玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其在小麦生产中的应用的利记博彩app

专利名称：玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其在小麦生产中的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物基因领域，具体涉及一种玉米(禾本科玉米属，Ze"m"^L.) 中C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpymvate carboxylase, PEPC)基 因及其在小麦生产中的应用。
背景技术：
小麦、水稻等农作物是我国主要的粮食作物，其生产能力及供需状况始终 关系到我国国民经济发展和粮食安全等重大战略问题。从世界范围来看，世界 粮食生产状况始终与各国政治、经济发展状况紧密联系，粮食生产量和储备量 一有下降，国际粮价就大幅攀升，恐慌情绪就大势蔓延，对各国的政治经济形 势造成重大影响；从国内来看，随着我国人口的增长，工业化和城镇化的快速 发展，对粮食的需求将持续加大。同时，由于我国粮食作物种植面积不可能大 幅度恢复增长，因此要保障我国粮食安全，唯一的出路是持续提高单产，这就 要求在小麦、水稻等主要粮食作物的产量性状遗传改良方面获得跨越性的进展。
光合作用是一切绿色植物物质生产的基础，据估计，植物地上部干物质的 90%来自于光合作用。因此，提高作物产量的关键是提高光能利用效率，从而提 高单位面积的产量。而要大幅度提高光能利用率和实现超高产，必须采取合理 株型(外在光合效率)和高光效(内在光合效率)相结合的技术路线。目前小 麦、水稻等农作物单产水平的提高，主要是由于品种产量潜力遗传改良和生产 条件改善的结果，而产量潜力的遗传改良主要是通过形态性状的改良和杂种优 势等途径来实现的，在现有小麦、水稻等农作物品种产量水平已相对较高，且 都已具有良好的形态结构，叶面积指数和收获系数都己接近极限的情况下，再 单纯依靠上述途径巳很难实现产量潜力的跨越式提高。在此背景下，国内外许 多学者把目光纷纷投向光能利用效率的遗传改良研究，希望通过提高光合效率来实现生物学产量的大幅度提高，进而获得产量潜力改良的突破性进展。
根据光合作用途径的不同，植物可分为C3型、C4型和CAM (景天酸)型。 Q和CAM植物是在逆境下经过长期驯化，从C3植物进化而来的。与小麦、水稻、
大豆等C3植物相比，玉米、高粱、甘蔗等C4植物具有C02浓縮机制，光补偿点高，
C02补偿点低，光呼吸弱，特别在高温、干旱等逆境条件下具有明显的光合优势。 由于C4植物具有高光合、高水分、高氮素利用效率以及高生物学产量，因此将 Q途径引入C3植物以提高其光合效率和籽粒产量， 一直是国内外生物学研究领 域的重大科学命题。以前此方面的研究主要途径是同室筛选、细胞融合和远缘 杂交等方法，但一直未获得突破性进展。近年来日趋成熟的转基因技术由于可 以打破物种间的生殖隔离，实现基因在不同物种中的交流，因此已成为解决农 作物重要性状遗传改良瓶颈问题的主要技术途径。
PEPC是C4光合途径中第一个也是最关键的酶，其主要分布在C4植物叶肉细 胞的叶绿体内，形成C02浓缩机制，为维管束鞘细胞进行的C3途径提供C02。 1999 年Maurice S.B. Ku等将玉米j^^基因转入水稻，获得的转基因植株PEPC活性较 未转化对照高110倍，转;^^基因水稻已具备初级的C02浓縮机制，C02补偿点降 低，光呼吸显著减弱，光饱和点、净光合速率及羧化效率明显提高，耐光抑制 和光氧化能力显著增强，产量较未转化对照可提高10%—30%。但是，该项研究 所利用的p印c基因全长接近9kb，目的片段过大，对于小麦、水稻等农作物的规 模化遗传转化研究难度较大。因此，通过筛选不同玉米自交系材料，获得高光 效玉米种质资源作为P印cr基因的供体材料，并从中克隆C4型p卬cr基因的cDNA序
列，可获得优异的C4型/7印C基因供体材料，并可克隆出片段显著减小、适合于小
麦、水稻等农作物规模化遗传转化的目的基因，为C3农作物高光效基因工程研
究提供重要的基因来源。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了一种玉米中编码Q型磷酸烯醇式丙酮 酸羧化酶(PEPC)基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列，还提供了该基因
在C3型农作物小麦生产中的应用。是
玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因克隆、生物信息学分析包括以下过
程
