专利名称：拟南芥基因aik1在调控植物生长发育及抗胁迫方面的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种拟南芥基因A/ZO的功能鉴定和应用，尤其涉及该基因在 调控植物生长发育中的应用，同时还涉及该基因在调控植物抗逆境胁迫方面 的应用，以及该基因在培育抗逆境胁迫转基因植物品种方面的应用，属于基 因工程领域。
背景技术：
植物根系作为重要的营养器官，不仅承担着吸收水分和矿质营养的重要 作用，而且是植物感受土壤水分胁迫、盐碱、营养匮缺以及土壤病虫害等环 境胁迫时的重要感受器官，是限制农业生产的重要因素。研究表明，植物激素 脱落酸ABA (abscisicacid)是植物感受环境胁迫时的一种普遍、重要的根源 逆境信号，如植物感受水分胁迫时，根尖(根毛区至根冠)通过合成大量的 ABA，调控根的生长发育，促进根系发达(包括抑制主根的生长、促进根毛 的发育等)，从而促进根系的吸水与溢泌速率，保证根向地上部分的供水量。
植物激素脱落酸ABA被认为是植物体内的最重要的胁迫激素，干旱胁迫 下植物中已有的ABA在几分钟内引起气孔快速的关闭。同时，ABA作为生长 抑制剂，可以抑制核酸和蛋白质的生物合成，抑制种子的发芽和植株的生长。 尽管一定浓度外源ABA作为植物重要的胁迫激素和生长抑制剂，可以抑制生 长(包括种子萌发和根的生长)的生理现象已经发现30多年，但是对于ABA 抑制生长包括抑制根生长的机制了解得并不多。植物根对ABA信号的感受，信号转导的中间成分以及抑制生长发育过程中细胞机制等一直是科学家们期
待解决的重要课题。许多信号转导过程中的关键因子，如Ca2+、 pH、 cADP核 糖、1~1202和MAPK等在ABA抑制种子萌发和调节气孔运动的信号转导中发 挥着重要作用。这些中间分子是否也同样在根及幼苗生长发育中起调控作用， 如何作用；ABA的感知和信号转导中哪些基因发挥了作用，都成为令人感兴 趣的问题。弄清植物生长发育中根及不同组织感受ABA的信号转导机制，不 仅对揭示植物感受各种逆境胁迫的机理提供具有实质性的理论价值，控制植 物的根系发育，而且对农业生产和作物改良具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种拟南芥基因>A//a在ABA调控植物生长发 育方面的应用，以拓展基因A/K^的应用范围。
同时，本发明目的还在于提供一种拟南芥基因调控植物抗胁迫方面 的应用。
进一步的，本发明的目的还在于提供一种拟南芥基因///<7在培育抗逆转 基因植物方面的应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种拟南芥基因vA/K7在调 控植物生长发育中的应用。
所述的基因在Genebank中的编号为At2G18470，该基因的CDS 长度为1902bp，编码633个氨基酸的蛋白。
所述的基因参与逆境胁迫激素ABA调控的植物幼苗及根部生长发 育过程；基因///0编码一种定位于细胞膜的受体类似蛋白激酶，该基因的表 达受ABA的诱导。同时，本发明的技术方案还采用了一种拟南芥基因在调控植物抗胁 迫方面的应用。
所述的基因ZUK"7在Genebank中的编号为At2G18470，该基因的CDS 长度为1902bp，编码633个氨基酸的蛋白。所述的基因A/ZO参与逆境胁迫 激素ABA调控的植物幼苗及根部生长发育过程；从拟南芥资源中心(ABRC， Ohio State University)获得的ZWK7基因T-DNA插入突变体(SALK—026953、 SALK—034666)的幼苗和根的生长比野生型对逆境激素ABA的敏感性降低。
所述的基因A//<7编码一种定位于细胞膜的受体类似蛋白激酶，该基因的 表达受ABA的诱导。
