Y染色体MiniSTR分型试剂盒及其制备方法和应用的利记博彩app

专利名称：Y染色体MiniSTR分型试剂盒及其制备方法和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种PCR扩增试剂盒,尤其涉及一种单管同时检测12个Y染 色体MiniSTR基因座的荧光复合扩增试剂盒，本发明还涉及该荧光复合扩增 试剂盒的制备方法以及该试剂盒在司法鉴定中的应用，属于分型和鉴定领域。
背景技术：
短串联重复序列(short tandem repeat, STR)是人类基因组中由2 6个 碱基作为核心单位串联重复形成的一类具有长度多态性的DNA序列，其核心单 位的数目变化和重复次数不同构成了STR的遗传多态性。STR分布广、数目多， 约占人类基因组的10 %,所包含的遗传信息是以往任何多态性标记所无 法比拟的，因此STR是目前法医学个人识别和亲子鉴定最广泛应用的遗传标 记。
作为一种成熟的检验技术，法医实际检案中大多数应用商品化的多色荧光 标记STR复合扩增试剂盒，如ProfilerPlus、Cofiler 、 Identifiler 、PowerPlex 16等，可以得出微量DNA样品的基因分型。但是，在一些重特大刑事案件、突 发性事件和群体灾难事故中，法医检案工作经常面临DNA高度降解的检材或低 拷贝模板DNA,由于有PCR抑制剂的存在和DNA模板已经降解为很小的片断， 使用上述的商品化试剂盒进行检测，经常会出现"优势扩增"或者"无效扩增"， 以致于DNA降解检材成为现阶段法医DNA分型的难点，制约了某些重要物证在案 件侦破中的作用。MiniSTR技术作为STR检验的一个新的发展方向，通过将STR 遗传标记引物设计得尽可能接近重复区域而缩短PCR扩增产物片段长度，提高 了DNA降解检材分型的成功率，同时与STR数据库具有良好的兼容性，很有潜力 成为今后法医DNA检验中的 一项常规分析技术。
Y染色体为男性所特有的染色体，在减数分裂的过程中除拟常染色体区 (pseudoautosomal region)夕卜，其他部分不与X染色体发生重组交换，其序歹'J结构特征能够稳定地由父亲传递给儿子，呈父系遗传。随着男性暴力性犯罪率
的提高，Y染色体STR(Y-STR)以其特有的单倍型父系遗传特点，在个体识别、 亲权鉴定、混合斑男性成分检验和父系家族系谱的构建等方面发挥了重要作 用，已成为法医学检验的主要遗传标记之一，开发具有高鉴定能力的Y染色体 STR复合扩增试剂盒是国内外相关实验室的研究重点。
目前进口的Y-STR商品化试剂盒名称及包含的基因座如下
(1) Y—PLEX 12 kit: DYS19, DYS389I, DYS389II， DYS390， DYS391, DYS392, DYS393, DYS385a/b， DYS437, DYS438， DYS439;
(2) Amp FLSTR Y-filer kit: DYS19，DYS389I, DYS389II, DYS390，DYS391，DYS392， DYS393， DYS385， DYS437, DYS438， DYS439, DYS448, DYS456， DYS458, DYS635， GATA—HA )。
其在国内法医学应用实践中还存在以下问题①与商品化的常染色体STR 试剂盒相比，Y-STR遗传分布具有更显著的地域、种族、民族差异性，进口试 剂盒基于国外白种人群开发，大部分基因座在中国人群的基因频率分布较差、 个人识别能力较低，如DYS3891, DYS391，DYS393，DYS437，DYS438等，在一定程 度上难以满足法医DM检验的工作需求；②试剂价格昂贵，既消耗了国家大量 办案经费，也局限了DM技术的国内应用范围。因此，建立以中国人群遗传资 料为背景的Y染色体STR复合扩增试剂盒尤为重要。
本申请人曾作为中国发明专利ZL031355755. 5的研发人员，公开了 一种Y染 色体多色荧光复合扩增试剂盒，该试剂盒是由传统的32条引物扩增16个STR基 因座，转换为4对(5条)引物扩增16个STR基因座，克服了传统复合扩增的技 术难点，简化了整个实验过程，从而具有优点。应用该试剂盒对100余例性犯 罪案件检材进行了检测，检出率得到了显著提高，其研究结果分别发表在Int J LegMed、 Forensic Sci Int杂志。但是，由于该试剂盒与上述进口的两个Y-STR 商品化试剂盒扩增片断均分布在100-400bp之间，在检测陈旧骨骼、牙齿、腐 败组织等DNA高度降解的检材以及痕量血痕、指(趾)甲、毛发等低含量DNA检 材时，大片断的Y-STR基因座无法进行有效的扩增，表现为扩增效率随片段增 大而显著降低、等位基因缺失或完全丟失等。此外，该试剂盒中包含的DYS434、 DYS438、 DYS439、 DYS453、 DYS513、 Y-GATA-AIO、 Y-GATA-A8基因座等位基因 频率分布较差、个体识别率较低，整个系统的检测效能还有待于进一步改进。鉴于此，合理的搭配遗传多态性高的Y-STR基因座，设计MiniSTR引物，开 发一个检测效能更高的Y染色体MiniSTR复合扩增试剂盒，提高DNA降解和极微 量检材的个人识别能力和扩增效率，对解决法医DM降解检材的分型难题，更 好地为法庭科学提供服务是非常有意义和实用价值的。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有复合扩增试剂盒所存在的不足， 提供一种应用检材范围更广，尤其适用于DNA降解检材的12个Y染色体 MiniSTR荧光复合扩增试剂盒。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的 一种Y染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒，包括彼此独立包装的扩增 试剂和检测试剂组成，所述的扩增试剂包括引物混合物，DNA聚合酶，PCR 反应缓冲液；所述的检测试剂包括内标和等位基因分型标准物Ladder;其中， 所述的引物混合物由四条公共引物和24条加尾引物混合而成；所述的四条公 共引物序列分别为SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4 所示，其中，在SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4的5"端分别加上