(1)玉米高光效材料筛选。通过光合特性分析、酶活测定等手段，从大量玉 米种质资源中筛选出高光效玉米材料；(2)目的基因克隆与载体构建。从玉米自 交系Z561中提取总RNA，反转录合成cDNA。根据GenBank (登录号X15238) 中公布的序列，设计一对引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的条带 并回收，通过T/A克隆法连接到pMD-19T载体上，形成含目的基因的克隆载体 pMD19-pepc，热激法将克隆载体导入￡力0//感受态细胞01153，并进行目的基因 测序。利用双酶切的方法，将目的基因重组进真核表达载体pCAMBIA3301; (3) 生物信息学分析。针对获得的目的基因序列，用生物信息学软件进行同源性分 析、氨基酸序列进化树分析和功能位点分析；(4)/^^在小麦中的应用。
本发明的玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因是下列核苷酸序列之一
(1) 序列表中的SEQIDNo: l所示的核苷酸序列；
(2) 编码SEQIDNo: 2所示的蛋白质序列的核苷酸序列。 所述的玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，其特征在于所述基因的
引物序列如下，
Pl: 5'-GCAGATCTGCTCCAACCATCTCGCTTCCGTG-3'禾口 P2: 5'-GGCACGTGGCCGCCTAGCCAGTGTTCTGCAT画3'。 所述基因的克隆载体为pMD19-pepc，真核表达载体为p3301-pepc，宿主菌
为E.coli感受态细胞DH5a。
所述玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶具有所述核苷酸序列编码的氨基酸序列。
所述的玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶具有SEQ ID No: 2所示的氨基 酸序列。
所述的玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因在提高小麦高光效基因工程 育种及生产中的应用。
5本发明的积极效果
1. 通过同源克隆法从玉米材料中克隆了 c4型高光效磷酸烯醇式丙酮酸羧化 酶基因，并进行了生物信息学分析，提供了玉米C4型pepc基因的核苷酸序列、 编码的氨基酸序列以及生物学信息。
2. 提高光合效率是小麦等农作物超高产育种的重要技术途径。本项研究通过 将玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的真核表达载体pCAMBIA3301用基因枪 法导入小麦，用分子手段验证外源/^c基因在转基因小麦植株中的整合和表达。 对转基因植株的功能分析(光合特性分析)结果表明，转基因植株的净光合速 率较未转化对照实现了大幅度提高，增幅最大的提高了 1.39倍，为目前国内外 提高C3作物净光合速率幅度最大的一项研究。上述结果表明，本发明所涉及的
玉米C4型高光效;^pc基因可实现小麦等C3作物净光合速率的大幅度提高，将 为小麦等Q农作物高光效转基因育种提供重要的技术与材料支撑，因此具有重 大的现实意义。
3. 获得的高光效转基因小麦种质为揭示C4途径关键酶基因在C3作物中的遗 传与表达规律提供重要的理论支撑，为C3作物高光效转基因育种提供重要的共 性技术基础，因此对于C3作物高光效基因工程研究具有重要的理论意义。


图1玉米C4型pepc基因cDNA的PCR产物电泳结果
图2玉米C4型PEPC蛋白与其它C3、 C4植物PEPC蛋白进化树分析结果
图3玉米Ct型PEPC蛋白功能位点分析结果
图4玉米(34型PEPC蛋白与其它C3、 Q植物PEPC蛋白氨基酸部分序列比
较
图5转基因植株基因的PCR产物电泳分析
图屮1-8， 10-16:部分转基因植株；17:阳性对照(质粒)；18:非转基因对照植株；9: DNA分子量标准。
图6转基因小麦/ e^c基因表达的RT-PCR检测
图中，1-6:转基因植株；Ck:非转基因对照植株。图7转基因To代/ ^c基因Southern杂交检测
图中，1:阳性对照；2:非转基因对照植株；3-8:部分转基因植株。 实施例l :玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的克隆及生物信 息学分析 1.材料与方法 1.1材料
1.1.1植物材料及试剂
