专利名称：检测抗稻瘟病等位基因的特异性pcr分子标记的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及水稻育种中的检测技术领域，特别是检测谷梅2号Pi25抗穗瘟病等位 基因的特异性PCR标记。
背景技术：
稻瘟病是由子囊菌Magnaporthe grisea Barr引起的广泛发生于世界各稻区的最 重要的水稻病害之一，其中穗瘟对水稻产量的影响尤为严重。种植抗稻瘟病水稻品种是解 决该问题的最经济有效的手段。一般，常将抗稻瘟病品种和高产品种进行杂交而获得高产 抗瘟品种，在转育抗病基因的回交育种中，必须在抽穗之前完成穗瘟抗性的鉴定，常规的穗 瘟鉴定必须在抽穗之后才能进行，无法满足该条件。随着分子标记的快速发展，借助分子标 记辅助选择，利用适合的分子标记能在苗期就能完成穗瘟抗性鉴定，而利用分子标记进行 抗性鉴定时要具备三个前提条件(1)育种群体的部分亲本携带已较精确定位、且遗传效 应较为明确的目标基因；(2)具有与目标基因紧密连锁、且检测简便的标记；(3)连锁标记 在育种群体的亲本之间呈多态性。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了 4个检测谷梅2号Pi25抗穗瘟病等位基因的特 异性分子标记。本发明是通过如下技术方案来实现的根据前期Pi25的定位结果，对其紧密连锁 区间进行测序，将测序结果与已公布的粳稻品种Nipponbare和籼稻品种93-11的基因组序 列进行比对，根据目标序列的插入和缺失情况，设计了 9个与Pi25紧密连锁的STS标记；将 这9个STS标记用于检测谷梅2号和66个籼型杂交稻亲本，筛选出在谷梅2号检测到特异 片段的标记4个；这4个标记可用于鉴定待测材料是否在Pi25座位上携带谷梅2号抗稻瘟 病等位基因，进而鉴定待测材料是否具有抗穗瘟能力；这4个标记分别为Sil3068、Sil3070B2、Sil3070C和 Sil3070D ；Sil3068 的上游引 物为 5，-TCTTAAAGGAGCCGTCT-3，，下游引物为 5，_GAAACTTAAACTGTACGTGTG_3，；Sil3070B2 的 上游引物为 5，-TTATGTAAGAAGCTAGATCCGTA-3，，下游引物为 5，-AGAGCTGTTTATGTCGACCA-3，； Sil3070C的上游弓丨物为5，-ATAACGTGTGTCCATAACAGT-3，，下游引物为 5，-TTAATGACTCGTGTATAGAGC-3，；Sil3070D 的上游引物为 5，-CAAGTTTTACTCTCCCGTT-3，，下 游引物为5 ’ -CCAGCTAGATTAATGACTCG-3 ’。这4个标记的PCR扩增体系和反应条件一致，其中 扩增体系为，Tris-HCL(pH 8. 8)33. 5mM, (NH4)2SO4 8. OmM, MgCl2 1. 5mM, TWEEN-20 0. 05%, dNTPs 0. 2mM，上、下游引物各3. 3ng/y l，Taq DNA聚合酶2. 0单位，模版DNA 50ng ；反应条 件为，94°C 2分钟；94°C 45秒、55°C 45秒、72°C 1分钟，30个循环；72°C 8分钟。申请人:前期研究将一个兼抗叶瘟和穗瘟的基因Pi25定位于水稻第6染色体分子 标记SA7和RG456之间，其抗性等位基因来源于谷梅2号。本发明在此基础上对Pi25紧密 连锁区间进行测序，根据测序结果设计序标位(STS)标记，进而从中挑选出可特异性鉴定谷梅2号等位基因的标记。本发明提供的分子标记对谷梅2号Pi25抗稻瘟病等位基因的 检测具有普遍应用价值，可以广泛地应用于谷梅2号Pi25抗性基因的转育研究中。
图1为66个籼型水稻亲本的DNA检测结果；图2为Sil3070C对112个重组自交系的检测结果。