进一步地讲，本发明的技术方案采用了一种拟南芥基因A/KT在培育抗胁 迫转基因植物方面的应用；将A/ZO基因或其中部分片断连接到不同种类载体 上，通过不同的表达载体转化获得抗逆相关的转基因植物。
本发明利用从拟南芥资源中心获得的>A//<7基因T-DNA插入突变体，研 究发现突变体(a/7cU， a/7d-2)幼苗和根的生长对ABA表现明显的敏感性 降低。克隆得到了 基因，超表达该基因可以恢复缺失植物对ABA的敏 感性。通过分子生物学的分析确立了 仅受激素ABA的诱导。
本发明利用细胞生物学技术揭示了 >A//<7在ABA调控植物根的生长发育 中主要通过调控细胞的伸长生长而起作用。克隆得到了该基因/WK:7，通过采 用GUS组织定位和GFP融合蛋白的细胞定位方法，分析A/M基因的细胞和 组织表达特性。
本发明利用膜片钳技术，钙成像技术和转基因技术确立了 AIK1是通过调 控下游信号分子胞内Ca"浓度而参与了 ABA调控的幼苗的根发育。同时利用杂交技术，激光共聚焦，定量PCR等技术也确立了 1~1202在///0参与调控的
幼苗根发育中也具有一定的作用。
本发明利用酵母体外表达载体将A/;a基因蛋白在体外表达和纯化，磷酸
化分析揭示了蛋白的底物磷酸化和自身磷酸化的作用，并且Ca"和ABA都可 以显著增强蛋白的激酶活性。
本发明编号为At2G18470的/A/M (ARA /nsens/'f/Ve K/A7ase7)基因编码一
个类受体蛋白激酶，定位在细胞膜上，在植物对逆境信号ABA的信号转导中 具有重要的作用，参与调控了植物逆境响应的相关生长发育。通过其胞外区 与细胞壁相关联感知或传递外界ABA信号，通过胞内的激酶区调节胞内信使 032+的含量使得植物对逆境激素做出相应的反应。缺失该基因可以提高植物 的抗逆特性，对逆境激素表现出显著的敏感性降低。本发明通过对/WK7基因 的分离和功能分析鉴定，确立了 AIK1在ABA调控根及幼苗的生长发育中的 作用以及在植物抗逆中的作用及其调节机制，为理解ABA调控植物幼苗尤其 是根生长发育机制提供了重要的证据，在农业生产利用此基因可以控制苗的 早期生长，使幼苗的生长更耐受逆境胁迫，为培育转基因作物新品种奠定理 论和生产实践基础。与野生型拟南芥比较，J/《7基因功能缺失突变体幼苗的 发育和根生长对ABA呈现专一的敏感性下降。
图1为缺失突变体a/7c7和超表达/A/ZO基因拟南芥根生长在ABA培养基 上的表型分析；
图2缺失突变体a/7c7-7幼苗在含ABA的培养基上生长17天的幼苗； 图通过调控胞内Ca"而参与了 ABA对植物根的生长发育。其中，图1中(A)半定量PCR分析///<7基因在野生型、a/7c7-"/和 a/7d-2突变体以及超表达(a/7d/A//0)植株中的表达；(B) ABA处理下根的 生长。
图3中，(A)钙离子载体A23187，CaCl2和钙通道抑制剂nifedipine对 拟南芥a/7d-"/和a/7c7-2幼苗根生长发育的影响；(B)处理3天后根的伸长长 度统计结果。
具体实施例方式
实施例1
突变体的筛选，表型和遗传学分析
从拟南芥资源中心(/Ara/)/cfops/s Biological Resource Center)索要 T-DNA插入突变体SALK_026953和SALK—034666，对其进行纯合体鉴定； 利用已筛选的T-DNA插入纯合突变体，分析得到如图1所示转录水平基因在 缺失突变体中已不表达，在ABA处理上根的生长相对野生型明显表现为ABA 的敏感性降低；并且如图2所示幼苗的发育也表现为对ABA的敏感性降低。 表明A/ZO基因在逆境胁迫中调节了幼苗的发育。
实施例2
A/ZO基因的克隆，载体构建，转基因植株的选择 从拟南芥基因组中利用PCR扩增分离得到的的启动子区序列和 CDS序列，克隆得到pCAMBIA1381的GUS报告载体和pEGAD的GFP细
