专利名称：水稻育性恢复基因特异性分子标记的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种利用水稻种质资源筛选特异性分子标记的方法，特别是利用水稻
种质资源筛选水稻育性恢复基因特异性分子标记的方法。
背景技术：
水稻细胞质雄性不育(CMS)及其育性恢复，是实现水稻三系配套的基础。在诸多 CMS中，野败型是我国三系杂交稻中应用最早、应用面积最为广泛的不育胞质类型，且与生 产上应用较多的其他胞质类型(K型、矮败型、D型、冈型和印尼水田谷型)具有相似的恢保 关系。这类胞质的育性恢复主要受两个主效基因控制，分别是位于第1染色体短臂的Rf3 和第10染色体长臂的Rf4。 在育种实践中，恢复基因的筛选通常是通过大量的后代测交加以确定，其缺点是 周期长、工作量大，同时表型鉴定在一定程度上受环境条件的影响，选育效率低。近年来，以 基因型鉴定为基础的分子标记辅助选择逐渐在育种实践得到有效应用。在育性恢复基因定 位的基础上，可以筛选到与恢复基因紧密连锁的分子标记，但往往遇到标记多态性的组合 特异性问题，即在特定亲本之间呈多态的标记，在育种群体的亲本之间可能呈现单态，需要 针对具体育种群体的亲本重新筛选多态性标记，既增加了工作量，又提高了育种工作的难 度。如果能够应用数量较大的种质资源，筛选出与育性恢复基因相关的特异性标记，就可以 为水稻育性恢复基因分子标记辅助选择的开展提供极大的便利。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选育性恢复基因特异性分子标记的方法，从而获得可 用于辅助筛选籼型不育系和恢复系的分子标记，加速水稻育种进程、提高选择效率、节约成 本。 本发明是通过如下技术方案来实现的以携带水稻CMS育性恢复基因Rf3和Rf4 的43份籼型恢复系和不携带这两个基因的23份籼型不育系为材料，挑选与Rf3和Rf4基 因紧密连锁的PCR (聚合酶链式反应)标记，应用相应弓I物进行PCR扩增，扩增产物在6 %的 非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测。根据66份种质资源分子检测结果，如果一个标记在不 育系和恢复系之间呈现特异性差别(不育系中检测到的条带不在恢复系中检测到，且恢复 系中检测到的条带也都不在不育系中检测到)，或在不育系检测到特异条带(特定条带只 在部分不育系中检测到，而不在任何恢复系中检测到)，或在恢复系检测到特异条带(特定 条带只在部分恢复系中检测到，而不在任何不育系中检测到)，则将该标记判断为鉴定其连 锁基因的特异性分子标记。 经应用Rf 3基因的6个连锁标记和Rf 4基因的5个连锁标记检测66份水稻材料， 将微卫星标记RM10338和RM10353确定为鉴定Rf3基因的特异性分子标记，将RM6100和 RM1108确定为鉴定Rf4基因的特异性分子标记；其中，RM10338在不育系和恢复系之间呈现 特异性差别，其他3个标记在恢复系检测到特异条带。
图1A为23份野败型雄性不育系和43份恢复系的DNA标记检测结果即分子标记 RM10338的检测结果； 图IB为23份野败型雄性不育系和43份恢复系的DNA标记检测结果即分子标记 RM6100的检测结果。
具体实施方案 如图1A、图IB所示，M -Marker ;1 :II-32B ;2 :D优62B ;3 :V20B ;4 :博B ;5 :川香
29A ;6 :菲改B ;7 :丰源A ;8 :冈46B ;9 :金23B ;10 :龙特浦B ;11 :内香2A ;12 :内香85A ;13 : 天丰A ;14 :协青早B ;15 :印32B ;16 :优IB ;17 :珍汕97B ;18 :中100A ;19 :中1A ;20 :中2B ;
21 :中3B ;22 :中9B ;23 :中浙A ;24 :207 ;25 :253 ;26 :926 ;27 :CDR22 ;28 :R402 ;29 :To974 ;
30 :ZDZ057 ;31 :测64 ;32 :多系l号；33 :恩恢58 ;34 :辐恢718 ;35 :广恢128 ;36 :桂99 ;37 : 江恢151 ;38 :泸恢17 ;39 :密阳46 ;40 :绵恢501 ;41 :绵恢725 ;42 :明恢63 ;43 :明恢70 ; 44 :明恢77 ;45 :明恢86 ;46 :蜀恢162 ;47 :蜀恢527 ;48 :盐恢559 ;49 :宜恢1577 ;50 :镇恢 084 ;51 :CH238 ;52 :CH59 ;53 :中恢218 ;54 :中恢8006 ;55 :中恢111 ;56 :中恢1176 ;57 :中 恢333 ;58 :中恢161 ;59 :特青；60 :IR24 ;61 :中恢8012 ;62 :中恢8015 ;63 :中恢465 ;64 :
