Gr2酶基因在培育抗光氧化胁迫转基因植物中的应用的利记博彩app

专利名称：：Gr2酶基因在培育抗光氧化胁迫转基因植物中的应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及GR2酶基因在培育抗光氧化胁迫转基因植物中的应用。
背景技术：
：植物的光合作用和呼吸作用都会产生活性氧，胁迫条件下，如高光、低温等都会引起活性氧的产生明显增加，大量积累的活性氧若不及时清除，就会对植物造成光氧化胁迫伤害(Noctor,G.andFoyer,C.H.(1998)Ascorbateandglutathione:keepingactiveoxygenundercontrol.Annu.Rev.PlantPhysiol.尸/awfMb/.5w/.,49:249-79)。植物体内存在抗氧化系统，能及时清除过量的活性氧，以维持体内正常的代谢。抗坏血酸一谷胱甘肽循环是植物清除11202的重要途径(Mittler,R.(2002)Oxidativestress,antioxidantsandstresstolerance.7>e"&;/aWsc/e"ce7:405-410)。在此循环中，抗坏血酸过氧化物酶(APX)催化11202与抗坏血酸(ASC)反应，生成单脱氢抗坏血酸(MDA)禾口H20。单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)可以利用NADPH将MDA还原生成ASC。MDA也可以裂解形成脱氢抗坏血酸(DHA)，DHAR利用还原性谷胱甘肽(GSH)将DHA还原，生成ASC，同时GSH被氧化生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，谷胱甘肽还原酶(GR)可以利用NADPH还原GSSG，生成GSH。叶绿体、细胞质、线粒体、过氧化物体、外质体都存在抗坏血酸-谷胱甘肽循环途径。植物体中GR酶有多种同工酶，分布在细胞的叶绿体、线粒体和细胞质中(FoyerC.H.andHalliwell,B.(1976)Thepresenceofglutathioneandglutathionereductaseinchloroplast:Aproposedroleinascorbicacidmetabolism.ZVa齒,133:21-25;Edwards,E.A.,Rawsthorne，S.andMullineaux，P.M.(1990)Subcellulardistributionofmultipleformsofglutathionereductaseinleavesofpea(P&画虚/v應L.).尸/a她,180:278-284)。植物中的GR酶编码基因可能为一个基因家族(Edwardsetal.，1990;Madamanchi,N.R.,Aderson,J.V.,Alscher,R.G.，Cramer,C丄.andHess,J丄.(1992)Purificationofmultipleformsofglutathionereductasefrompeaseedlingsandenzymelevelsinozone-fumifatedpealeaves.尸/fl^尸A，Zo/.,100:138-145)。在烟草中已经发现两种GR酶编码基因，分别编码细胞质中GR酶(GR1)和叶绿体GR酶(GR2)(Creissen,G.P.andMullineauxP.M.(1995)CloningandcharacterizationofglutathionereductasecDNAsandidentificationoftwogenesencodingthetobaccoenzymes.尸/a她,197:422-425)。本发明的目的在于提供一种培育抗光氧化胁迫转基因植物的方法。本发明提供培育抗光氧化胁迫转基因植物的方法是将所述GR2酶基因导入植物中，得到的抗光氧化胁迫植物。上述GR2酶基因序列是Genbank号为X76293(gi:431954)的自5'端第1-1675位的核苷酸序列。所述植物为烟草。所述GR2酶基因通过表达载体导入植物中，所述表达载体是将GR2酶基因插入pCAMBIA1301的多克隆位点，得到的重组载体。本发明的另一目的在于提供一个DNA片段，是双链DNA片段，其名称为igr,由基因片段A、B和C依次连接组成；所述基因片段A的核苷酸序列为序列表中的序列1(名称为igrl)，所述基因片段C的核苷酸序列为序列表中的序列2(名称为igr2);所述基因片段B是内含子。上述内含子的核苷酸序列是序列表中序列3。含有上述DNA片段的重组载体属于本发明的保护范围。上述重组载体是将上述的DNA片段插入pART27的多克隆位点，得到的重组载体，该重组载体具体可以是图2所示的pARTigr。含有上述DNA片段的转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。