颜色互不相同的荧光标记物；
所述的24条加尾引物的序列分别为SEQIDN0:5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28所示。
所述内标由荧光标记物(优选为R0X)标记的80、 100、 120、 140、 160、 180 、 200、 220 、 240、 260、 280、 300bp扩增产物组成;将由ROX标记的 80、 100、 120 、 140、 160、 180 、 200、 220 、 240、 260、 280、 300bp扩增 产物用乙醇沉淀后混合，调整各片段的量至电泳峰面积相近，即得到本发明试 剂盒所用到的内标。
本发明试剂盒的内标作为线性内标(internal lane standard, ILS),
6与待测样本混合加样电泳，使用GeneScan Analysis Software 3. 7NT软件计
算样本产物片段大小。
所述的等位基因分型标准物Ladder由A、 B、 C三组共12个Y-STR基因
座的等位基因分型标准物混合而成；
为了控制质量，本发明试剂盒还可进一步包括阳性对照和阴性对照；优
选的，所述的阳性对照可以是9948男性DNA,所述的阴性对照可以是9947A 女性DNA;
本发明技术方案的详细描述
首先，12个Y-STR基因座的复合扩增需要涉及三对公共引物对。为此本
发明人特设计了四条结构相似、片段大小一致、物理动力学特性相似的公共 引物GA、 GB、 GC、 GD,四条公共引物GA和GB、 GC、 GD的序列分别为
GA ( 5Z -GTTTCTT-) ( SEQ ID NO: 1)
GB ( 57 -CGGTCGAT- 3。 ( SEQ ID NO: 2 )
GC ( 5Z -CGGAATGC- 3y) ( SEQ ID NO: 3 )
GD ( 5y-CGGCTACG- 3" (SEQ ID NO: 4 ); 其中，在GB、 GC和GD的5'端分别加上颜色互不相同的荧光标记物；将 这3个荧光公共引物序列分别与公共序列GA相配合，即构成公共引物对1: GA、 GB;公共引物对2: GA、 GC;公共引物对3: GA、 GD。
所述荧光标记物可以分别釆用现有的不同颜色的荧光标记物，如现有的 市售蓝、绿、黄、红色荧光标记物FAM、 JOE、 NED、 ROX以及其它类似荧光标 记物；其中，优选的，这三对公共引物在引物混合物中的终浓度分别为0. 3~ 1 HiM;
本发明所设计的上述四条公共引物与中国发明专利ZL031355755.5中的 公共引物相比GA由原来的24个bp缩短到7个bp, GB、 GC、 GD由原来的 各23个bp縮短到8个bp。这样，每个基因座的扩增产物就较ZL031355755. 5 提供的试剂盒缩短了 32bp，从而更有利于DNA降解检材的分型；此外G+C含 量和退火温度等参数更加优化。通过实验室检验证明釆用本发明的这四条 公共引物进行复合扩增效率更高。此外，本发明的这四条公共引物还可应用 于常染色体STR和X染色体STR复合扩增系统的建立，具有很宽泛的适用性。
7综合各地区汉族人群的遗传多态性数据，筛选Y染色体STR基因座标准
如下(l)多态性高,在中国人群中个体识别率(DP值)0.6以上；(2)串联重复
单位为四或五核苷酸，保证扩增的忠实性、准确性；(3)所有基因座的累积非
父排除率达到99.99%以上；(4)男性特异性好；(5)易于扩增和分型；(6)突
变率低；(7)灵敏度高，通常选择能够扩增G.2ng-lng模板DNA的基因座，
对于法医中微量的DNA样本检测很重要；(8)各个引物的rm值相近，引物间
兼容性好。基于上述原则，本发明选择了 DYS385、 DYS392、 DYS448、 DYS456、
DYS458、 DYS504、 DYS520、 DYS522、 DYS557、 DYS570、 DYS576、 DYS709等12
个Y-STR作为本发明试剂盒的检测基因座，其中保留了进口试剂盒中包含的
5个Y-STR基因座(DYS385、 DYS392、 DYS448、 DYS456、 DYS458 ),以便于与
各群体DNA数据的交流与共享；其次，增加了 7个比较适合中国群体遗传分
布的新基因座，即DYS504、DYS520、DYS522、DYS557、DYS570、DYS576、DYS709,
以提高其实用性。其中，12个Y-STR基因座在广东汉族群体的遗传多态性数
据见表1、表2;与进口 Y-PLEX 12试剂盒中的Y-STR基因座的基因多样
性比较见表3。 216名广东汉族无关男性个体中，进口 Y-PLEXTM12的Y-STR
基因座组成的单倍型系统共检出170种单倍型，单倍型多样性为0.9908,系
统鉴定能力为78.70%;而本试剂盒12个Y-STR基因座组成的单倍型系统共
检出213种单倍型，单倍型多样性为0.9952，系统鉴定能力为98.61%。结
果表明，选择更多适合中国群体遗传多态性高的基因座，可以明显增加单倍
型的数量和多样性，从整体水平有效的提高Y染色体的个人识别能力。
表l本发明试剂盒11个Y-STR广东汉族群体等位基因频率分布及基因多样性(N=216) 等位基因~~DYS392 DYS448DYS456 DYS458DYS504DYS520 DYS522 DYS557DYS570 DYS576DYS709
90細60.0139
100細60.1944
110.05560.34260細6
120.06940.01850.30090.00920.0139