具体实施例方式如图1所示，A.分子标记Si 13068的检测结果；B.分子标记Sil3070B2的检测结 果；C.分子标记Sil3070C的检测结果；D.分子标记Sil3070D的检测结果。G 谷梅2号； 1 JI-32B ；2 :D 优 62B ；3 :V20B ；4 博 B ;5 川香 29A ；6 菲改 B ;7 丰源 A ;8 冈 46B ；9 金 23B ；10 龙特浦B ;11 内香2A ；12 内香85A ；13 天丰A ;14 协青早B ;15 印32B ；16 优 IB ；17 珍汕 97B ；18 中 100A ；19 中 IA ;20 中 2B ；21 中 3B ;22 中 9B ；23 中浙 A ；24 207 ；25 253 ；26 926 27 :CDR22 ；28 :R402 ；29 :To974 ；30 :ZDZ057 ；31 测 64 ;32 多系 1 号；33 恩恢 58 ；34 辐恢 718 ；35 广恢 128 ；36 桂 99 ；37 江恢 151 ；38 泸恢 17 ；39 ；密阳 46 ；40 绵恢 501 ；41 绵恢 725 ；42 明恢 63 ；43 明恢 70 ；44 明恢 77 ；45 明恢 86 ；46 蜀恢 162 ；47 蜀恢 527 ；48 盐恢 559 ；49 宜恢 1577 ；50 镇恢 084 ；51 :CH238 ；52 :CH59 ；53 中 恢 218 ；54 中恢 8006 ；55 中恢 111 ；56 中恢 1176 ；57 中恢 333 ；58 中恢 161 ；59 特青； 60 :IR24 ；61 中恢 8012 ；62 中恢 8015 ；63 中恢 465 ；64 中恢 7492 ；65 :R600 ；66 恢 66。如图2为Sil3070C对112个重组自交系的检测结果，G 谷梅2号；1 112:112 个重组自交系，经苗期接种43、68和103号样品表现高感，其余样品表现高抗。筛选方法1.谷梅2号Pi25抗稻瘟病等位基因的特异性PCR标记的筛选根据前期定位结果，对Pi25两侧标记SA7和RG456之间界定的部分序列进行测 序，将测序结果与已公布的粳稻品种日本晴和籼稻品种93-11序列进行比对，发现所测序 列于日本晴序列基本匹配。应用软件Olig0 7. 0分析日本晴和93-11序列间的插入和缺失， 设计了 9个与Pi25紧密连锁的STS标记，应用下述步骤检测谷梅2号和66个籼型杂交稻 亲本，筛选出在谷梅2号检测到特异片段的标记4个。(I)DNA提取将谷梅2号和66份亲本材料的种子分别置于预先标号的培养皿， 30°C发芽7天，采用简易法从幼苗中提取DNA。(2) PCR扩增采用20 μ 1反应体系，反应条件如上所述，在PCR仪上进行扩增。(3) PCR产物电泳及显色扩增产物中加入加样缓冲液，每样品取2μ 1上样于6% 非变性聚丙烯酰胺胶(PAGE)；接通电极，在100V恒定电压下电泳4小时，关闭电源；取下凝 胶，银染显色。如图1所示所筛选出的4个STS标记能将谷梅2号和其他亲本材料区别开谷 梅2号呈现特异带型，其余66个水稻亲本材料均呈现另一种带型，而且4个标记检测结果一致。2.特异性PCR标记对谷梅2号Pi25抗稻瘟病等位基因鉴定效果的验证水稻材料抗病对照谷梅2号，感病对照中156和广陆矮4号，由112个重组自交
4系组成的BL群体。BL群体的母本为从中156/谷梅2号重组自交系群体中筛选出的抗稻瘟 病材料，父本为水稻三系恢复系，前期研究表明这些株系可能均携带Pi25纯合抗性基因。 2008年在中国水稻研究所实验基地的2个不同区域分别进行抗稻瘟病鉴定试验，采用苗期 心叶注射法接种稻瘟病混合菌种，每个株系接种3株。2个试验获得一致结果，谷梅2号表 现高抗，中156和广陆矮4号表现高感；112个BL重组自交系有3个(编号43、68和103) 表现高感，其余表现高抗。 在其中1个试验幼苗移栽一周后每个株系取一个单株叶片提取DNA，进行基因型 检测。DNA提取方法、PCR扩增和电泳显色方法如上所述。如图2所示，112个BL重组自交 系中，只有编号为43、68和103的3份样品未携带谷梅2号Pi25抗稻瘟病等位基因；其余 材料包括3个抗性杂合体和106个抗性纯合体。上述结果显示，基因型检测和接种鉴定结 果完全一致，表明本发明提供的分子标记可有效地对待测材料是否携带谷梅2号Pi25抗稻 瘟病等位基因进行特异鉴定。