本发明的另一目的在于提供一种DNA分子，其核苷酸序列是序列表中的序列1。本发明的又一目的在于提供一种DNA分子，其核苷酸序列是序列表中的序列2。本发明还提供了上述DNA片段或上述重组载体在培育光氧化胁迫敏感型转基因植物中的应用。上述光氧化胁迫敏感型转基因植物是抗光氧化胁迫能力降低的转基因植物。本发明利用RNAi技术，将igr导入烟草中，获得了低温条件下抗氧化能力大大降低的转基因烟草。该转基因烟草与野生型对照相比，GR2酶的酶活降低，^r^的转录水平降低，GR2酶的表达量降低。在低温条件下，转基因烟草的每株鲜重、叶绿素含量以及光合作用能力也明显低于野生型对照；转基因烟草抗光氧化的能力大大降低，活性氧和MDA明显积累。该DNA片段导入烟草中获得的抗光氧化胁迫能力降低的转基因植物可以作为模式植物或者筛选材料，用来筛选能够提高植物抗光氧化胁迫的激素或化合物或者基因。将GR2酶基因导入烟草中，可使GR2酶过表达，提高了烟草抗光氧化胁迫能力，因此有利于农作物产率的提高。图1为RT-PCR获得烟草GR2酶的基因的部分片段，其中M为DNA分子量标准，1为primerigrl的RT-PCR产物，2为primerigr2的RT-PCR产物。图2为烟草GR2酶基因的RNAi双元转化载体构建流程图。图3为质粒的双酶切鉴定图，其中A为pKAigr的双酶切鉴定，B为植物双元转化质粒pARTigr的双酶切鉴定，其中M均为DNA分子量标准；1均为大肠杆菌转化株系的质粒DNA双酶切(EcoRI，Xbal)结果。图4为pARTigr根癌农杆菌质粒的PCR检测图，其中M为DNA分子量标准；l为不同的根癌农杆菌转化菌株。图5为烟草转化及Tl代种子在Kan抗性培养基上的萌发图片，其中A为农杆菌浸染后的叶圆片在Kan抗性培养基上的分化图；B为分化幼苗的生根图；C为Tl代烟草种子在Kan抗性培养基上的萌发图。图6为转pARTigr烟草的PCR检测，其中M为DNA分子量标准，wt为野生型对照烟草，iT为转化pART27的烟草，i2-i46为不同igr转基因烟草。图7为转pARTigr烟草的RT-PCR检测，其中A为RNA电泳图；B为RT-PCR电泳图。图8为不同转pARTigr烟草GR酶总蛋白在垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳上的Western杂交结果图，其中wt,iT，i2,i21，i28，i42的电泳上样量为15tig蛋白，1/2wt，1/4wt分别是野生型对照烟草上样量的1/2和1/4。图9为低温条件下转基因烟草的生长。图10为低温条件下不同转pARTigr烟草中MDA和活性氧的积累。图11为低温条件下不同转pARTigr烟草中活性氧清除途径谷胱甘肽-抗坏血酸途径中抗氧化酶的变化。图12为低温条件下不同转pARTigr烟草中活性氧清除途径谷胱甘肽-抗坏血酸途径中抗氧化物的变化。其中，图7、图8、图9、图10、图11和图12中wt均为野生型对照烟草，iT均为转化pART27的烟草，i2，i21，i28，i42均为不同转pARTigr烟草株系。图13为RT-PCR获得烟草GR2酶基因的片段，M为DNA分子量标准，1为RT-PCR产物。图14为pCAMBiA1301gr的双酶切鉴定，M为DNA分子量标准，1为pCAMBIA1301gr经NcoI、BstEII酶切结果。图15为pCAMBIA1301gr根癌农杆菌质粒的PCR检测，M为DNA标准；1为根癌农杆菌转化菌株。图16为eGR转基因烟草基因组的PCR检测，wt为野生型对照烟草；el、e2等为不同转pCAMBIA1301gr烟草，eT为转化pCAMBIA1301质粒的转基因烟草。图17为MV处理对不同eGR转基因烟草的伤害。wt为野生型对照烟草，e6、e8为不同转pCAMBIA1301gr烟草，eT为转化pCAMBIA1301质粒的转基因烟草。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1.培育转pARTigr烟草及其检测一、转基因烟草的获得1、转化载体的构建1)目的基因的克隆取烟草幼苗叶片约0.2g，用Trizol方法提取烟草RNA，进行反转录生成第一链DNA，根据Genbank中已知的烟草GR2酶的基因序列设计引物，该序列是Genbank号为X76293(gi:431954)的5'端第130-1098位的核苷酸序列，设计的引物序列如下primerigrl:upper:5'-TTCGAATTCTTCTCACCCACTCCCGTA画3';EcoRllower:5'-CACGGTACCTTGTCATTTTCACTCCCACT-3，。Kpnlprimerigr2:upper:5，-GATTCTAGATTCTCACCCACTCCCGTA-3，。Xballower:5，-GGCGATCGATTTGTCATTTTCACTCCCACT-3，。