130.42130.01390.01390.07410.12040.00920.0833
140.39150.16670.00930.09720.02310.05560.00920.2083
150.05090.45830.11570.21300.00460.27310.01850.01850.4167
160.18510.13890.1620.0.23150.13890.09260.1713
170.00930.15740.21300.39810.25000.23150.23150.0926
180.04170.01850.33800.03700.00630.13890.28240.34720.0139
190.23150.11570.01900.02310.21760.2083
200.31020.04630.38600.01850.05560.0833
210.34260.00930.18990.00920.02310.0185
220.03700.151923 0.0231
24 0据6
25
26
27_
基因多样性 0.6618 0.7324 0.7058 0.7955 0.7568 0.7687 0.7425 0.7896 0.7995 0.7698 0.7411
表2本发明试剂盒DYS385基因座广东汉族群体单倍型及频率分布(N=216)
单倍型DYS385单倍型DYS385单倍型DYS385
10-120.009212-170.023114-180.0509
11-110.018512-180.088014-190.0185
11-120.041712-190.074114-200扁5
11-130.004612-200.018515-160.0046
11-140細612-210.009215-170据6
11-160.004613-130.074115-180.0370
11-170扁213-140.027815-190.0370
1卜180.013913-160.009215-200据6
11-190扁213-170.069416-180.0092
11-200.004613-180.055616-190.0046
11-210層213-190.027816-200.0046
12-120.013913-200.046316-210.0046
12-130.027813-210.018517-180.0046
12-140.009213-220.004617-200細6
12-150.018513-230.004618-220.0046
12-160.023114-170.009219-210細6
单倍型多样性0.9425
表3本发明试剂盒与进口 Y-PLEX 12 kitY-STIL基因座基因多样性比较
基因多样'生Y-STH基因座
广东汉族群体本试剂盒进口Y-PLEX'Ml2kit
0.9425DYS385DYS385
0.7995DYS570
0.7955DYS458
0.7896DYS557
0.7698DYS576
0.7687DYS520
0.7568DYS504
0.7425DYS522
0.7411DYS709
0.7324DYS448
0.7261DYS389II
0.7172DYS635
0.7058DYS456
0.6896DYS390
0.6765DYS19
0.6665DYS439
0.6618DYS392DYS392
0.5627DYS393
0.5329DYS437
0.5279DYS389I
0.4601DYS438
0.3617DYS391
本发明根据各基因座扩增产物片段大小，退火温度相近、相互之间以及
0.1140
o.匿
0.0126
9与引物在靶片断之外区域间同源性程度低等原则设计这12个Y-STR基因座的
分组组合，利用在线软件primer3、 01 igo6. 0设计MiniSTR引物。Y染色体
MiniSTR引物设计原则(1)尽可能靠近STR核心重复序列，同时避免引物结
合区碱基突变引起的扩增不均衡甚至假纯合子的情况；(2)引物长短适中，具
有相似的物理特性和反应动力学特点、Tm值相近、GC含量，引物之间不能形
成二聚体；(3)避开与X染色体的同源体(homology)，以保证各MiniSTR引物
的男性特异性。但由于受限于STR核心重复序列的长度，MiniSTR的扩增片
段长度不可能无限的减小，另外，引物区的选择佘地很小，甚至于有些基因座
无法找到合适的MiniSTR引物。因此，本发明对DYS385、 DYS392、 DYS448、
DYS456、 DYS504、 DYS522、 DYS570、 DYS576、 DYS709基因座重新设计了 MiniSTR
引物。实验室确证9个基因座的PCR-MiniSTR产物表现了 Y染色体的男性
特异性，女性样本无扩增产物，可用于混合斑分析；扩增产物缩短的片断在
l"20bp之间，整个系统扩增片断低于2織p非常有利于DNA降解检材的
准确分型。12个Y-STR基因座的遗传信息及MiniSTR产物长度见表4。
_表4 12个Y-STR基因座的遗传信息及MiniSTR产物片断_
Genebank 等位基因长度范围Mini产物长度缩短的片断
基因座 核心重复序列
登录号范围(bp)范围(bp)(bp)
DYS385AC022486(AAGG)fr_7(GAAA)n10-23365-421214-270151
DYS392AC011745(TAT)n9-15236-26997-121141
DYS448AC025227(AGAGAT)n17-24282-324219-26163
DYS456AC010106(AGAT)n13-18141-16193-11348
DYS458ACO10902(GAAA)n13-21133-165133-165_
DYS557AC007876(TTTC)n14-21188-216188-216—
DYS504AC006157CTCCT)n13-20272-30092-120180