胞定位载体，以及超表达载体；农杆菌介导转化获得转基因阳性植株。
从Genbank查寻整个基因组序列，然后从起始密码子ATG上游到
上一个基因的终止密码子中寻找含TATA box、 CAAT box等序列，大约有
138化p，然后设计引物。根据pCMBIA1381 Vector的多克隆位点，选择EcoRI和Pst I酶切位点设计引物。用野生型拟南芥基因组DNA作为模板，PCR 扩增A/K7的启动子。并同时根据拟南芥A/ZO CDS序列设计特异扩增引物， 并在引物两端加入酶切位点以引入超表达载体pB旧。扩增CDS的全长序列， 酶切后连入pB旧载体。同时利用设计的pEGAD-GFP^/W弓l物PCR扩增 A/K^的CDS，酶切连接入pEGAD载体，构建重组质粒，并由PCR和酶切 鉴定。
将构建好的载体转入农杆菌GV3101，筛选阳性克隆转化用。接种阳性 农杆菌GV3101于10 mL LB培养基(含50 ^g/mL Rif， 50 |iig/mL Kan)中， 28°C 200 rpm振荡培养过夜，按1:50的比例转接至200 mL含有相同抗生素 的LB培养基中扩大培养至OD600为1.2-1.6， 5000 rpm离心15 min，收集 菌体。重悬于渗入缓冲液(0.25XMS、 5% (W/V)蔗糖、0.03% silwet L-77)， 调节OD600至0.8。待拟南芥生长至花蕾期，将准备好的农杆菌放置于一个 与花盆口径大小的小杯里，浸染3s后，用保鲜膜把整个植株罩起来，平放在 一个塑料盘里(注意保湿)。室温暗处放置10 h后，再揭开薄膜放置于光照 培养室培养。 一周后，待有新花蕾长出，可进行重复转化。对得到的种子进 行鉴定。
将携带有构建好的pCMBIA1381和pEGAD重组载体载体的农杆菌转化 野生型拟南芥；携带有构建好的pB旧载体的农杆菌转化鉴定的T-DNA插入
纯合突变体。
载体pB旧和pCMBIA1381带有Hygromycin B抗性基因，用含有 Hygromycin B的MS筛选培养基获得的转基因植物。把F1代转基因植物种 子播种在含有25 mg/L潮霉素(hygromycin B)的MS筛选培养基上，待15 d后把完全发育正常的植株移栽在营养土中，等恢复正常生长，再提取基因组DNA，进行PCR检观U。
载体pEGAD带有Bastar resistance protein基因，具有对除草剂Bastar
抗性。得到F1代种子播种后长至两片真叶时，喷洒35mg/L的Bastar筛选抗
性植株，每隔两天喷洒一次，共喷洒3次。将生长良好的抗性苗移出。筛选
得F2代种子用于分析蛋白定位。将培养基上生长2周大小的苗取出，洗去培
养基，取根部进行荧光观察观察，使用激光共聚焦显微镜(Laser Scanning
confocal microscope, LSCM)，在Green channel (488nm excitation, 510
—550nm emission)观察GFP荧光。
实施例3
^//a基因的表达分析
利用半定量PCR分析基因对不同激素的的反应，揭示仅受ABA的 诱导，而不受其它激素处理的影响。利用得到的转基因植物，通过GUS组织 化学染色表明，AIK1主要分布在植物的根部，花器官和幼叶，这与该基因在 ABA处理下控制根的生长发育相一致。GFP融合蛋白定位分析表示该基因编 码的蛋白定位在细胞膜上，并通过细胞壁的降解试验揭示与细胞壁存在某种 关联性。这也表明AIK1在逆境信号的早期转导中发挥作用。
实施例4
AIK1蛋白激酶功能的分析