Clal分别以上述primerigrl和primerigr2为引物，以反转录产生的第一链DNA为模板进行PCR扩增，反应程序为94。C3min;94°C变性45s;，59°C45s;卜25个循环72°C延伸30s;J72°C延伸lOmin;PCR扩增获得两条片段igrl和igr2，igrl的核苷酸序列是序列表中的序列1，igr2的核苷酸序列是序列表中的序列2，两条片段大小均为960bp左右(如图1)。分别回收PCR产物，连接于pGEM-TEasyvector(Promega公司)，生成pGEMigrl和pGEMigr2，分别转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，酶切鉴定正确后送博亚生物公司测序。测序结果表明目的片段的DNA序列与GenBank中公布的序列一致。2)双元转化载体的构建烟草GR2酶基因的RNAi双元转化载体构建流程如图2所示，将上述测序正确的pGEMigrl经EcoRI和Kpnl双酶切，回收小片段，连接于经同样酶切的质粒pKANNIBAL(Constructdesignforefficient,effectiveandhigh-throughputgenesilencinginplants,PlantJournal,2001,27(6)581-590)(CSIR0惠赠)(公众可从CSIROPlantIndustry(CSIR0PlantIndustry,CnrCluniesRossStreetandBarryDriveBlackMountain,Canberra,ACT,邮寄地址GP0Boxl600CANBERRAACT2601AUSTRALIA)或中科院植物所光合中心获得)，生成pKAigrl，转化大肠杆菌后进行酶切鉴定；然后将上述测序正确的pGEMigr2经Xbal和Clal双酶切，回收小片段，连接于经同样酶切的pKAigrl，生成沐Aigr，在pKAigr中，igrl和igr2之间具有内含子，其核苷酸序列如序列表中的序列3所示，然后将pKAigr转化大肠杆菌，进行酶切鉴定(图3A)。Notl酶切pKAigr，回收小片段，连接于经Notl酶切的pART27质粒(Constructdesignforefficient,effectiveandhigh-throughputgenesilencinginplants,PlantJournal,2001,27(6)581-590)(CSIR0惠赠)(公众可从CSIROPlantIndustry(CSIROPlantIndustry,CnrCluniesRossStreetandBarryDriveBlackMountain,Canberra,ACT,邮寄地址GP0Boxl600CANBERRAACT2601AUSTRALIA)或中科院植物所光合中心获得)，生成pARTigr，转化大肠杆菌后酶切鉴定(如图3B)。2、pARTigr的根癌农杆菌转化用下述三亲杂交方法转化根癌农杆菌LBA4404(中科瑞泰生物公司)，在Kan、Str、Rif三抗培养基上筛选阳性克隆，挑取单克隆于含Kan、Rif抗生素的YEP培养基(lLYEP培养基中含10g胰蛋白胨；10g酵母提取粉；5gNaCl，其余为水，高压灭菌1520min)中振荡培养至对数生长期，收集少量菌体，用primerigrl引物进行菌落PCR检测，结果如图4所示，用primerigrl从重组农杆菌菌株可以PCR到条带专一、大小在960bp左右的目的条带，表明目的质粒转化至根癌农杆菌中。同样的方法进行pART27的农杆菌转化。三亲杂交法1)挑取含植物表达载体的大肠杆菌DH5a单克隆，接种于附加卡钠霉素(Kan)(100mg/L)的LB液体培养基中，37'C过夜振荡培养。2)挑取含pRK2013辅助质粒的大肠杆菌朋101(中科瑞泰生物公司)，接种于附加Kan(100mg/L)的LB液体培养基中，30。C过夜振荡培养。3)挑取LBA4404根癌农杆菌单克隆，接种于附加Rif(100mg/L)和Str(50mg/L)的YEP液体培养基中，28。C振荡培养48h。4)分别取上述三种00600=0.6的菌液各100|il，放入同一个无菌1.5ral离心管中混匀，12000g离心30s，弃上清，加入0.5ml新鲜无抗生素的LB液体培养液重悬菌体，将菌液点在无抗生素的LB平板上(16点)，超静台中吹干后28。C过夜共培养。5)用接种环交叉三环，稀释于500^1的新鲜LB液体培养液中，按102、103和104的比例配比稀释，涂布于附加Kan(100mg/L)、Rif(100mg/L)、Str(50mg/L)三抗的YEP平板上，吹干后，于28'C倒置培养至少48h。6)筛选阳性克隆。