专利名称：一种诱导全能干细胞成为间充质干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种诱导全能干细胞成为间充质干细胞的方法。
(二)
背景技术：
人体各种组织的损伤极为普遍，特别像骨、软骨缺损以及肌腱、韧带等结缔组织损 伤越来越多(占运动损伤的50%)，而皮肤损伤更是不计其数。有数据表明，在2001年，欧 洲的骨移植手术有408000例，而单美国就有605000例。目前，全球65岁以上的人口每年以 2 3%的速度增长。以及由于人们物质生活水平的提高、生活方式的改变以及医学水平的 提高这些都导致了对额肌腱、韧带、软骨、骨移植、骨修复手术的更多需求和更广泛的应用。
在我国，据不完全统计，全国每年因各类交通事故、骨科疾病等因素，造成骨缺损 或骨损伤的患者有300万人，骨骼不健全的人数有上千万，据估计全国每年个体匹配骨骼 的市场总额至少在五千万元以上。肌腱损伤是最常见的运动性损伤之一，约占其50%以上。 肌腱断裂后，相应的关节失去活动功能。统计表明，每2亿人口中一年至少有上千万的肌腱 损伤病例。另外由于生活方式的改变，长期使用电脑键盘以及输送手机短讯等导致的手部 肌腱损伤病例也以每年5%的速度增加。 目前临床运动器官的损伤以及皮肤等组织缺损主要靠自体/异体组织来修复加 强，或者靠不可降解的生物材料来修复。但是这些治疗方法都有其固有的缺陷。如移植自 体组织需要牺牲供区的功能，且供应十分有限；异体组织来源困难且可能存在免疫和病理 上的问题。 目前组织工程的方法被认为是再生运动器官损伤以及皮肤等组织缺损的最有应 用前景的方法，目前已有许多研究探索组织工程方法再生缺损组织的应用。据权威杂志柳 叶刀报道，最近组织工程气管已成功的应用于气管缺损的病人，为组织工程应用于组织再 生提供了依据。组织工程是复合种子细胞、材料及生长因子在体内或体外构建功能性组织 用于修复或再生缺损组织的方法。种子细胞是组织工程中重要的基本元素，是构建的组织 具有功能和体内再生缺损组织的基础。 目前应用于结缔组织再生的细胞主要有各种组织来源的成体间充质干细胞、皮肤 成纤维细胞等分化成熟的体细胞和全能干细胞(胚胎干细胞以及从体细胞来源的诱导全 能干细胞(iPS))。但是这些细胞来源都有其固有的缺陷1)分化成熟的体细胞只具有有限 的分化及扩增能力。2)间充质干细胞具有较强的分化及扩增能力，然而仍未能达到类似胚 胎组织的完全再生的能力。3)胚胎干细胞是最早的胚胎细胞，具有全能分化能力，被认为最 具有再生潜能的细胞，然而由于其具有很强的致瘤性，未分化的胚胎干细胞无法应用于修 复。4)iPS类似胚胎干细胞，未分化的iPS无法应用于修复。但可由自体细胞而来，故有更 广泛的应用前景。但鉴于胚胎干细胞及iPS的组织再生潜能，如将胚胎干细胞或iPS定向 诱导分化成结缔组织干细胞或前体细胞(间充质干细胞及骨、软骨、肌腱等祖细胞)，去除 其致瘤性，就能使全能干细胞应用于组织工程修复。目前将全能干细胞诱导成间充质干细 胞方法较为繁琐且成本较高，需要使用流式等方法纯化细胞。因此，寻找一种简便低成本且不另加试剂的方法诱导全能干细胞成为间充质干细胞，是全能干细胞应用于结缔组织工程提供前提。
发明内容
本发明目的是提供一种简单、高效的诱导全能干细胞成为间充质干细胞的方法。
本发明采用的技术方案是 —种诱导全能干细胞成为间充质干细胞的方法，所述方法包括
(1)将全能干细胞培养于丝裂霉素处理过的小鼠MEF饲养层(处理方法参见《小鼠胚胎干细胞的培养——饲养层的制备》，细胞生物学杂志Chinese Journal of CellBiology 2009,31 (2) :291-292)上，用细胞培养基I培养3 5天，全能干细胞长满后用胰酶-EDTA(即胰酶/EDTA消化液，胰酶浓度0. 01 0. 05X，EDTA浓度0. 01 0. 05%，w/v)消化成单细胞悬液；所述细胞培养基I终浓度组成如下5 20% (w/v，质量体积百分比浓度，某组分浓度1 %表示lOOmL培养液中含有该组分lg) K0血清替代物，1 5mM L-谷氨酰胺，O. 5 5. 