DYS520AC007275(ATAG)m(ATAC)n18-26171-203171-203_
DYS522AC007247(GATA)n9-15348-372128-152220
DYS570ACO 12068(TTTC)n11-21232-272189-22943
DYS576AC010104(AAAG)n15-21145-169132-15613
DYS709AC006989(CTTT)n12-18186-210161-18525
其中，设计的DYS385基因座的MiniSTR引物为:Pl: -ACAAAGAAAAGAAATGAAATTCAGA- 3'
P2: 5^CCAATTACATAGTCCTCCTTTCTT-设计的DYS392基因座的MiniSTR引物为
Pl: 57-AAAAGCCAAGAAGGAAAACAAA-
P2:—AAACCTACCAATCCCATTCCTT— 设计的DYS448基因座的MiniSTR引物为
P1:5,-GCGAGACAGAAAGGGAGATA- y
P2: 5'-TCTGGCCGGTCTGGAA-设计的DYS456基因座的MiniSTR引物为
Pl: 5,-GGACCTTGTGATAATGTAAGATAG- 3,
P2:-TAGAGGGACAGAACTAATGGAA- 3, 设计的DYS504基因座的MiniSTR引物为
Pl: 57-CCTCCCCTCCACTCACTT-
P2: 5y-GGGAGGGAGGGAAAGAGAA- 3, 设计的DYS522基因座的MiniSTR引物为
Pl: -TGGATAGACATAGGTGACAGATGA-
P2: 5,-GTTCTGGGGAACCAGTGAGA- 3, 设计的DYS570基因座的MiniSTR引物为
Pl: -TGGCTCACGTTACCATTAAACTT-
P2: -GGCAACCTAAGCTGAAATGC- 3, 设计的DYS576基因座的MiniSTR引物为
Pl:-CATAGCAAGACCTCATCTCTGAA- 3,
P2: -GATGAAGGAGGAGATGGGAGT-设计的DYS709基因座的MiniSTR引物为
PI: 5Z-TTTCCAATGACCAAGACGTG- 3,
P2: 5y -CGAACCTGCAAATTGTTCAC- 37 试剂盒中另外三个Y-STR基因座的引物序列查自GDB基因数据库。其中 DYS458基因座的STR引物为
Pl: 5,-GCAACAGGAATGAAACTCCAAT-
iiP2:-GTTCTGGCATTACAAGCATGAG-DYS520基因座的STR引物为
PI: 5y -AACAGCCTGCCCAACATAGT-P2:—ACCATCATGCCCTGCAATA— DYS557基因座的STR引物为
Pl: -TTTTCTGTGCCAAGCCTACA-P2:-TCTAATGCACCTTGAGGGATC-将上述能够与人类基因组序列特异性结合的STR引物或MiniSTR引物 Pl、 P2的5'端分别加上本发明的四条公共引物就得到本发明Y染色体 MiniSTR分型试剂盒的加尾引物；所述的加尾引物的具体序列见表5。
表5 A、 B、 C三组12个Y染色体特异STR基因座的加尾引物序列
MultiplexA DYS392
DYS576
GA-Mini(Pl):5'"GTTTCTT-AAAAGCCAAGAAGGAAAACAAA-y ( SEQ ID NO:5 ) GB-固(P2):5'"CGGTCGAT-AAACCTACCAATCCCATTCCTT-y ( SEQ ID NO:6)
DYS709
DYS570
GB-Mini(P2):5'"CGGTCGAT"GATGAAGGAGGAGATGGGAGT-y ( SEQ ID NO:8 ) GA-Mini(Pl):5'-GTTTCTT陽TTTCCAATGACCAAGACGTG-3' (SEQ ID NO:9) GB-Mini(P2):5'"CGGTCGAT"CGAACCTGCAAATTGTTCAC-y ( SEQ ID NO:10) GA-Mini(Pl):5CGTTTCTT-TGGCTCACGTTACCATTAAACTT-3' ( SEQ ID NO: 11) GC-Mini(P2):5'"CGGTCGAT-GGCAACCTAAGCTGAAATGC-3' ( SEQ ID NO: 12 ) MultiplexB DYS456 GA-Mni(Pl):5'"GTTTCTT-GGACCTTGTGATAATGTAAGATAG-3' (SEQ ID NO: 13 )
GC-Mini(P2):5'"CCGAATGC-TAGAGGGACAGAACTAATGGAA-y ( SEQ IDNO:14 ) DYS458 GA"(M):y"GTTTCTT"GCAACAGGAATGAAACTCCAAT-y ( SEQ ID NO: 15 )
GCHP2):5'"CCGAATGC-GTTCTGGCATTACAAGCATGAG-y ( SEQ ID NO:16) DYS557 GA"(Pl):《"GTTTCTT-rnTCTGTGCCAAGCCTACA-3' ( SEQ ID NO:17 )
GO(P2):5'"CCGAATGC-TCTAATGCACCTTGAGGGATG-y (SEQ ID NO:18) DYS448 GA-Mni(Pl):5^TTTCTT"GCGAGACAGAAAGGGAGATA-y ( SEQ ID NO:19) GC-Mini(P2):y^CCGAATGC-TTCCAGACCGGCCAGA-3' ( SEQ ID NO:20) MultiplexC DYS504 GA-Mini(Pl):5'^TTTCTT^CCTCCCCTCCACTCACTT-y (SEQIDNO:21)
12GC-固(P2):5'《GGCTACG"GGGAGGGAGGGAAAGAGAA-3' ( SEQ ID NO:22 )
DYS522GA-Mini(Pl):5^TTTCTT-TGGATAGACATAGGTGACAGATGA-3' ( SEQ ID NO:23 )