本发明所涉及玉米自交系材料由河南省农业科学院粮食作物研究所提供。 实验用RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自天为时代公 司，MLV反转录试剂盒购自Promega公司，LA-TaqDNA聚合酶、pMD-19T克 隆载体、大肠杆菌(菌株DH5a感受态细胞制备试剂盒均为 TaKaRa公司产品，植物表达载体pCOMBIA3301为本实验室保存，限制性内切 酶为MBI公司产品，氨苄青霉素为Amersco公司产品，其余试剂为进口或国产 分析纯。
1.1.2引物设计及合成
根据已报道的玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的cDNA序列 (GenBank登录号X15238)，利用Primer 5.0软件设计一对引物，序列为
Pl: 5'—GCTCCAACCATCTCGCTTCCGTG匪-3'
P2:5'—GCCGCCTAGCCAGTGTTCTGCAT—3'，
所用引物由上海生物工程公司合成。 1.2方法
1.2.1高光效玉米自交系筛选
选择8月份晴朗无云的天气，利用CIRAS-1光合分析系统和叶绿素荧光动 力学分析仪分析玉米种质资源的光合特性，并于室内分析上述种质资源的PEPC 酶活性。
1.2.2总RNA提取及反转录
在晴天中午光照较强时，提取玉米幼嫩叶片总RNA，进行反转录。总RNA
7提取及cDNA合成参照RNA提取试剂盒和MLV反转录试剂盒说明书进行。 1.2.3 PCR产物的克隆与测序 1.2.3.1 PCR反应
以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系如下
ddmO 30.9nl
Buffer 5 jil dNTP(20mM， mix) 10|il
PI 1 pi
P2 1 pi
质粒DNA 1.6 pi
LA-Taq 0.5|il
PCR反应程序采用两步法进行，94"C预变性5min; 94"C变性30s， 62'C复 性30s， 72。C延伸3min， 35个循环;然后72。C延伸10 min。 1.2.3.2克隆载体构建
PCR产物用0.8M琼脂糖凝胶电泳检测，切下3kb的目的条带，用琼脂糖凝 胶DNA回收试剂盒回收目的片段。将回收的目的片段与克隆载体pMD-19进行 连接，连接体系如下
目的片段 4.5pl
p函-19 0.5 pl
Solutionl 5 pl
Total 10 |il
16。C连接过夜。
从-80。C冰箱取出100ri感受态细胞DH5a，解冻，加入连接液，冰 浴30分钟，42。C水浴90秒，取出Eppendorf管后立即置于冰浴中放置2-3分 钟，其间不要摇动离心管。加入37。C的LB(不含抗生素)培养基600W， 37°C 振荡培养1小时。4000rpm离心2分钟，吸除600W培养液，留下培养基 悬浮菌液。菌液与叫1IPTG及401^1 X-gal混合涂含有50mg/Ap的LB平板上，37°C12-16小时。挑选白色菌落于含50mg/L的氨苄青霉素的LB液体培养基， 37'C剧烈振荡下培养过夜。碱裂解法提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒 大小，经PCR和酶切鉴定后，进行测序。 1.2.3.3真核表达载体构建
首先对质粒pMD19-pepc进行Pml I和Bgl II双酶切消化，回收; 印c基因目 的片段，与经过PmlI和Bgin双酶切的质粒pCOMBIA3301连接，转化E.coli DH5a菌株，经卡那霉素抗性筛选，将含有/^pc基因的阳性克隆命名为 p3301-pepc。连接反应程序为
Ligase Buffer 1 |il
pCOMBIA3301 4 pl
目的片段 4pl
T4 DNA ligase1 (il
22。C恒温过夜。
从-80。C冰箱取出100lil感受态细胞DH5a，解冻，加入10pl连接液，冰浴 30分钟，42。C水浴90秒，取出Eppendorf管后立即置于冰浴中放置2-3分钟， 其间不耍摇动离心管。加入37。C的LB(不含抗生素)培养基600^， 37。C振荡培 养1小时。4000rpm离心2分钟，吸除600^1培养液，留下100^1培养基悬浮菌 液。菌液涂于含有50mg/L卡那霉素的LB平板上，37°C、 250rpm小时。挑选 菌落于含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基，37°C、 250rpm振荡下培养过夜。 碱裂解法提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒大小，经PCR和酶切鉴定。 1.2.3.4 p印c基因序列生物信息学分析
将核苷酸测序结果在NCBI服务器上用Blast搜索软件进行同源性基因检 索分析，禾U用互联网在http:〃www.expasy.org/tools/protparam.html上对玉米； e/7c 基因所表达的蛋白质氨基酸序列进行理化性质分析，应用DNAMAN软件对8 个PEPC蛋白氨基酸序列做系统进化分析。 2.结果与分析