0% (w/v)非必需氨基酸，5 20ng/ml碱性成纤维生长因子2， 50 200U/ml青霉素，50 200U/ml链霉素，溶剂为K0-DMEM ; (2)步骤(1)单细胞悬液以100 1000cell/ci^密度种植于培养皿上，于细胞培养基II中进行传代培养；所述细胞培养基II终浓度组成如下10 30% (w/v)胎牛血清，50 200U/ml青霉素，50 200U/ml链霉素，溶剂为低糖DMEM ; (3)步骤(2)培养获得的第三代细胞再以2 10cell/cm2密度种植于培养皿上，于细胞培养基III中培养直至单克隆细胞长出，即得所述间充质干细胞；所述细胞培养基III终浓度组成如下:5 20% (w/v)胎牛血清，50 200U/ml青霉素，50 200U/ml链霉素，溶剂为低糖DMEM。 所述的细胞为由全能干细胞诱导分化而来，经特定培养基下经低密度种植而成的成纤维样细胞，具骨、软骨、肌腱及脂肪分化能力，与成体细胞相比还具有良好的扩增能力，可传代至15代以上而保持原来特性。 所述胚胎干细胞可采用市购商品，如WiCell Inc公司的Hl、H9细胞系，也可从废弃胚胎中获得。由胚胎中获得胚胎干细胞的具体方法如下1.收集IVF/ICSI治疗周期第三天的低质量胚胎，体外培养至5到6天时，可分出内细胞团在小鼠胚胎成纤维细胞上培养，9 15天后将长出的内细胞团吹散或者胰酶消化，继续在小鼠成纤维细胞上培养。2.挑选出具有均一的未分化形态的单细胞克隆团，吹散成50 100细胞小团后现培养。3.如此重复，直至成系。 间充质干细胞鉴定1)细胞形态观察。细胞贴壁为分化第一天，每天观察贴壁细胞形态，单克隆细胞筛选后成纤维样细胞比例>95%。 2)细胞表型鉴定，间质细胞表型阳性(CD44，CD90，CD105，CD106)，造血系表形阴性(CD34)，间质细胞占到95%以上。3)增殖、分化及组织分化能力细胞具有骨、软骨及脂肪三系分化能力。 优选的，所述步骤(1)中细胞培养基I终浓度组成如下10% K0血清替代物，2mML-谷氨酰胺，1 %非必需氨基酸，10ng/ml碱性成纤维生长因子2， 100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，溶剂为KO-DMEM。 优选的，所述步骤(2)中细胞培养基II终浓度组成如下20%胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，溶剂为低糖DMEM。 优选的，所述步骤(3)中细胞培养基III终浓度组成如下10X胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，溶剂为低糖DMEM。 本发明是在以前研究的基础上进一步提高，利用简单的培养方法，使用成纤维细胞培养基及单克隆分选方法，纯化出间充质干细胞，使间充质干细胞含量在95%以上，可获得109以上间充质干细胞，从而获得足够的结缔组织种子细胞。此技术将促进全能干细胞应用于肌腱、骨、软骨及皮肤组织工程。
本发明的有益效果主要体现在 (1)本发明所获得细胞具有良好的扩境能力，可传至15代而保持特性，并具有形成骨，软骨及肌腱的能力； (2)本发明所获得细胞获得方法简单，效率高，无需流式，磁珠等分离纯化方法，大大降低了从全能干细胞获得间充质干细胞的成本； (3)本发明细胞适合于骨、肌腱、软骨、皮肤等组织的缺损修复和作为组织工程的种子细胞。
(四)
图1为全能干细胞贴壁分化原代细胞； 图2为全能干细胞来源的种子细胞形态，诱导后细胞形态具有高度的均一性；
图3为全能干细胞来源的种子细胞具有间充质干细胞表型； 图4为全能干细胞来源的种子细胞具有类似于间充质干细胞的三系分化能力A :骨分化能力，B :软骨分化能力，C :脂肪分化能力，D :肌腱分化能力； 图5为全能干细胞来源的种子细胞修复肌腱；A :种子细胞种植于fibrin胶；B :全能干细胞来源的种子细胞修复髌腱缺损； 图6为全能干细胞来源的种子细胞修复后肌腱；A :缺损部位出现类似肌腱的结构；B :缺损部位出现连续成熟的胶原纤维；T-正常肌腱，J_修复连接处，N_修复部位；