GD"MM(P2):5'《GGCTACG-GTTCTGGGGAACCAGTGAGA-y ( SEQ ID NO:24 )
DYS520GA^(Pl):5'^GTTTCTT-AACAGCCTGCCCAACATAGT-y ( SEQ ID NO:25 )
GEKP2):5'"CGGCTACG-ACCATCATGCCCTGCAATA-y ( SEQ ID NO:26)
DYS385GA-MiniCPl^'^GTTrCTT-ACAAAGAAAAGAAATGAAATTCAGA-y ( SEQ ID NO:27 )
GD"廳(P2):5'"CGGCIACG"CCAATrACATAGTCCTCCnTCTr-3' ( SEQ ID NO:28)
优选的，上述12对加尾引物在引物混合物中的终浓度分别为0. 15~lji
M;
所述内标由荧光标记物(优选为R0X)标记的80、 100、 120、 140、 160、 180 、 200、 220 、 240、 260、 280、 300bp扩增产物组成;将由ROX标记的 80、 100、 120 、 140、 160、 180 、 200、 220 、 240、 260、 280、 300bp扩增
产物用乙醇沉淀后混合,调整各片段的量至电泳峰面积相近，即得到本发明试 剂盒所用到的内标。
在本发明试剂盒中，所述等位基因分型标准物Ladder由12个Y染色体 STR基因座的等位基因分型标准物混合而成；等位基因分型标准物是指用于 STR分型的已知序列的DNA片段群，是进行结果检测时分型的对照物，只要 将等位基因分型标准物与样本PCR扩增产物同步电泳，不同的实验室，不同 的设备，不同的电泳方法，均可得到一致的可重复性结果。由于本发明试剂 盒中的部分基因座是在重新设计的MiniSTR引物的基础之上，因此不能再釆 用原基因数据库STR引物的扩增产物作为本发明的分型标准物。在本发明试 剂盒中，按Y染色体MiniSTR分组情况制备等位基因分型标准物，利用公共 引物对该基因座在群体中观察到的所有等位基因进行扩增；PCR产物克隆； DM测序证实插入片段的大小和结构；按国际标准进行命名后，经扩大培养、 扩增及再鉴定后；混合并调平衡所有的等位基因，使制备出的各个基因座的 等位基因分型标准物等量，即各个基因座的等位基因分型标准物的克分子量 均相等，上述制备等位基因分型标准物的方法为本领域技术人员所习知。
本发明试剂盒的扩增原理与中国发明专利ZL031355755.5中所涉及的复合扩增原理相同(图l)。即以一对短DNA片段构成公共引物对(GA,GB);将上
述公共引物分别加在能够与人类基因组序列特异性结合的STR引物或MiniSTR
引物Pl、 P2的5'端，构成一对非人类基因组序列，即加尾引物GA-P1、 GB-P2。
对于同一组中的不同基因座来说，待扩增基因座的加尾引物GA-P1和GB-P2因
STR引物或MiniSTR引物Pl、 P2的不同而不同。
在复合扩增的第一阶段，所扩增的DM片段由各加尾引物中所含的Pl、
P2决定。因此，第一阶段的扩增产物是同时具有目的基因片段和与公共引物
配对的序列，即生成少量用于第二阶段PCR反应的模板。第二阶段扩增中，
由于非人类基因组的公共引物序列已经整合到扩增产物中，荧光公共引物即
可作为反应引物发挥作用。因此就每一组基因座来说，参与反应的引物只有
一对荧光公共引物，即由多对反应引物扩增多个STR基因座转换为一对公共
引物扩增多个STR基因座，降低了引物间的竟争与抑制且无需调整加尾引物
间的浓度，从而大大提高了各基因座的扩增效率。经历多轮(如30轮)PCR
循环反应之后，上述第一阶段的PCR产物被扩增至上百万倍。利用自动激光
荧光遗传分析仪检测PCR产物，可根据公共引物5'端标记的荧光颜色及片段
的迁移率检测到复合扩增的各个Y-STR的等位基因。
作为参考，本发明Y染色体MiniSTR分型试剂盒的使用或检测方法如下
一、PCR反应可以釆用表6推荐的20. OjaL和lO)aL两种体积，如果模
板DM加入体积增加或减少，则灭菌纯水也应作相应的减少或增加。 表6_
10 x PCR反应液4. 0 jaL2. OjaL
引物混合物2.5 juL1. 3jaL
Taq DNA聚合酶(国产)2. OjaL1. 0 juL
模板DNA2. 0 juL1. OjuL
灭菌纯水9. 5 jaL4. 7 iuL
总反应体积20. 0 juL10. OjaL
二、复合扩增反应在GeneAmp PCR System97GG型热循环仪上进行， 釆用热启动技术，共循环32轮，热循环参数见表7: 表7预变性95 °C10分钟
变性94 °Cl分钟，
退火60 °Cl分钟^IO个循环
延伸70 °Cl分钟J
变性90 °C50秒〕
退火58 °C5。秒 P22个循环
延伸72 °C50秒J
终延伸60 °C45分钟
保温4 °C保持
三、Y染色体MiniSTR复合扩增产物的检测
利用ABI310遗传分析仪(PE,美国)对上述复合扩增过程所得到的PCR 扩增产物进行检测分析。用PCR产物0.8uL与内标0.5 u L、变性剂 Hi-DiTMformamide3 10. OuL混勻编号，放入自动进样盘。电进样15000v、 5s,电泳15000v， 26min。用Data Col lect ion软件收集数据,Genescan3. 7 软件分析数据，用修改过的AmpFlSTR PLUS kit Kazam macro文件在 Genetype3.7软件自动分型。等位基因的辨认通过与等位基因分型标准物比 较来确认，窗口范围+/-0. 5bp。
本发明一个完整包装的试剂盒的各组分的包装量可视具体情况而定， 这些都是本领域技术人员所很容易掌握的，作为参考包括可进行200个 反应(20pL)的PCR扩增以及检测所需的全部试剂，分为扩增试剂盒和 检测试剂的独立包装。