2.1玉米C4型p印c基因的克隆
9以玉米总RNA为模板，01igo(dT)15为引物反转录合成总cDNA，以cDNA 为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果，在3kb处有一条亮带(见附图1)， 回收该片段与测序载体连接后进行测序。 2.2玉米C4型p卬c基因cDNA序列测定
核苷酸序列分析表明，该开放阅读框全长2910bp，编码970个氨基酸，如 SEQIDNo: 1和SEQIDNo: 2所示序列。与已登陆的玉米/ e/^基因(X15238) 相比，核苷酸序列中有16处碱基差异，分别为第105、 291、 621、 651、 657、 669、 798、 803、 852、 1168、 1416、 1531、 1543、 1614、 1785和1795位。上述 核苷酸序列的差异导致蛋白质水平上5处氨基酸差异，其中第803， 1168， 1531， 1614和1795位的变化使编码的氨基酸分别由非极性的AIa变为酸性的Asp，非 极性的Phe变为非极性的Leu，非极性的Pro变为极性的Ser，酸性的Asp变为 酸性的Glu，酸性的Asp变为极性的Tyr，其它碱基的变化不影响氨基酸编码。 2.3玉米C4型PEPC蛋白氨基酸序列分析
禾U用互联网在http:〃www.expasy.org/tools/protparam.html上对玉米pe/ c基因 所表达的蛋白质氨基酸序列进行理化性质分析，表明该基因由970个氨基酸组 成，分子量为109.359KD，等电点PI为5.77，分子式C4883H7726N134401444S31，不 稳定系数为45.74。
2.4玉米PEPC蛋白氨基酸序列的系统进化分析
应用DNAMAN软件对8个PEPC蛋白氨基酸序列做系统进化分析。从系统 进化树中可以看出(见附图2)，所克隆的玉米C4型PEPCase与甘蔗和高粱的 C4型遗传距离最近，与谷子C4型次之。谷子C4型先与C3型PEPC聚为一类， 然后再与Q型聚合，表明玉米Q型PEPCase与甘蔗和高粱的(34型同源性高于 与谷子C4型PEPCase的同源性。 2.5玉米C4型PEPC编码蛋白质的功能位点分析
在EMBL服务器上用Iterproscan软件对克隆的玉米C4型PEPC编码蛋白质 的功能位点进行分析，结果表明，玉米PEPC蛋白质氨基酸序列有7个保守区(见 附图3)。其中，15—970氨基酸序列为该蛋白质的功能域部分，177位的组氨酸
10(H)可能与草酰乙酸(OAA)的形成有关，606位的赖氨酸(K)和639位的 组氨酸(H)可能与底物PEP结合有关，731位的缬氨酸(V)和780位的丝氨 酸(S)为C4型PEPCase特性，而在C3和CAM植物中，PEPCase在731位和 780位左右的氨基酸分别是异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)(见附图4), C末端731 位和780位的氨基酸分别是缬氨酸(V)和丝氨酸(S)，表明是该基因是一个 C4型基因。C末端区域包含有高度保守的赖氨酸残基，推测可能是PEP结合位 点。另外，还含有与催化机制有关的高度保守区域。
实施例2玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因导入小麦及其功能分析 1.材料与方法
1.1材料
1.1.1植物材料及试剂
5个小麦品种(系):周麦19、 00H97-54-2-7、郑麦9023、 17-1和新麦18
由河南省农科院小麦研究中心分子育种研究室提供。基因枪试剂及耗材购自美 国伯乐公司，PCR试剂购自大连宝生物公司，其余试剂为进口或国产分析纯。 1.2方法
1.2.1目的基因的转化、筛选与再生
以5个小麦品种(系)的幼胚为受体材料。取开花后12-14d的穗中部、大 小致的未成熟种子，用70%的酒精表面消毒lmin，无菌水冲洗3次后用0.1% 的HgCl2消毒10min，无菌水冲洗3-4次。无菌条件下剥出幼胚(lmm左右)， 于含有2mg/L 2，4-D的MS诱导培养基上暗培养4-5d后，置于高渗培养基上渗 透处理4-6h，基因枪轰击后高渗处理16h，转至愈伤诱导培养基。培养2周后转 至草丁膦抗性筛选再生培养基，连续筛选2代，每代2周，经过筛选的抗性苗 转至生根培养基，生根、壮苗后移入花盆中。 1.2.2转化植株的PCR分析鉴定