利用实验室已有的酵母表达体系构建体外表达载体，外源诱导蛋白表达， 纯化蛋白。检测蛋白激酶活性，检测结果表明AIM蛋白具有子生磷酸化和底 物磷酸化的功能，并在体外用ABA和Ca"处理后激酶活性可明显增强。进一 步说明AIK1应在逆境激素ABA的信号转导中发挥作用，并与第二信使钙离 子存在密切的关系。实施例5
基因调控根生长发育的机理分析
利用细胞学方法分析揭示/A/K7对幼苗根相对ABA发育的调控主要是通
过调节了根细胞的伸长生长。利用激光共聚焦显微成像技术，钙成像技术分
析ABA处理下根细胞内1^02和Ca^的动态变化；利用膜片钳技术监控ABA 处理后根细胞膜上Ca"离子通道的活性变化，本发明又利用钙离子载体和钙 通道抑制剂对根生长作表型分析(如图3)，最终结果揭示对激素ABA 的反应是通过调节胞内钙浓度的改变影响了细胞的长度从而调节了根对逆境 的响应。
权利要求
1、拟南芥基因AIK1在调控植物生长发育中的应用。
2、 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的基因基因A/fO在Genebank中的编号为At2G18470，该基因的CDS长度为1902bp，编码633个氨基酸的蛋白。
3、 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的基因AIK1参与逆 境胁迫激素ABA调控的植物幼苗及根部生长发育过程。
4、 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的基因///<7 G4W J"化附&VeJT/"ose7)编码一种定位于细胞膜的受体类似蛋白激酶，该基因的表 达受ABA的诱导。
5、 一种拟南芥基因A/ZO在调控植物抗胁迫方面的应用。
6、 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的基因A/fO在 Genebank中的编号为At2G18470，该基因的CDS长度为1902bp，编码 633个氨基酸的蛋白。
7、 根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的基因A/za参与逆境胁迫激素ABA调控的植物幼苗及根部生长发育过程。
8、 根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的基因A/^a C45J /^e^"/velir/mwe7)编码一种定位于细胞膜的受体类似蛋白激酶，该基因的表 达受ABA的诱导。
9、 种拟南芥基因A/^a在培育抗胁迫转基因植物方面的应用。
10、 根据权利要求9所述的拟南芥基因/WK7在培育抗逆境胁迫转基因植物方面的应用，其特征在于将4//^基因或其中部分片断连接到不同种类载 体上，通过不同的表达载体转化获得抗逆相关的转基因植物。
全文摘要
本发明涉及一种拟南芥基因AIK1的功能鉴定和应用，尤其涉及该基因在调控植物生长发育中的应用，同时还涉及该基因在调控植物抗逆境胁迫方面的应用，以及该基因在培育抗逆境胁迫转基因植物品种方面的应用。本发明通过对AIK1基因的分离和功能分析鉴定，确立了AIK1在ABA调控根及幼苗的生长发育中的作用以及在植物抗逆中的作用及其调节机制，为理解ABA调控植物幼苗尤其是根生长发育机制提供了重要的证据，在农业生产利用此基因可以控制苗的早期生长，使幼苗的生长更耐受逆境胁迫，为培育转基因作物新品种奠定理论和生产实践基础。与野生型拟南芥比较，AIK1基因功能缺失突变体幼苗的发育和根生长对ABA呈现专一的敏感性下降。
文档编号C12N15/54GK101509006SQ200910064420
公开日2009年8月19日 申请日期2009年3月19日 优先权日2009年3月19日
发明者云 周, 宋纯鹏, 张兆沛, 张国增, 玲 白 申请人:河南大学