专利名称：催化大分子底物反应的交联酶聚集体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及制备无载体固定化酶的方法，特别是-种催化大分子底物反应的交联酶聚集 体及其制备，它是一种多孔化修饰的交联酶聚集体的制备方法。
背景技术：
交联酶聚集体(Cross - linked Enzyme Aggregates, CLEAs)是一种无载体固定化酶技术，在 制备过程中首先利用沉淀剂使溶解态的酶分子沉淀聚集，随后对酶沉淀聚体进行共价交联。 该方法无惰性载体引入，单位质量固定化酶的载酶量高，具有较宽的最适pH和最适温度范 围；在高温、有机溶剂和强酸强碱条件下稳定性强，是一种极具发展潜力的新型固定化酶方 法。但是，由于在交联酶聚集体制备过程中大量酶分子被包裹在沉淀聚体的集簇内部，且这 一结构被随后的共价交联所固定，因此限制了集簇内部酶分子与底物的自由结合。特别是当 底物为大分子物质，如蛋白质、多糖、高分子聚合物等时，由于空间位阻的影响，底物分子 无法进入交联酶聚集体集簇内部，而只能与表面酶分子发生反应，大大降低了该类固定化酶 的催化效率。至今，国内外未见有适于催化大分子底物反应的交联酶聚集体制备方法的文献 报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种催化大分子底物反应的交联酶聚集体及其制备方法，可以克服 现有交联酶聚集体技术的上述缺点，是在酶溶液屮加入淀粉作为致孔剂，随后令酶与淀粉共 聚沉交联，最后将oc-淀粉酶解去除。
本发明提供的催化大分子底物反应的多孔化交联酶聚集体是以蛋白酶和淀粉为原料，按 照下述的质量配比制成，蛋白酶淀粉=0.015 0.75: 1;具体制备方法是将含淀粉的pH=7
的缓冲溶液与蛋白酶混合均匀，然后加入有机溶剂或硫酸铵溶液，得到酶-淀粉共沉淀聚体的
悬浊液加入戊二醛交联，沉淀物洗涤，加入a-淀粉酶反应，去除淀粉，沉淀物洗涤，再分散 于缓冲液中保存。
本发明提供的催化大分子底物反应的多孔化交联酶聚集体的制备方法包括的歩骤
1) 糊化淀粉的制备
按计量淀粉溶于pH=7的缓冲液中配制成质量百分浓度为1 4%的淀粉液，于80 100 'C水浴中搅拌3 10分钟，得到糊化淀粉。
2) 酶-淀粉混合液的共沉淀
上述糊化淀粉液，加入蛋白酶，于4 3CTC搅拌均匀，加入有机溶剂(乙醇或甲醇或丙 酮或聚乙二醇)或饱和硫酸铵溶液(76.7%)，全部加入后搅拌30分钟，得到酶-淀粉共沉淀 聚体的悬浊液。
3) 酶-淀粉共沉淀聚体的共价交联向酶-淀粉共沉淀聚体悬浊液中加入戊二醛，令最终戊二醛的质量百分浓度为1 5%，于 4 30'C搅拌4 16小时。 4)酶解去除淀粉
向共价交联后的混合体系中加入缓冲液，pH7.0，离心取沉淀物，用缓冲液反复洗涤离心 沉淀物，重复3-5次以去除戊二醛残留。将沉淀物分散于缓冲液中，向此混合液中加入质量 浓度为1 10。/。的cx-淀粉酶，于室温下搅拌反应12 24小时，再次离心取沉淀物，用缓冲液 反复洗涤沉淀物，最终将沉淀物分散于缓冲液中，于4'C下保存。
所述的淀粉是玉米淀粉或木薯淀粉或马铃薯淀粉或小麦淀粉；所述的蛋白酶是胰蛋白酶、 木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶或嗜热菌蛋白酶。
所述的缓冲液是磷酸缓冲液；所述的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮或聚乙二醇。
本发明提供的催化大分子底物反应的多孔化交联酶聚集体，用于水解卵清白蛋白及牛血 清白蛋白等大分子底物的实验结果表明在相同条件下，未经多孔化处理的交联酶聚集体的 催化效率仅为游离态酶催化效率的9 12%，而多孔化交联酶聚集体的催化效率为游离态酶催 化效率的80 100。/。。本发明可以应用于蛋白酶类、聚糖酶类等的固定化。
图1木瓜蛋白酶CLEAs造孔前后孔径形貌的扫描电镜图。
具体实施方式
实施例1
在10mL磷酸缓冲液(O.IM， pH7.0)中加入玉米淀粉，配制成质量百分比浓度为4%的 淀粉液，于IO(TC沸水浴中搅拌5分钟，得到糊化玉米淀粉。待糊化淀粉液冷却至室温后加 入50mg的木瓜蛋白酶，于室温下搅拌均匀，缓缓加入卯mL乙醇，全部加入后搅拌30分钟， 得到酶-淀粉共沉淀聚体悬浊液。向酶-淀粉共沉淀聚体悬浊液中加入戊二醛进行共价交联， 令最终戊二醛的质量百分比浓度为4.5%,于室温下搅拌12小时。向交联后的酶-淀粉混合体 系中加入100mL磷酸缓冲液(O.IM， pH7.0)， 3000rpm离心3分钟，取沉淀物。用50mL同 样的磷酸缓冲液洗涤离心沉淀物，重复3次以去除戊二醛残留。将沉淀物悬浊分散于20niL 磷酸缓冲液中，并向其中加入lmL质量浓度为5。/。的oc-淀粉酶溶液，于室温下搅拌反应12小 时，再次离心，并用磷酸缓冲液反复洗涤沉淀物。最终将沉淀物分散于磷酸缓冲液中，于4 'C下保存，制得多孔化交联木瓜蛋白酶聚集体。
将所制多孔化交联木瓜蛋白酶聚集体应用于卵清蛋白和牛血清白蛋白水解实验。于35'C 下水解质量分数0.05°/。的卵清蛋白和牛血清白蛋白磷酸缓冲液(O.IM， pH7.0)溶液，加入酶 量与蛋白质量之比为1: 200，水解时间15min。实验证明，多孔化交联酶聚集体催化卵清蛋 白和牛血清白蛋白水解效率分别是游离酶的96%和113%，而未经多孔化处理的传统交联酶聚 集体的催化效率仅为游离酶的9.3%和11.3%。未造孔和淀粉造孔后的交联酶聚集体形貌如图 1电镜图所示。
权利要求
1、一种催化大分子底物反应的多孔化交联酶聚集体，其特征在于它是以蛋白酶和淀粉为原料，按照下述的质量配比制成，蛋白酶∶淀粉＝0.015～0.75∶1；具体制备方法是将含淀粉的pH＝7的缓冲溶液与蛋白酶混合均匀，然后加入有机溶剂或硫酸铵溶液，得到酶-淀粉共沉淀聚体的悬浊液加入戊二醛交联，沉淀物洗涤，加入α-淀粉酶反应，去除淀粉，沉淀物洗涤，再分散于缓冲液中保存。
2、 一种权利要求1所述的催化大分子底物反应的多孔化交联酶聚集体的制备方法，其特征在于包括的步骤1) 糊化淀粉的制备按计量淀粉溶于p1^7的缓冲液中配制成质量百分浓度为1 4%的淀粉液，于80 100'C水浴中搅拌3 10分钟，得到糊化淀粉；2) 酶-淀粉混合液的共沉淀上述糊化淀粉液，加入蛋白酶，于4 30'C搅拌均匀，加入有机溶剂或饱和硫酸铵溶液， 搅袢30分钟，得到酶-淀粉共沉淀聚体的悬浊液；3) 酶-淀粉共沉淀聚体的共价交联向酶-淀粉共沉淀聚体悬浊液中加入戊二醛，令最终戊二醛的质量百分浓度为1 5%， 于4 3(TC搅拌4 16小时；4) 酶解去除淀粉向共价交联后的混合体系中加入缓冲液，pH=7.0，离心取沉淀物，用缓冲液反复洗涤离 心沉淀物，重复3-5次以去除戊二醛残留；将沉淀物分散于缓冲液中，向此混合液中加入质 量浓度为1 10W的a-淀粉酶，于室温下搅拌反应12 24小时，再次离心取沉淀物，用缓冲 液反复洗涤沉淀物，最终将沉淀物分散于缓冲液中，于4'C下保存。
3、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的所述的淀粉是玉米淀粉或木薯淀 粉或马铃薯淀粉或小麦淀粉。
4、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的蛋白酶是胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、 凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶或嗜热菌蛋白酶。
5、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的缓冲液是磷酸缓冲液。
6、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮或 聚乙二醇。
全文摘要
本发明涉及一种催化大分子底物反应的交联酶聚集体及其制备方法。它是以蛋白酶和淀粉为原料，按照下述的质量配比制成，蛋白酶∶淀粉＝0.015～0.75∶1。将含淀粉的pH＝7的缓冲溶液与蛋白酶混合均匀，然后加入有机溶剂或硫酸铵溶液，得到酶-淀粉共沉淀聚体的悬浊液加入戊二醛交联，沉淀物洗涤，加入α-淀粉酶反应，去除淀粉，沉淀物洗涤，再分散于缓冲液中保存。本发明用于水解卵清白蛋白及牛血清白蛋白等大分子底物的实验结果表明在相同条件下，未经多孔化处理的交联酶聚集体的催化效率仅为游离态酶催化效率的9～12％，而多孔化交联酶聚集体的催化效率为游离态酶催化效率的80～100％。本发明可以应用于蛋白酶类、聚糖酶类等的固定化。
文档编号C12N11/00GK101629171SQ20091007016
公开日2010年1月20日 申请日期2009年8月19日 优先权日2009年8月19日
发明者何志敏, 王梦凡, 苏荣欣, 崴 齐 申请人:天津大学