3、烟草的转化用叶圆盘方法转化烟草W38(北京市种子站)，将含有pARTigr的根癌农杆菌侵染叶圆片，侵染后的叶圆片在含卡钠霉素(300ug/ml)的筛选培养基上生长，每1周后更换一次新的筛选培养基，生长分化2周后，实验组中浸染叶圆片中可见有愈伤分化(图5A-a),分化4-6周后成幼芽(图5A-b)，而未经农杆菌侵染的叶圆片在筛选培养基上不能分化生长直至变黄枯死(图片未显示)。实验组中幼芽生长出比较明显的幼叶时剪下插入生根培养基中生根培养(图5B)。生根的幼苗栽种在温室中生长直至开花结籽，收获Tl代转基因烟草种子。T1代种子在含卡钠霉素(Kan)(300ug/ml)的MS培养基上萌发(图5C)。野生型对照烟草种子不能正常萌发生长，而转pARTigr烟草种子只有很小一部分不能正常萌发生长，这是可能由于遗传分离造成的。萌发试验表明目的基因通过母本传递给子一代。按照获得转基因烟草(转pARTigr烟草)的方法，得到空载体植物即转pART27烟草和Tl代转pART27烟草种子。二、转基因烟草的检测1、转基因植株基因组DNA的PCR鉴定Tl代转基因烟草(转pARTigr烟草)种子分别在含卡钠霉素的培养基上筛选后，移栽到蛭石中在培养间中生长6周，取烟草叶片，CTAB小量提取方法提取基因组DNA，用primerigrl引物对不同的转基因烟草进行PCR检观ij，野生型对照烟草和转pART27烟草的基因组DNA的PCR鉴定步骤同上，结果如图6所示，野生型烟草植株屮以及转pART27烟草不能扩增出任何条带，而在转pARTigr烟草中可见条带专一的960bp左右的条带。2、转基因烟草GR酶总活测定分别取培养间中生长6周的转pARTigr烟草幼苗叶片、野生型对照烟草幼苗叶片和转pART27烟草幼苗叶片，液氮研磨，提取可溶性蛋白，按下述方法进行GR酶总活性的测定。实验重复7次，结果如表l(wt为野生型对照；iT为转pART27烟草株系；i2-i46为不同转pARTigi"烟草株系)所示，在不同的转pARTigr烟草中约30—70%的GR酶总活性被抑制。根据不同的GR酶总活性，本发明选择转pARTigr烟草植株i2(GR酶总活约为对照的70X)、i21、i28和i42(GR酶总活性约为对照的30%)，用于以后的试验。GR酶总活性的测定法参照(Gonzdlez,A.，Steffen，K丄.andLynch,J.P.(1998)Lightandexcessmanganese:implicationsforoxidativestressincommonbean.P/y;wW.,118:493-504)的方法。反应体系中含有100mMK2HP04-KH2P04缓冲液，pH7.5;2.5mMEDTA;0.75mMDTNB(5,5'匿dithiobis(2-nitrobenzoicacid)二硫二硝基苯甲酸)；0.1mMNADPH;1mMGSSG;40吗蛋白的酶液。反应总体积为1ml，用0.1mMNADPH启动反应，反应在25。C下进行。生成的产物在412nm处有吸收峰。反应方程式如下NADPH+H++GSSG—NADPf+2GSH;GSH+DTNB—GSTNB+TNB;用sigma公司商用谷胱甘肽还原酶做标准曲线。酶活单位是unitmg.1protein;其中，一个酶活力单位U的定义在25。C、pH为7.5条件下，每分钟内催化l)oM底物的酶量。表1不同转基因烟草中GR酶总活性。括号内的数据为GR总活性的相对百分数，试验数据为7个重复的平均值士SE。3、转基因烟草的RT-PCR检测用RT-PCR方法来检测转基因植株中GR酶的威NA转录水平。取温室中生长一致的转pARTlgr烟草幼苗叶片、转pART27烟草幼苗叶片以及野生型对照烟草幼苗叶片，用Trizol方法提取总RNA，在甲醛琼脂糖凝胶电泳上检测其提取质量。如图7A所示，不同烟草的总RNA在电泳图片上表现出较锐利的条带，没有明显的弥散，28S条带亮0.032±0皿(100)0.033±0.002(100)0.022±0.003(68.8)0.014±0.002(43.8)0.024±0.001(75)0.028士0.002(87.5)0.029±0扁(90.6)O.Oll士O扁(34.4)0.019±0.001(59.4)0扁±0.004(62.5)0.019±0扁(59.3)0.018±0.002(56.3)0.010±0扁(31.3)0.018±0週(56.3)O.OIO土O.OOI(31.3)0.020±0.003(62.5)度约为18S的2倍，表明我们提取的RNA具有较好的完整性。在260nm测定RNA的浓度，然后取相同量的RNA(2ug)用作模板，以primerigrl为引物，进行RT-PCR，以肌动蛋白(actin)的mRNA水平作为内标。i21、i28和i42烟草叶片中GR酶的转录水平明显低于对照烟草，i2中GR酶的转录处于中间水平，iT与野生型烟草无明显差异(图7B)。不同转pARTigr烟草中GR酶的转录水平分别和它们的酶活具有相似的趋势。