中恢7492 ;65細0 ;66 :恢66。
具体筛选方法 1.育性恢复基因特异性分子标记的筛选 水稻材料66份，包括23个野败型雄性不育系或保持系(1I-32B、D优62B、V20B、博 B、川香29A、菲改B、丰源A、冈46B、金23B、龙特浦B、内香2A、内香85A、天丰A、协青早B、印 32B、优IB、珍汕97B、中100A、中1A、中2B、中3B、中9B、中浙A)和43个恢复系(207、253、 926、CDR22、R402、To974、ZDZ057、测64、多系1号、恩恢58、辐恢718、广恢128、桂99、江恢 151 、泸恢17、密阳46、绵恢501 、绵恢725、明恢63、明恢70、明恢77、明恢86、蜀恢162、蜀恢 527、盐恢559、宜恢1577、镇恢084、CH238、CH59、中恢218、中恢8006、中恢111、中恢1176、 中恢333、中恢161、特青、IR24、中恢8012、中恢8015、中恢465、中恢7492、R600、恢66)。
应用于筛选的PCR标记11个，包括与Rf3连锁的微卫星标记6个(RM10338、 RM10340、RM10353、RM6289、RM3746、RM10376)、与Rf4连锁的标记微卫星标记3个(RM6100、 RM3510、 RM1108)和序标位标记2个(0860、0159)。采用通用实验方法进行DNA提取、PCR 扩增，扩增产物在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测，硝酸银银染显色。
如图1A所示，在Rf3连锁标记RM10338的检测结果中，23份不育系材料的带型与 43份恢复系的带型都不相同，即RM10338可挑选为鉴别Rf3不同基因型的特异性标记；如 图1B所示，在Rf4锁标记RM6100的检测结果中，43个恢复系中有38个检测到所有不育系 都未检测到的条带(较长的片段)，即RM6100可挑选为鉴定Rf4恢复基因的特异性分子标 记。 2.分离群体验证 为验证上述标记选择的可靠性，选择在Rf3和Rf4基因上分离的112个重组自交 系，应用RM10338、RM10353、RM6100和RM1108鉴定，筛选获得20份候选恢复系和27份候选
4保持系，分别与中9A和协青早A配置杂交组合，考查F1自然结实率。候选恢复系与中9A 和协青早A的Fl平均结实率分别为60. 3%和63. 1 %，候选保持系与中9A和协青早A的 Fl平均结实率分别为18. 8%和14.2%。这些结果表明，利用RM10338、RM10353、RM6100和 RM1108进行水稻CMS育性恢复基因基因型的选择是有效的。
权利要求
一种水稻育性恢复基因特异性分子标记的筛选方法，其特征在于应用在目标基因座位上携带不同等位基因的水稻种质资源，筛选出在不同等位基因上呈特异性差异的分子标记；即应用携带和不携带育性恢复基因的水稻种质资源，从与水稻育性恢复基因Rf3和Rf4紧密连锁的分子标记中，筛选出不育系和(或)恢复系呈特异带型的分子标记。
2. 如权利要求1所述的一种水稻育性恢复基因特异性分子标记的筛选方法，其特征在 于选用23个野败型细胞质雄性不育系和43个恢复系籼稻材料，从与Rf3紧密连锁的分子 标记中，筛选出在不育系和(或)恢复系呈特异带型的分子标记RM10338和RM10353。
3. 如权利要求2所述的一种水稻育性恢复基因特异性分子标记的筛选方法，其特征在 于选用23个野败型细胞质雄性不育系和43个恢复系籼稻材料，从与Rf4紧密连锁的分子 标记中，筛选出在恢复系呈特异带型的分子标记RM6100和RM1108。
4. 如权利要求2和3所述的一种水稻育性恢复基因特异性分子标记的筛选方法，其特 征在于鉴定分离群体各材料在Rf3和Rf4座位上的基因型，获得恢复系和不育系材料，通过 育性鉴定验证其效应。
全文摘要
本发明提供了一种筛选水稻育性恢复基因特异性分子标记的方法，其特征为，应用携带和不携带育性恢复基因的水稻种质资源，从与水稻育性恢复基因Rf3和Rf4紧密连锁的分子标记中，筛选出不育系和(或)恢复系呈特异带型的分子标记。利用这些标记进行水稻育性恢复基因的分子标记辅助选择，可提高籼型水稻不育系和恢复系的育种效率。
文档编号C12Q1/68GK101717819SQ200910155608
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月17日 优先权日2009年12月17日
发明者元芳丽, 庄杰云, 樊叶杨, 黄得润 申请人:中国水稻研究所