tt300gtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtettccttgg360agcatgcctgtttgagtetcatgaaatcttcttttgtteattcaatcggg420tctcttgctttggtettggaggtctttgcacctgctcctcttgttcattegctggatctc■agtgttetgcttggttccactcggcgtgataagttetctetcgctg郷acaccgte朋3540皿gtggcc皿ggte皿tgcagacg皿ccgcttcteategtccattgacttggac朋ttea600atttttetgatctgatctca皿tc624〈210〉13〈211〉619〈212〉DNA〈213〉水稻菌丝融合群AG-2-1标准菌株R3的ITS-5.8SrDNA序列〈400>13朋tg朋gagtttggttgtegctggcccattcatttgggcatgtgcacacctttctctttc603tCCC3C3C3cacctgtgaacctgtgagatC卿tgggg3atttecttgttgctttttgg120朋teca朋ggc皿teggttettggaccctctgtctectcaactcaattte180tttteaaacg皿tgteatggtctcatecteagtttcaacaacggatctct240tggctctcgc3tcgatg皿g皿CgC3gCg3皿tgcgateagteatgtg皿ttgcagaatt300C3gtg朋tC3tcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtettccttggagcatgcc360tgtttgagtetcatgaattcatcttttgttaactcaattggtttcacttt420ggtettggaggtcttttgcagcttcacacctgctcctctttgttcattegctggatctca■gtgttetgcttggttccactcggcgtgateaattetctetcgctgaggac3ctgtea皿g540gtggccaaggte皿tgc3gatgaaccgcttcteategtccattgacttggacaatecctt600tetgatctgatctcaaatc619〈210>14〈211>631〈212>DNA〈213〉水稻菌丝融合群AG-4标准菌株R4的ITS-5.8SrDNA序列〈400>14朋tgtegagtttggttgtegctggctccteatteaacttgggggratgtgcacacctttc60tctttcatcctgtgcacctggttttgtggggggg皿gg皿120ctttettggaccttctectcccccttgacttctgtctectteattcatet180cggatgteatggatgteac3catcteatecteagtttcaacaacggatct240cttggctctc3g皿CgC3gCg皿atgcgat皿gteatgtg朋ttgcag朋300ttcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtettccttggagcatg360cctgtttgagtcttcaaagtcaaaccttttgtteattcaattggttctgc420tttggtettggaggattettgcagcttcacacctgctcctctttgtgcattegctggatc■tcagtgttetgcttggttccactcagcgtgateagttetctetcgctgaggacaccctgt540te朋朋ggggtggc咖ggtgaaccgcttcteategtccattgacttgga600tttetgatctgatctcaaatc631〈210〉15〈211〉608〈212〉DNA〈213〉水稻菌丝融合群AG-5标准菌株R5的ITS-5.8SrDNA序列〈400〉15皿tg郷ggatetttggttgtegctggctcatcaatttgggcatgtgcacacctetctct60ttcatccacacacacctgtgcacttgtgaggc卿tggggttgtttttte120gtgctggaccctctgtctecaactcaattt3tttega朋t180g皿tgteatggatgteacgcatcteatectaagtttcaacaacggatctcttggctctcg240g皿cgcagcg皿atgcgate3gteatgtgatcagtgaatc300atcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtettccttggagratgcctgtttgagt3603tC3tg3朋tcttcaaagteaatcttttgtteactcaattggttctectttggtettgga420ggtctttgcagcttcacacctgctcctctttgttcattegctggatctcagtgttetgct■tggttccactcagcgtgateagttetctetcgctgaggacactgtecaggtggcc皿ggg5403朋tgC3g3tgaaccgcttcteategtccattgacttggacactetttttatgatctgat600ctcaaatc608〈210>16〈211>535〈212>DNA〈213〉水稻菌丝融合群AG-6标准菌株R6的ITS-5.8SrDNA序列〈400>16朋tgtegagttggttgtegctggcctgatttteatetctgcaccttctct60ttcatccacacacacctgtgcacctgtgag3C3g皿gtgggactttteat120tgaaccctctgtctectcaactcaatttetcttea^tgaatgteactgg180atgteacgcatcteatecteagtttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatg^g240朋CgC3gCg3朋tgcgateagteatgtg皿ttgcagaatttcgaatcttt300gaacgcaccttgcgctccttggtettccttggagcatgcctgtttgagtetcatgaaatc360ttc朋3gtgaaccttttgttaactcaattggttctgctttggtettggaggttettgcag420cttecacctgctcctctttgtecattegctggatctcagtgttetgcttggttccactca■ccgcttccaacagtccattcacttggac皿tectcttetgatctgatctc535〈210>17〈211>590〈212>DNA〈213〉菌丝融合群AG-8标准菌株R7的ITs-5.8srDNA序列〈400>17朋tg朋gagttggttgtegctggtccatteatttgggc皿tgtgcacacctcctctttca60tCC3C3C3C3cctgtgcacctgtg卿ragatggggg皿tttettcatttattggacccc120tctgtctectcaattcatetgatgteacac180atcteatectaagtttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatg^g皿cgcagcg2403朋tgcgateagteatgtgaattgcag^ttcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacc300ttgcgctccttggtettccttggagratgcctgtttgagtatcatga^tcttcaaagte360aatcttttgtteattcaattggttctectttggtettggaggtcttttgcagcttcacac420ctgctcctctttgtgcattegctggatctcagtgttetgcttggttccactcagcgtgat■tcgctgaggacactgte皿3agtggcc皿ggte皿tgcagatgaaccgct540tcteategtccattgacttggac皿tettettetgatctgatctcaaatc590〈210>18〈211>648〈212>DNA〈213〉水稻菌丝融合群AG-BI标准菌株R8的ITS-5.8SrDNA序列〈400>18ttggttgtegctggtccatt皿tttgggcaacgtgcacacctttctcttt60catccatecacacacctgtg皿cctgtgag3C卿Cggggttttgttcag120ateac^tgaatg皿gteatcgggaacccctctgtctectteatctcate180atg皿tgteatggatgteaccteagtttcaac^cggatc240tcttggctctcgcatcgatgcga^tgcgateagteatgt300tcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtettccttggagcat360gcctgtttgagtetcatg皿atcttcaaagteaatcttttgtteattcaaggtggtttca420ctttggtettggaggtcttgcagcttcacacctgctcctctttgtgtettagctggatct■cagtgttetgcggtggttccactcggcgtgateacttetcteccgctgaggacactcttt540ctttttttcctggc咖ggggaaccgcttc600caategtccattegcttggacaatetttttatgatctgatctcaaatc6481权利要求水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征包括以下步骤1)隶属于不同菌丝融合群AG-1IA、AG-1IR、AG-2-1、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8和AG-BI的标准菌株，菌株代号分别为R1～R8，采用改良的CTAB法分别提取其基因组总DNA；2)设计能鉴别水稻纹枯病菌融合群类型的特异性引物以步骤1)得到的DNA为模板，以ITS1和ITS4为引物，分别进行各个标准菌株的ITS-5.8SrDNA序列的PCR扩增，扩增后均得到700bp的目的条带，经序列测定后得到不同融合群标准菌株的核苷酸序列，找到区分不同标准菌株的特异性碱基位点，设计出鉴别不同融合群标准菌株ITS-5.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，ITS1核苷酸序列如SEQNo.1所示，ITS4核苷酸序列如SEQNo.2所示，菌丝融合群AG-1IA标准菌株R1的ITS-5.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQNo.3所示，菌丝融合群AG-1IB标准菌株R2的ITS-5.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQNo.4所示，菌丝融合群AG-2-1标准菌株R3的ITS-5.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQNo.5所示，菌丝融合群AG-4标准菌株R4的ITS-5.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQNo.6所示，菌丝融合群AG-5标准菌株R5的ITS-5.