本发明试剂盒扩增片断低于280bp，能实现对低至30pg/20)il的DNA模板 成功分型，相比较于进口Y染色体试剂盒具有高灵敏度、对DNA高度降解的检 材高检出率的优点。原有用于常规STR的检测、分析技术都可以应用于本试 剂盒，二者之间具有很好的通用性，可以共用平台，实现平滑过渡和衔接。 此外，选择更适合中国群体遗传分布的12个Y-STR基因座，超过了进口 Y-PLEXTM 12试剂盒的个人识别能力，符合法庭科学个人识别的标准。
本发明试剂盒除可应用于法医学的个人识别和亲子鉴定，同时还也可 应用于人类学研究，作为母系遗传mtDNA多态性的补充，为阐明现代人类群体间的关系及人类进化的时间和地点提供新的分子生物学证据。国内外
学者相继报道了进口试剂盒Y-PLEXTM的12个Y-STR单倍型研究结果,但仅利
用这些数据进行人类学不同民族和群体间遗传距离的比较和聚类分析是 不够全面的。本发明试剂盒已在中囯多个民族群体遗传多态性研究中获得 了满意的结果，联合已报道的"最小单倍型"、"扩展单倍型"群体数据可 进一步加深我国各个民族父系群体间的遗传进化关系。
本发明的主要优点包括
1、由四条公共引物单管同时扩增12个基因座，避免了各引物间的竟 争及杂合二聚体的形成，显著提高了各基因座的扩增效率；2、无需在实 验过程中繁瑣地调整各对引物的浓度，无需一对一地荧光标记多个Y-STR 基因座引物，只荧光标记三条公共引物序列，既简化了传统方法扩增12个 Y-STR基因座的操作难度，又大大节约了成本；3、所用引物的浓度仅是传 统复合扩增方法的1/10,具备研制大规模Y-STR基因座复合扩增试剂盒的 潜力。4、所用原料、试剂全部国产化，特别是关键试剂Taq酶国产的仅 0.2元/单位，其扩增效率和特异性与2元/单位的进口Taq酶比较无显著差 异，大大降低了司法鉴定的成本。


图1本发明试剂盒的扩增原理图。
图2本发明在广东汉族群体建立的等位基因分型Ladder。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随 着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成 任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下 可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均 落入本发明的保护范围内。实施例1
本实施例中的试剂盒是针对A、 B、 C三组共12个Y染色体STR基因座 制作的。由分离包装的引物混合物、DNA聚合酶、PCR反应液、内标和等 位基因分型标准物Ladder构成，所述引物混合物由三对荧光公共引物GA 和GB、 GA和GC、 GA和GD以及对应于A、 B、 C三组12个Y-STR基因座的 加尾引物混合而成，其中，三对荧光公共引物GA和GB、 GA和GC、 GA和 GD中的荧光公共引物GA和GB、 GC、 GD为
GA ( 5, —GTTTCTT— 3,),
GB ( 5, -Fl—CGGTCGAT— 3,)
GC ( -F2-CCGAATGC- )
GD ( -F3-CGGCTACG- ) 在本实施例中，分别加于荧光公共引物GB、 GC、 GD 5Z端的荧光标记 物F1、 F2、 F3分别为蓝、黄、绿颜色的荧光标记物FAM、 J0E和NED。其 中，蓝色荧光标记物FAM的结构式为<formula>formula see original document page 17</formula>绿色荧光标记物JOE的结构式为
<formula>formula see original document page 17</formula>
黄色荧光标记物NED的结构式为作为内标的红色荧光标记物R0X的结构式为
所述的12个X-STR基因座STR引物的序列分别为SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28所示。
试剂盒中内标由ROX标记的80、 100、 120 、 140、 160、 180 、 200、 220 、 240、 260、 280、 300bp扩增产物，乙醇沉淀后混合，调整各片段的量 至电泳峰面积相近。作为线性内标(internal lane standard, ILS)，与 待测样本混合加样电泳，使用GeneScan Analysis Software 3. 7NT软件 计算样本产物片段大小。
本实施例中的等位基因分型标准物Ladder由A、 B、 C三组12个Y-STR 基因座中的各个基因座的等位基因分型标准物混合而成。在具体制作时， 上述等位基因分型标准物按以下方式制得加尾引物分别扩增各个Y染色 体STR基因座不同等位基因的个体样本，电泳分离，硝酸银染色，切下各 基因座全部等位基因目的片段凝胶；用荧光标记的公共引物分别扩增各基 因座的等位基因凝胶浸泡液，PCR产物克隆；DNA测序证实插入片段的大
小和结构；按国际标准进行命名后，经扩大培养、扩增及再鉴定后；混合
并调平衡所有的等位基因，使制备出的各个基因座的等位基因分型标准物 等量，即各个基因座的等位基因分型标准物的克分子量均相等。
18本试剂盒在广东汉族群体建立的等位基因分型Ladder见图2。
试验例1本发明试剂盒法医学应用试验
1、 9947A (女性)DNA(10ng/u 1)(购自Promega公司)作为阴性对照， 分别扩增3 ng、 10 ng、 100 ng模板DM,以验证本发明试剂盒的男性特异 性研究。结果显示随着女性DNA量的增加，男性DNA分型基本不受影响，说 明本发明试剂盒具有良好的男性特异性，可以耐受高女性成分的干扰。
2、 9948 (男性)DNA(10ng/ul)阳性对照(购自Promega公司)分别稀释 为15pg、 30 pg， 60 pg， 125 pg, 250 pg， 500 pg, 1 ng,每个稀释的模板DNA
重复10次扩增结果，用于本发明试剂盒的的灵敏度研究。结果显示，本发明试 剂盒最小DNA检出量为30 pg。