4、转基因烟草植株的Western检测分别取不同转pARTigr烟草叶片、转pART27烟草叶片和野生型对照烟草叶片100mg，液氮中研磨后加入1.5ml含0.612M，0.07%巯基乙醇(体积百分比)的丙酮，继续研磨至匀浆状，一2(TC沉淀3h，4'C，8000g离心5min，用含0.07%(体积百分比)巯基乙醇的丙酮溶液洗3遍，沉淀干燥后溶于2XSDS增溶液，上样等蛋白量(15ug)，电泳，电泳结束后转膜，封闭，与一抗(制备方法如下所示)、二抗结合(二抗购买于中杉金桥公司)，用PIERCE公司的SuperSignalWesternPicoTrialKit进行显色，反应3-4min分钟后用X光片曝光显影。一抗的制备RT-PCR获得烟草GR2基因的编码序列(所用弓I物为upper:TCAAAGCTTGCTACATCTCTGAGCACACCA，lower:ACACTCGAGTCAAACTCCAGCTGCAGCTTT)。获得的PCR产物经Hindlll-Xhol酶切，连接于经同样双酶切的pET28a(天根生物公司)，连接后的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)(天根生物)。转化后的BL21细胞震荡培养至对数生长期后，加入0.4raMIPTG，震荡培养5h后，收集菌体，用His柱方法纯化回收目的蛋白(试剂盒购于Ncmigen)。从图8的结果中可以看出，不同转基因株系中GR酶的总蛋白含量具有明显的差异，i21、i28、i42中可检测到的GR蛋白总含量明显低于对照烟草，i2植株中的可检测到的GR蛋白总含量处于巾间水平(图15)，iT与野生型烟草无明显差异，表明不同转基因烟草中GR酶被不同程度的抑制。不同转基因烟草中GR蛋白总量分别与其酶活性，RNA含量的变化趋势是一致的。5、低温处理对转基因烟草的影响1)低温处理条件下不同转基因烟草的生K:Tl代转pARTigr烟草种子、转pART27烟草种子和野生型对照烟草种子在MS培养基萌发1周后，转到低温培养箱(ll土rC，连续光照，光强40txmo1m2sec—')培养3周。检测幼苗生长和叶绿素含量，实验重复5次，结果如图9所示，低温下不同转pARTigr烟草幼苗生长和叶绿素含量与对照相比均有明显差异。低温条件下转pARTigr烟草的生长明显受抑制。野牛型对照和iT烟草的每株鲜重无明显差异，约为8.9mg左右，而每株i21，i28，i42烟草的鲜重为7.7mg左右，i2烟草的每株鲜重为8.3mg。低温条件下转pARTigr烟草的叶绿素含量明显低于野生型烟草，i21，i28和i42的叶绿素含量(490-514Pgg—1FW)明显低于对照烟草(62lPgg—1FW)。i2的叶绿素含量稍稍低于对照烟草。iT烟草的叶绿素含量与野生型对照之间无明显差异。2)低温处理条件下不同转基因烟草光合作用的变化按照步骤l)的低温条件进行低温处理3周后的幼苗，用Flurocam荧光成像系统(PSI公司)测定不同烟草的光合作用的变化，结果如表2所示，转pARTigr烟草的Fv/Fm和NPQ明显低于野生型烟草，表明了转pARTigr烟草与野生型对照的烟草相比，光合作用能力下降。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>3)低温处理条件下不同转基因烟草MDA和活性氧积累的变化收获低温处理3周后的烟草小苗用于测定活性氧HA和MDA的积累。结果表明(图10)，低温处理后，转pARTigr烟草的MDA和HA的含量都明显高于野生型对照烟草，其中i21，i28和i42烟草中MDA和HA的含量最高，i2烟草中次之。iT和wt烟草中两者的含量最低，且两者之间无明显差异。表明低温胁迫条件下，转pARTigr烟草中大量积累的11202导致严重的膜脂过氧化，因而MDA大量积累，从而使转pARTigr烟草受到更严重的光氧化胁迫伤害。4)低温处理条件下不同转基因烟草谷胱甘肽-抗坏血酸循环途径的变化谷胱甘肽-抗坏血酸循环是植物中活性氧清除的重要途径。收获低温处理3周后的烟草小苗用于测定转pARTigr烟草抗坏血酸—谷胱甘肽循环中抗氧化酶的变化。图11的结果表明，低温处理后不同转pARTigr烟草i2、i21、i28和i42中GR酶的活性都不冋程度的低于野生型对照烟草，iT和wt之间无明显差异(图IIA)，但是APX、MDHAR、DHAR的活性在转基因烟草和野生型烟草之间无明显差异(图11B、C、D)。我们测定此抗氧化循环中的抗氧化物的结果表明(图12)，低温处理后，i2、m、i28和i42烟草中GSSG的含量明显高于对照，且i21、i28和i42烟草中GSSG的含量最卨(图12B)。GSH的含量在不同测定植株之间无明显差异(图12A)。低温处理后i2、i21，i28和i42中GSH/GSSG的比率明显低于对照烟草(图12C)。低温处理也会引起抗坏血酸的显著变化。i2、i21、i28和i42烟草中ASC的含量均明显低于对照烟草(图12D)，但是DHA的含量在所有测定烟草中无明显差异(图12E)。