本发明涉及水稻育种中的检测技术领域，特别是检测谷梅2号Pi25抗穗瘟病等位基因 的特异性PCR标记。 序列表
<110>中国水稻研究所
<120>检测水稻品种谷梅2号抗稻瘟病等位基因Pi25的特异性PCR标记
<140>200910155609. 5
<141>2009-12-17
<160>8
<170>PatentIn 3.3
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>水稻
<400>1
tcttaaagga gccgtct
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>水稻
<400>2
gaaacttaaa ctgtacgtg tg
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>水稻
<400>3
ttatgtaaga agctagatcc gta<210>4 <211>20 <212>DNA <213>水稻 <400>4
agagctgttt atgtcgacca
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>水稻
<400>5
ataacgtgtg tccataacag t <210>6 <211>21 <212>DNA <213>水稻 <400>6
ttaatgactc gtgtatagag c
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>水稻
<400>7
caagttttac tctcccgtt
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>水稻
<400>8
ccagctagat taatgactcg
权利要求
一种检测谷梅2号Pi25抗稻瘟病等位基因的4个特异性PCR标记，分别为Si13068、Si13070B2、Si13070C和Si13070D，其特征在于其PCR引物，Si 13068的上游引物为5’-TCTTAAAGGAGCCGTCT-3’，下游引物为5’-GAAACTTAAACTGTACGTGTG-3’；Si13070B2的上游引物为5’-TTATGTAAGAAGCTAGATCCGTA-3’，下游引物为5’-AGAGCTGTTTATGTCGACCA-3’；Si13070C的上游引物为5’-ATAACGTGTGTCCATAACAGT-3’，下游引物为5’-TTAATGACTCGTGTATAGAGC-3’；Si 13070D 的上游引物为5’-CAAGTTTTACTCTCCCGTT-3’，下游引物为5’-CCAGCTAGATTAATGACTCG-3’。
全文摘要
本发明提供了检测抗稻瘟病等位基因的4个特异性PCR标记，分别为Si13068、Si13070B2、Si13070C和Si13070D，特征在于其PCR引物。Si13068的上游引物为5’-TCTTAAAGGAGCCGTCT-3’，下游引物为5’-GAAACTTAAACTGTACGTGTG-3’；Si13070B2的上游引物为5’-TTATGTAAGAAGCTAGATCCGTA-3’，下游引物为5’-AGAGCTGTTTATGTCGACCA-3’Si13070C的上游引物为5’-ATAACGTGTGTCCATAACAGT-3’，下游引物为5’-TTAATGACTCGTGTATAGAGC-3’；Si13070D的上游引物为5’-CAAGTTTTACTCTCCCGTT-3’，下游引物为5’-CCAGCTAGATTAATGACTCG-3’。利用这4个标记对水稻苗期所提取的DNA进行鉴定，可以检测待测材料是否转入谷梅2号Pi25抗稻瘟病等位基因，即是否具有抗叶瘟和穗瘟能力，整个检测过程操作简单且准确性高。
文档编号C12N15/11GK101880708SQ200910155609
公开日2010年11月10日 申请日期2009年12月17日 优先权日2009年12月17日
发明者庄杰云, 应杰政, 朱玉君, 樊叶杨 申请人:中国水稻研究所