图7为全能干细胞来源的种子细胞修复软骨；A :全能干细胞来源的种子细胞修复后软骨缺损；B :全能干细胞来源的种子细胞修复后软骨缺损组织学。 图8为全能干细胞来源的种子细胞修复大块骨缺损；A :全能干细胞来源的种子细胞种植于脱钙骨构建组织工程骨；B :组织工程骨修复大块骨缺损。 图9为全能干细胞来源的种子细胞作为人胚胎干细胞的饲养层细胞人胚胎干细胞可在全能干细胞来源的种子细胞上正常生长。
(五)
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此 实施例1 (本实例试剂除特殊说明均购自Invitrogen公司)
1)培养孔用0. 1 % (w/w)明胶包被，把全能干细胞(人胚胎干细胞，由废弃胚胎中获得，方法见发明内容部分。废弃胚胎为经胚胎提供者本人及家属同意后捐赠)接种在丝裂霉素处理过的小鼠MEF饲养层上，用细胞培养基I于37°C，5% C02(剩余95%为空气)条件下培养3 5天，当细胞长满后使用0. 025 %胰酶-0. 05% EDTA (Invitrogen)消化，吹
散，获得单细胞悬液。 MEF饲养层处理 1.取新的培养瓶，加0. 1 % Gelatin (SigmaG2500)溶液覆盖预处理30min，用前吸掉Gelatin溶液。 2.取需要处理的MEF细胞，Mitomycin C(Sigma M0503)以10mg/ml工作浓度加在
MEF培养液里，混匀。 3.置培养箱中作用3h。 4.吸弃废液。 5.用PBS洗5遍。 6.加0.025% Trypsin-EDTA消化。在显微镜下观察，当少量细胞漂浮，贴壁的细胞层出现裂隙时，用移液管吹打冲洗瓶底5 6次。
7.即刻加适量MEF完全培养液终止消化。8.细胞悬液转移到离心管中，离心1000r/min，5min。吸弃上清液。 9.处理过的MEF细胞加适量培养液重悬计数，以3. 0 X 104个/cm2 (MEF)密度均匀
地铺在明胶(gelatin)处理过的培养瓶上。 10.置培养箱中静置过夜，使其贴壁。 细胞培养基I终浓度组成如下10 % (w/v) KO血清替代物(Invitrogen)，2mM卜谷氨酰胺，1% (w/v)非必需氨基酸(Invitrogen) ， 10ng/ml碱性成纤维生长因子2 (FGF2) ， 100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，溶剂为KO-DMEM。 MEF完全培养液10% (w/v)胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，溶剂为高糖DMEM。 2)单细胞悬液以500 600cell/cm2密度种植于培养皿上，于细胞培养基II中进行传代培养；所述细胞培养基II终浓度组成如下20% (w/v)胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，溶剂为低糖DMEM ; 3)步骤2)培养获得的第三代细胞(细胞成较均一的成纤维样细胞)再以6 10cell/cm2密度种植于培养皿上，于细胞培养基III中培养直至单克隆细胞长出，即得所述间充质干细胞；所述细胞培养基III终浓度组成如下20% (w/v)胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，溶剂为低糖DMEM。见细胞呈均一的成纤维样细胞，并具有间充质表型(图1 图3)。
实施例2: 将实施例1所得的细胞培养至长满后，种植2. 5X 107细胞(50ul，5X 107ml)于壳聚糖凝胶，构建组织工程软骨(见图4B)。
实施例3 : 将实施例1所得的细胞培养至长满后，加50ug/ml维生素C培养14天后形成细胞片，将细胞片在静态张力剌激下(拉伸10% )培养2周，组织学及电镜观察，见细胞在力学方向上有规律排列，构成体外组织工程肌腱(见图4D)。