DHA/ASC的变化也很明显，i2、i21、i28和i42烟草中的DHA/ASC都明显低于对照烟草中DHA/ASC的比率(图12F)。在所有抗氧化系统的测定中，iT和wt之间都无明显差异。以上这些结果表明低温处理后，转pARTigr烟草中GR酶活性的降低导致谷胱甘肽-抗坏血酸循环中谷胱甘肽库和抗坏血酸库的变化，从而影响活性氧仏02的清除，引起其大量积累。实施例2.过表达GR2酶一、过表达GR2酶转基因烟草的获得1、目的基因的克隆取烟草幼苗叶片约0.2g，用Trizol方法提取烟草RNA，进行反转录生成第一链DNA，根据Genbank中已知的烟草GR2基因序列(X76293，gi:431954)的自5'端第1-1675位的核苷酸序列设计引物，引物序列如下primergr:upper:5'ATCGCATGGGGCTACATCTCTGAGCACAC3，Ncollower:5，ATGGGTTACCTCAAACTCCAGCTGCAGCTT3'BstEII以上述priniergr为引物，以反转录产生的第一链DNA为模板进行PCR扩增，反应程序为94。C3min;94°C变性45s;，58°C45s;卜25个循环72°C延伸2min;」72°C延伸10min;PCR扩增获得专一的目的条带，约为1700bp左右的片段(如图13)。回收PCR产物，连接于pGEM-TEasyvector(Promega公司)，生成pGEMgr，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，酶切鉴定正确后送博亚生物公司测序。测序结果表明目的片段的DNA序列与GeneBank为X76293(gi:431954)的自5'端第1-1675位的核苷酸序列一致。2、双元转化载体的构建将pCAMBIA1301(中科瑞泰生物公司)经Ncol、BstEII双酶切，切下GUS片段，回收大片段。将测序正确的pGEMgr，经NcoI、BstEII双酶切，回收1700bp左右的片段，将上述两个片段连接，经NcoI、BstEII酶切鉴定正确的连接质粒(图14)(命名为pCAMBIA1301gr)用于转化根癌农杆菌。3、pCAMBIA1301gr的根癌农杆菌转化按照实施例1中步骤一中的步骤2提供的方法，进行pCAMBIA1301gr的根癌农杆菌转化，用primergr进行菌落PCR，检测质粒转化情况(图15)。4、烟草的转化按照实施例1中步骤一中的步骤3中提供的方法，进行烟草的转化，在潮霉素抗性培养基上进行筛选，得到转pCAMBIA1301gr烟草。按照获得转pCAMBIA1301gr烟草的方法，得到空载体植物即转pCAMBIA1301烟草。二、转pCAMBIA1301gr烟草的检测1、转pCAMBIA1301gr烟草植株基因组DNA的PCR鉴定。提取不同转pCAMBIA1301gr烟草的基因组DNA，对pC細BIA1301质粒上的35S启动子进行PCR检测，所用引物为35Supper:GAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGA;35Slower:CCGTGTTCTCTCCAAATGAAATGAACT。PCR结果如图16所示，结果表明在eT和大部分转pCAMBIA1301gr烟草中能得到专一的480bp左右的条带，而wt中不能获得此专一条带。2、转pCAMBIA1301gr烟草GR酶总活性的检测经PCR检测的转基因烟草小苗在培养间中培养6周后，取叶片测定其GR酶的总活性。一个酶活力单位U的定义在25'C、pH为7.5条件下，每分钟内催化1^M底物的酶量。测定结果如表3中所示，不同转pCAMBIA1301gr烟草中GR酶的总活性约为烟草对照的2-5倍，其中的e6，e8中GR酶的总活性是野生型烟草对照的5倍左右，因此我们选取e6，e8用于以后的处理实验。表3.不同转pCAMBIA1301gr烟草中GR酶总活性。括号内的数据为GR总活性的相对百分数，试验数据为7个重复的平均值iSE，0.032±0.002(100)0.03l士0皿(100)0.102±0.007(318)0.097士0.012(303)0.142±0.009(443)O扁士O.Oll(212)0.125±0.011(390)0.163±0扁(509)0.072±0.004(225)0.165土0.0丄5(516)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注wt为野生型对照烟草；el、e2等为不同转pCAMBIA1301gr烟草株系；eT为转化pCAMBIA1301质粒的转基因烟草。3、MV处理对转pCAMBIA1301gr烟草的影响甲基紫精(MV)能够阻断电子传递，从而将02还原生成02—，因此MV处理可以造成氧化胁迫。光下MV处理对植物叶片造成的光漂白伤害常常用来检测不同植株的抗光氧化能力。