3、 3具男性新鲜尸体的肌肉组织、骨组织、脑组织、心脏、肝脏、脾脏、 肾脏、皮肤各50g以上、医用消毒纱布或中速滤纸提取尸血血痕(3cm以上)， 用于本试剂盒的的组织同一性研究。结果显示，3具男性尸体的肌肉组织、 骨组织、脑组织、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、皮肤、尸血血痕样本扩增良好， 分型一致，说明本发明试剂盒具有良好的组织同一性。
4、 取常见动物猪、狗、羊、牛、兔、鸡、鱼、泥鳅、蛇、鸭、猴子血 样本，Chelex-IOO法提取动物血样DNA,以9948 (男性)薩A样本做阳性 对照，去离子水为阴性对照，观察本发明试剂盒的种属特异性。结果显示， 分型区内11种常见动物无扩增产物峰出现，说明本发明试剂盒具有良好的
种属特异性。
5、 人工降解DNA模型和法医降解检材
DNaseI(NEB， Ipswich， MA)制作降解DM模型3ug全血DNA,用0. 01 U/p L DNase I于37。C消化2 min, 5 min, 10min, 15 min, 20 min, 30 min; 同时使用Amp FLSTR Y-filer kit、本发明试剂盒，逸睑结果條8;
25份陈旧骨骼、腐败肌肉、组织等DM高度降解的检材，AmpFLSTRY-filer kit与本发明试剂盒同时扩增，结果显示见表9。
综上，相对于AmpFLSTRY-filerkit中扩增片段^:的基因座,本发明MiniSTR 试剂盒针对法医降解检材可得到更高的STR分型成功率。
19_表8人工降解DNAAmpFLSTRY-迈erkit、本"iJ^l盒YSTR基B^g^r力率t嫩_
離被由， 本发明试剂盒 A^FLS顶
酶解时间 DYS DYS DYS DYS DYS DYS DYS DYS DYSDYS DYSDYS
385 392448 456 458 504 520 522 557 570 576 709
0 min 2 min 5 min 10 min 15 min 20 min 30 min 60 min 90 min 180 min
Y-迈er
17/17a
14/17
9/17
7/17
4/17
4/17
2/17
1/17
0/17
0/17
表示成功分型的基因座峰高超过100RFU; a表示进口试剂盒成功分型的基因座数目
表9 25份法医降解检材AmpFLSTRY-迈erkit、本^測盒YS1R^gl^^^力率晚 基因座 产物缩小AmpFLSTRY-fflerkit 本试剂盒
DYS 19 — 5(20%)
DYS389 I — 12(48%)
DYS389 II — 5(20%)
DYS390 — 7(28%)
DYS391 — 10(40%)
DYS393 _ 10(40%)
DYS437 — 9(36%)
DYS438 — 6(24%)
DYS439 — 5(20%)
GATA-H4 — 12(48%)
DYS635 _ 6(24%)
DYS458 _ 13(52%)
DYS385 75bp 6(24%)
DYS392 141bp 6(24°/。)
DYS448 63bp 5(20%)
DYS456 39bp 10(40%)
DYS504 180bp
DYS522 220bp
DYS570 43bp
DYS576 13bp
DYS709 25bp
DYS557 —
DYS520 —
^s^x^s^s^s^s^s^'^/-^s
o 6604486048 8
6 5546665444 4
5 4406674012 2序列表
<110〉 石美森
<120> Y染色体MiniSTR分型试剂盒及其制备方法和应用 <130〉 KLPI08087 <160> 28
<170> Patentln version 3. 5
<210> 1
<211> 7
<212> DNA
〈213〉 artifical
<400> 1
gtttcU 7
<210> 2
〈211〉 8
<212> DNA
<213> artifical
<400> 2
cggtcgat. 8
<210〉 3
<211〉 8
〈212〉 DNA
〈213〉 artifical
<400〉 3
cggaatgc 8
<210> 4
<211〉 8
<212〉 DNA
〈213> artifical
<400〉 4
cggctacg 8
<210> 5
<2U〉 29
<212〉 DNA
<213> artifical
<400> 5
gtttcttaaa agccaagaag gaaaacaaa 29
〈210> 6
<211〉 30
<212> DNA
<213> artifical
<400〉 6
cggtcgataa acctaccaat cccattcctt 30
<210〉 7
<211> 30
<212> DNA
〈213〉 artifical
<400> 7
gtttcttcat agcaagacct catctctgaa 30
<210> 8
〈211〉 29
<212> DNA
<213> artifical
21<衡 8
cggtcgatga tgaaggagga gatgggagt 29
<210〉 9
<211〉 27
<212〉 DNA
<213〉 artifical
<400〉 9
gtttcttttt ccaatgacca agacgtg 27
<210〉 10
<211〉 28
<212> DNA
<213> artifical
<400> 10
cggtcgatcg aacctgcaaa ttgttcac 28
〈210> 11 <211> 30 <212> DNA
<213〉 artifical ' <400> 11
gtttctttgg ctcacgttac cattaaactt 30
<210> 12
<211〉 28
<212> DNA
<213> artifical
<400> 12
cggtcgatgg caacctaagc tgaaatgc 28
<210> 13
<211> 31 .