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQNo.7所示，菌丝融合群AG-6标准菌株R6的ITS-5.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQNo.8所示，菌丝融合群AG-8标准菌株R7的ITS-5.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQNo.9所示，菌丝融合群AG-BI标准菌株R8的ITS-5.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQNo.10所示；3)采集表现为水稻纹枯病症状的病株样本，从感病组织中分离、纯化水稻纹枯病菌；4)采用改良的CTAB法提取水稻纹枯病菌的基因组总DNA；5)水稻纹枯病菌融合群判定的双重PCR鉴定用步骤4)得到的水稻纹枯病菌的DNA为PCR反应模板，以步骤2)得到的不同的融合群的特异性鉴别引物作为水稻纹枯病菌融合群判定的特异性鉴别引物，同时加入通用引物ITS1和通用引物ITS1，分别进行双重PCR，若能同时扩增出500bp和700bp的两条特异性片段，即可判定该水稻纹枯病菌隶属于对应的菌丝融合群；若只能扩增出700bp的片段，即判断水稻纹枯病菌不属于该菌丝融合群。2.如权利要求1所述的水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征在于步骤1)和4)中改良的CTAB法提取DNA的方法中步骤如下取O.2g菌丝，液氮研磨后加入800yLDNA提取液，65t:下水浴保温30min，lOOOOg离心10min;取上清液用等体积的氯仿/异戊醇抽提，10000g离心10min;用氯仿/异戊醇抽提再抽提1次；上清液加入等体积的DNA沉淀液，充分混匀，10000g离心lOmin;弃上清，在沉淀中加入1MNaCl300yL，重新溶解，再加入等体积的氯仿/异戊醇抽提，lOOOOg离心lOmin;取上清液加入2.5倍体积的冷冻异丙醇，置-5.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序-5.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序-5.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序-5.8SrDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序于冰上30min沉淀DNA，4。C下lOOOOg离心10min，弃上清液，用70%的酒精清洗2次，抽干后加TE缓冲液充分溶解，即得到菌株的基因组总DNA。3.如权利要求1所述的水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征在于步骤2)中PCR反应体系为25iiL总体积中含有lOXTaqreactionbuffer2.5iiL，25mMMgCl2，2.5mMdNTP，10iiM引物ITSl，10iiM引物ITS4，标准菌株基因组总DNAlOOng，O.5UTaqDNApolymerase,力口ddH20补足体积至25uL;PCR反应条件为:94"C预变性4min;94。C变性50s，55。C退火50s，72。C延伸50s，共30个循环；循环结束后72t:再延伸10min。4.如权利要求1所述的水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征在于步骤5)中双重PCR反应体系为25iiL总体积中含有10XTaqreactionbuffer2.5iiL，25mMMgCl2，2.5mMdNTP，10yM特异性鉴别引物，10yM引物ITS1，10yM弓|物ITS4，水稻纹枯病菌DNAlOOng，O.5UTaqDNApolymerase,力口ddH20补足体积至25iiL;PCR反应条件为94t:预变性4min，94"C变性50s，55"C退火50s，72"C延伸50s，共30个循环，循环结束后72t:再延伸10min。5.如权利要求2所述的水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征在于所述的DNA提取液为:lL溶液中含有20gCTAB、1.4MNaCl、100mMTris-HCl、20mMEDTA禾口lmlP-巯基乙醇，pH值为8.0。6.如权利要求2所述的水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征在于所述的DNA沉淀液为1L溶液中含有10g、50mMTris-HCl禾P10mMEDTA，pH值为8.0。全文摘要水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，属于生物
技术领域：
。其包括对立枯丝核菌8个不同融合群菌株总DNA提取、PCR扩增、rDNA-ITS序列测定、分析等过程的基础上，找到了鉴别立枯丝核菌不同融合群菌株的碱基位点，分别设计出可鉴别不同融合群菌株的高特异性鉴别引物，与通用引物ITS4结合，同时增加通用引物ITS1，利用一步双重PCR方法检测，能得到特异性500bp片段和700bp的DNA片段，成功地进行不同融合群菌株的高特异性PCR鉴别。该发明对为水稻立枯丝核菌的识别提供快速准确的分子检测方法，为制定立枯丝核菌引起的多种病害如纹枯病、立枯病等综合治理决策提供理论参考。文档编号C12Q1/04GK101792795SQ200910156620公开日2010年8月4日申请日期2009年12月29日优先权日2009年12月29日发明者刘连盟,王玲,黄世文申请人:中国水稻研究所