本发明用MV处理转pCAMBIA1301gr烟草的离体叶片，结果如图所示(图17)，MV处理后e6和e8的抗光氧化能力朋显高于野生型烟草对照的抗光氧化能力。以上这些结果表明在烟草中过量表达其GR2酶基因，能够明显提髙转基因烟草的抗光氧化能力。序列表<110〉中国科学院植物研究所<120〉GR2酶基因在培育抗光氧化胁迫转基因植物中的应用<130〉CGGNAL92401<160〉3<210〉1<211〉968<212〉DNA〈213〉烟草属烟草(Nicotianatabacumcv.)<400>1ctcacccactcccgtagtaccccatcatcattatcctgtacccgccgccgtttcaccgcc60ccacgcgccgagtcctccaatggcgctgacgctcctcgccactacgactttgacttattc120accatcggtgctggtagcggtggtgttagggcttctcgttttgcgtctaattttggggct180tctgttgctgtttgtgagctccctttctccactatttcttctgattccactggtggcgtt240ggtggcacgtgtgtacttcgtggatgcgtacccaagaaattactcgtgtacgcgtcaaaa300tattctcatgagtttgaggaaagttgtggttttggatggaactatgatgtggaacctaga360tttgattggagcaccctcattgccaataaaaatgccgagttgcagcgcctcacgggtatt420tacaagaatattctgaagaatgctggtgtcactctgattgaagggagaggaaaggttgtg480geitcctcEitacggtggatgtggatggaaaactctactcggctaag犯catactgatttca540gttgggggacgcccatttatcccagacattcctggtagcgaatatgctatagattccgatGOOgctgcccttgatttgccaacgaagcctaacaaaattgccattgtcggaggcggttacatt660gcacttgaatttgctggaatcttcaatggcttgaaaagtgaggtccatgtttttataaga720caaaagaaggttttgagaggatttgatg肌gaaattagggattttgttggtgaacagatg780tcactgagaggaattgagttccatactgaggagtcgcctcaggctattgtaaagtcagcg840gatggctcactgtctttaaagactagcagaggaacagttgaaggtttctctcatatcatg900tttgcaacgggaa.gaagacctaatac朋agaatttaggattagagacagtgggagtgaaa960atgacaaa968<210>2<211〉968<212〉腿<213〉烟草属烟草(Nicotianatabac咖cv.)<400>2aaacagtaaaagtgagggtgacagagattaggatttaagaaacateiatccagaagaaggg60caacgtttgtactatactctctttggaagttgacaaggagacgatcagaaatttctgtca120ctcggtaggcgactgaaatgttatcggactccgctgaggagtcataccttgagttaagga180gagtcactgtagacaagtggttgttttagggattaaagaagtagtttaggagagttttgg240aagaaaacagaata/tttttgtacctggagtgaaaagttcggtaacttctaaggtcgttta300agttcacgttacattggcgg8ggctgttaccgtt3犯3C33tccg犯gcaaccgtttagt360tcccgtcgtagccttagatatcgtataagcgatggtccttacagaccctatttacccgca420gggggttgactttagtcataca^gaatcggctcatctcaaaaggtaggtgtaggtggcat化0actcctaggtgttggaaaggagagggaagttagtctcactgtggtcgtaagaagtcttat540aagaacatttatgggcactccgcgacgttgagccgtaaaaataaccgttactcccacgag600gttagtttagatccaaggtgtagtatcaaggtaggttttggtgttgaaaggagtttgagt660actcttataaaactgcgcatgtgctcattaaagaacccatgcgtaggtgcttcatgtgtg720cacggtggttgcggtggtcaccttagtcttctttatcacctctttccctcgagtgtttgt780cgttgtcttcggggttttaatxtgcgttttgctcttcgggattgtggtggcgatggtcgt840ggctaccacttattcagtttcagcatcaccgctcctcgcagtcgcggtaacctcctgagc900cgcgcaccccgccactttgccgccgcccatgtcctattactactaccccatgatgccctc960acccactc968<210>3<211〉745<212〉腿<213>黄菊属三脉黄菊(Flaveriatrinervia)〈400〉3tttcttttttccttttagtataaaatagttaagtgatgttaattagtatgsttataataaGOtatagttgtta_taa_ttgtgaaa肌at肌tttat肌atata^ttgtttacataaac肌cat3120gtaatgtaaaaaaatatgacaagtgatgtgtaagacgaagaagataaaagttgagagtaa18016gtatattatttttaatgaatttgatcgaacatgtaagatgatatactagcattaatattt240gttttaatcataatagtaattctagctggtttgatgaatta犯tatcaatgataaaatac300tatagtaaaaataagaataaataaattaaaataatatttttttatgattaatagtttatt360atataattaaatatxtataccattactaaatattttagttteieLaagttaataaatatttt420gttagaaattccaatctgcttgtaatttatcaataaacaaaMattaaataacaagctaa480agtaacaaataatatcaaactaatag肌acagtaatctaatgtaacaa^acataatctaa540tgctaatataacaaagcgcaagatctatcattttatatagtattattttcaatcaacatt600cttattaatttctaaataatacttgtagttttattaacttctaaatggattgactattaa660ttaaatg3attagtcg肌catgaata犯caaggt3ac3tgatagatcatgtcattgtgtt720atcattgatcttacatttggattga74权利要求1、一种培育抗光氧化胁迫转基因植物的方法，是将GR2酶基因导入植物中，得到的抗光氧化胁迫植物，所述GR2酶基因序列是Genbank号为X76293(gi431954)的自5′端第1-1675位的核苷酸序列。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述植物为烟草。3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述GR2酶基因通过表达载体导入植物中，所述表达载体是将GR2酶基因插入pCAMBIA1301的多克隆位点，得到的重组载体。4、一个DNA片段，由基因片段A、B和C依次连接组成；所述基因片段A的核苷酸序列为序列表中的序列l，所述基因片段C的核苷酸序列为序列表中的序列2;所述基因片段B是内含子。5、根据权利要求4所述的片段，其特征在于所述内含子的核苷酸序列是序列表中序列3。6、含有权利要求4或5所述的DNA片段的重组载体。7、根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为权利要求3或4所述的DNA片段插入pART27的多克隆位点，得到的重组载体。8、含有权利要求4或5所述的DNA片段的转基因细胞系或重组菌。9、一种DNA分子，其核苷酸序列是序列表中的序列1或序列2。10、权利要求3或4所述的DNA片段或权利要求6或7所述的重组载体在培育光氧化胁迫敏感型转基因植物中的应用。全文摘要本发明公开了一种GR2酶基因在培育抗光氧化胁迫转基因植物中的应用。本发明提供的GR2酶基因可以用来培育抗光氧化胁迫转基因植物，所述GR2酶基因序列是Genbank号为X76293(gi431954)的自5′端第1-1675位的核苷酸序列。本发明另一目的在于提供一个DNA片段，由基因片段A、B和C依次连接组成；所述基因片段A的核苷酸序列为序列表中的序列1(名称为igr1)，所述基因片段C的核苷酸序列为序列表中的序列2(名称为igr2)；所述基因片段B是内含子。本发明将GR2酶过表达，使得转基因烟草对光氧化胁迫的抗性大大降低。文档编号C12N15/63GK101597621SQ20091008829公开日2009年12月9日申请日期2009年7月13日优先权日2009年7月13日发明者丁顺华,卢从明,卢庆陶,杨志攀,杨辉霞,温晓刚申请人:中国科学院植物研究所