<212〉 DNA
<213> artifical
<400> 13
gtttcttgga ccttgtgata atgtaagata g 31
<210〉 14 <211> 30 <212> DNA <213> artifical
<400> 14
ccgaatgcta gagggacaga actaatggaa 30
〈210> 15
<211> 29 <212>腿
<213> artifical
<400> 15 ,
gtttcttgca acaggaatga aactccaat 29
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213〉 artifical
<柳〉16
ccgaatgcgt tctggcatta caagcatgag 30<210> 17
<211〉 27
<212> DNA
<213> artifical
<柳> 17
gtttcttttt tctgtgccaa gcctaca 27
<210> 18
<211> 29
<212> 腿
<213> artifical
<400> 18
ccgaatgctc taatgcacct tgagggatg 29
<210〉 19
<211> 27
<212〉 DNA
<213> artifical
<400> 19
gtttcttgcg agacagaaag ggagata 27
〈210> 20 <211〉 24 <212〉 DNA <213> artifical
<400〉 20
ccgaatgctt ccagaccggc caga 24
<210> 21
〈211〉 25
<212> DNA
<213> artifical
<400> 21
gtttcttcct cccctccact cactt 25
<210> 22
<211> 27
<212〉 DNA
<213> artifical
<400> 22
cggctacggg gagggaggga a卿gaa 27
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> artifical
<400> 23
gtttctttgg atagacatag gtgac卿tg a 31
<210> 24
<211> 28
〈212〉 DNA
〈213〉 artifical
〈400〉 24
cggctacggt tctggggaac cagtgaga 28
〈210〉 25 <211> 27 〈212> DNA<213> artifical<400> 25
g"tttcttaac agcctgccca acatagt 27
<210> 26
<211> 27
<212> 腿
<213> artifical
<400> 26
cggctacgac catcatgccc tgcaata 27
<210> 27
<211〉 32
<212> 腿
<213> artifical
〈400〉 27
gUtcttaca aagaaaagaa atgaaattca ga 32
<210> 28
<211〉 32
<212〉 腿
<213〉 artifical
〈400〉 28
cggctacgcc aattacatag tcctcctttc tt 32
2权利要求
1、用于扩增12个Y-STR基因座的公共引物序列，其特征在于其碱基序列分别为SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示；其中，在SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的5/端分别加上颜色互不相同的荧光标记物。
2、 权利要求1所述的公共引物序列在制备检测Y染色体MiniSTR分型的试剂中的应用。
3、 一种用于法医DNA降解检材的Y染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂 盒，包括彼此独立包装的扩增试剂和检测试剂组成，所述的扩增试剂包括 引物混合物，DNA聚合酶，PCR反应缓冲液；所述的检测试剂包括内标和等 位基因分型标准物Ladder;其特征在于所述的引物混合物由四条公共引 物和24条加尾引物混合而成；所述的四条公共引物序列分别为SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示，其中，在SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4的5'端分别加上颜色互不相同的荧光 标记物；所述的24条加尾引物的序列分别为SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28所示。
4、 按照权利要求3所述的Y染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒，其 特征在于所述内标由荧光标记物标记的80、 100、 120、 140、 160、 180、 200、 220 、 240、 260、 280、 300bp扩增产物组成。
5、 按照权利要求4所述的Y染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒，其 特征在于所述荧光标记物是ROX。
6、 按照权利要求3所述的Y染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒，其 特征在于所述的等位基因分型标准物Ladder由A、B、C三组共12个Y-STR 基因座的等位基因分型标准物混合而成。
7、 按照权利要求3-6任何一项所述的Y染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒，其特征在于所述的扩增试剂还进一步包括阳性对照和阴性对 昭m、 o
8、 按照权利要求7所述的Y染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒， 其特征在于所述的阳性对照是9948男性DNA。
9、 按照权利要求7所述的Y染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒， 其特征在于所述的阴性对照是9947A女性MA。
全文摘要
本发明公开了一种Y染色体MiniSTR分型试剂盒及其制备方法和应用。本发明设计了三对公共引物对，优选了适合中国群体遗传分布的12个Y染色体STR基因座并对部分基因座设计了MiniSTR引物，在上述MiniSTR引物的5′端分别加上这三对公共引物得到24条加尾引物；采用本发明试剂盒可单管同时扩增12个Y染色体STR基因座，避免了各引物间的竞争及杂合二聚体的形成，提高了各基因座的扩增效率，扩增产物长度可小于280bp，灵敏度高(低至30pg)，可得到更高的STR分型成功率，提高了法医DNA降解检材的扩增效率。本发明试剂盒具有灵敏度高、特异性强、制备成本低、检测效率高等优点。
文档编号C12Q1/68GK101475994SQ200910076808
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月21日 优先权日2009年1月21日
发明者雪 杨, 百茹峰, 石美森, 丽 袁, 涤 鲁 申请人:中国政法大学