CTAB法提取草丁膦抗性植株和对照植株叶片的总DNA，用于转化植株目 的基因的PCR筛选，所用引物为P3: 5 ， - TGGAAGGGCGTGCCTAAGTT-3 ， 和 P4:5， -ATGCCGAGGTGCGTGGTGAT-3'。目的片段大小为668bp，扩增程序为94。C预变性3min; 94"C变性15s， 58'C复性15s， 72。C延伸30s， 34个循环; 72。C延伸10min。
1.2.3转基因小麦pepc基因表达的半定量RT-PCR分析
在晴天晴朗条件下，提取对照和转基因小麦植株幼嫩叶片总RNA,并进行 反转录。分别以其cDNA为模板进行半定量RT-PCR分析。p印c基因引物与PCR 鉴定时相同，Jc"w基因作为内参对照，引物序列为
AP1: 5'-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC國3';
AP2: 5'-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC誦3'。
PCR程序为94。C预变性2min; 94。C变性15s， 55'C复性15s， 72。C延伸15s， 34个循环；72'C延伸10min。 PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。 1.2.4转基因Southern杂交
Southern杂交由北京鼎国生物技术有限公司完成。取部分经PCR检测的转 基因植株和未转化阴性对照DNA用HindIII酶切、电泳、洗胶、转膜、预杂交后， 质粒p3301-pepc用Pml I和Bgl II双酶切，以酶切获得的戸户c基因片段为探针 进行杂交，洗膜后在-7(TC冰箱中放射自显影3-4天。 l丄5 T。代转基因小麦植株气体交换测定
在小麦孕穗期，选择上午11时晴朗无云天气时，利用CIRAS-1便携式光合 测定系统(选自英国PP System公司)测定转基因和对照植株叶片的净光合速率。 每株测定倒一叶、倒二叶和倒三叶，取其平均值。测定时叶室温度为26。C左右， 光照强度lOOO-llOOPmol m-2s-l，环境温度25。C左右。 2.结果与分析
2.1转玉米C4型/;e/7c基因的获得及PCR检测结果
本研究共获得400株草丁膦抗性再生植株，其中周麦19抗性再生植株52 株，00H97-54-2-7抗性再生植株92株，郑麦9023抗性再生植株122株，17-1 抗性再生植株83株，新麦18抗性再生植株51株。提取所有抗性再生植株总 DNA，进行PCR扩增，对照植株均未扩增出目标条带，抗性再生植株中有344 株扩增出668bp的目的条带(见附图5)，其中周麦19有49株，00H97-54-2-7有87株，郑麦9023有86株，17-l有73株，新麦18有47株。周麦19、00H97-54-2-7、 郑麦9023、17-1和新麦18转化植株的PCR阳性频率分别为1.530/。，4.01。/。，2.57。/。， 2.10%和0.76% (见表l)。初步证明目的基因已整合到小麦DNA中。
表i基因枪转化不同基因型小麦的转化频率
基因型轰击幼胚数抗性幼苗数PCR阳性植株数PCR阳性频率
周麦19320052491.53
00H97-54-2216792874.01
郑麦90233348m862.57
17-1347483732.10
新麦18615151470.76
其中PCR阳性频率- (PCR阳性植株数/轰击幼胚总数)X100
2.2转基因小麦p印c基因表达的半定量RT-PCR检测结果
取1株对照和6株转基因小麦植株，提取总RNA，分别进行pepc基因和Actin 基因的RT-PCR扩增。以Actin基因确定PCR的循环数为35吋进入平台期，因此PCR 取34个循环。用J"i77调整模板用量，当扩增产物的亮度基本一致时，可确定模 板浓度一致，以用于pepc基因扩增。扩增结果见图7，对照植株没有扩增出目的 条带，而6株转基因小麦植株均扩增出668bp的目标条带。不同转基因植株表达 pe/^的量存在较大差异，l号和2号的表达量明显高于其它植株，3号表达量较低。 内参4"/"基因的表达在对照和转基因植株间没有差别，表明玉米pe/7c基因在小 麦基肉组中得到了正确转录。见附图6。 2.3转基因小麦Southern杂交验证
Southem杂交结果显示，所选取的经PCR检测的转基因植株均出现1至多条杂 交带，证明玉米高光效p印c基因已经整合进转基因植株中，见附图7。 2.4 TO代转基因小麦植株净光合速率测定结果
在5个受体材料中分别选择生育期和对照一致的转基因T0代PCR阳性植株 测定其净光合速率。由表2可看出，在所检测的28株转基因植株中，除周麦19有 3株光合速率低于对照外，其余25株均高于对照(占89.3%)，光合速率比对照增 力口3%-30%的有6株，占21.4%;增加30°/。-100%的有14株，占50%;增加100%以