实施例4 : 将实施例1所得的细胞植入大鼠体内用于修复髌韧带缺损，种植5X1QS细胞(20ul，2.5X107ml)于Fibrin凝胶，种植于大鼠髌韧带内。4周后可发现组织长入缺损部位，形成了功能性肌腱组织(见图5，6)。
实施例5 : 将实施例1所得的细胞植入大鼠用于修复膝关节软骨缺损，5乂105细胞(20ul，2.5X107ml)于胶原凝胶，4周后组织长入良好，可形成功能性软骨组织，没有明显的炎性反应(见图7)。
实施例6 : 将实施例3所得的细胞片与脱钙骨复合构建组织工程骨(见图8A)，用于修复桡骨缺损(见图8B)，可促进新生骨组织长入。
实施例7: 将实施例1所得的细胞经丝裂霉素c处理后作为人胚胎干细胞饲养层细胞(见图9):人胚胎干细胞可正常生长。
权利要求
一种诱导全能干细胞成为间充质干细胞的方法，所述方法包括(1)将全能干细胞培养于丝裂霉素处理过的小鼠MEF饲养层上，用细胞培养基I培养3～5天，全能干细胞长满后用胰酶-EDTA消化成单细胞悬液；所述细胞培养基I终浓度组成如下5～20％KO血清替代物，1～5mM L-谷氨酰胺，0.5～5.0％非必需氨基酸，5～20ng/ml碱性成纤维生长因子2，50～200U/m1青霉素，50～200U/ml链霉素，溶剂为KO-DMEM；(2)步骤(1)单细胞悬液以100～1000cell/cm2密度种植于培养皿上，于细胞培养基II中进行传代培养；所述细胞培养基II终浓度组成如下10～30％胎牛血清，50～200U/ml青霉素，50～200U/ml链霉素，溶剂为低糖DMEM；(3)步骤(2)培养获得的第三代细胞再以2～10cell/cm2密度种植于培养皿上，于细胞培养基III中培养直至单克隆细胞长出，即得所述间充质干细胞；所述细胞培养基III终浓度组成如下5～20％胎牛血清，50～200U/ml青霉素，50～200U/ml链霉素，溶剂为低糖DMEM。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中细胞培养基I终浓度组成如 下10XK0血清替代物，2mM L-谷氨酰胺，1 %非必需氨基酸，10ng/ml碱性成纤维生长因子 2， 100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，溶剂为KO-DMEM。
3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中细胞培养基II终浓度组成如 下20%胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，溶剂为低糖DMEM。
4. 如权利要求l所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中细胞培养基III终浓度组成 如下10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，溶剂为低糖DMEM。
全文摘要
本发明提供了一种诱导全能干细胞成为间充质干细胞的方法，本发明利用简单的培养方法，使用成纤维细胞培养基及单克隆分选方法，纯化出间充质干细胞，使间充质干细胞含量在95％以上，可获得109以上间充质干细胞；本发明的有益效果主要体现在(1)本发明所获得细胞具有良好的扩境能力，可传至15代而保持特性，并具有形成骨，软骨及肌腱的能力；(2)本发明所获得细胞获得方法简单，效率高，无需流式，磁珠等分离纯化方法，大大降低了从全能干细胞获得间充质干细胞的成本；(3)本发明细胞适合于骨、肌腱、软骨、皮肤等组织的缺损修复和作为组织工程的种子细胞。
文档编号C12N5/074GK101709289SQ20091015548
公开日2010年5月19日 申请日期2009年12月15日 优先权日2009年12月15日
发明者宋兴辉, 欧阳宏伟, 茵梓, 陈晓 申请人:浙江大学