13上的有5株，占17.9%。光合速率最高的(20.03)转基因植株较未转化对照(8.37) 提高了139%。光合速率增幅除在OOH97-54-2和郑麦9023间无差异以外，其余不 同材料间差异明显，可能与所检测植株数目较少有关。17-1增幅100%以上的占 62.5%,新麦18增幅在30%-100%之间。此结果证明转入的玉米pepc基因在小麦 中得到了正确表达，并使部分转基因植株净光合速率明显提高。
表2转基因植株净光合速率频率分布
基因型范围低于对照增加3-30%增加30-100%增加 100%以上对照光合速 率
周麦19个体数 频率(％)3 50%3 50%0 00 013. 59
00H97-54-2-个体数012011. 70
7频率(％)033. 3%66. 7%0郑麦9023个体数 频率(％)0 01 33. 3%2 66. 7%0 011.40
17-1个体数(]1258.37
频率(％)012. 5%25%62. 5%新麦18个体数 频率(％)0 00 08 100%0 08. 57
14序列表
<110>河南省农业科学院
<120> —种玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因
<130> PCR产物的克隆与测序
<160> 2
<170> Patentln version 3.4
<210> 1
<211> 2913
<212> DNA
<213> 禾本科玉米属(Zeamo"L.)
<400> 1
吨gcgtcga cc肌ggc3cc cggccccggc gagaagcacc actccatcg3 cgcgcagctc 60
cgtcagctgg tcccaggcaa ggtctccgag gacgacaagc tcatcgagta cgatgcgctg 120
ctcgtcgacc gcttcctcaa catcctccag gacctccacg ggcccagcct tcgcgaattt 180
gtccaggagt gctacgaggt ctcggccgac tacgagggca aaggagacac gacgaagctg 240
ggcgagctcg gcgccaagct cacggggctg gcccccgccg acgccatcct cgtggcgagc 300
tccatcctgc 3catgctc犯cctcgcc犯c ctggccgagg昭gtgc绍at cgcgcaccgc 360
cgccgcaaca gcaagctcaa gaaaggtggg ttcgccgacg agggctccgc caccaccgag 420
tccgacatcg aggagacgct caagcgcctc gtgtccgagg tcggcaagtc ccccgaggag 480
gtgttcgagg cgctcaagaa ccagaccgtc gacctcgtct tcaccgcgca tcccacgcag 540
tccgcccgcc gctcgctcct gcagaaaaac gccaggatcc ggaattgtct gacccagctg 600
aatgccaagg acatcactga cgacgacaag caggagctcg atgaggctct gcagagagag 660
atccaagcag ccttcagaac cgatgaaatc aggagggcac aacccacccc ccaggacgaa 720
atgcgctatg ggatgagcta catccatgag actgtatgga agggcgtgcc taagttcttg 780
cgccgtgtgg atacagccct gaagaatatc ggcatcaatg agcgccttcc ctacaatgtt 840
tctctcattc ggttctcttc ttggatgggt ggtgaccgcg atggaaatcc aagagttacc 900ccggaggtga caagagatgt atgcttgctg gccagaatga tggctgcaaa cttgtacatc 960
gatcagattg aagagctgat gtttgagctc tctatgtggc gctgcaacga tgagcttcgt 1020 gttcgtgccg aagagctcca cagttcgtct ggttccaaag ttaccaagta ttacatagaa 1080
ctctggaagc aaattcctcc aaacgagccc taccgggtga tactaggcca tgtaagggac 1140 aagctgtaca acacacgcga gcgtgctcgc catctgctgg cttctggagt ttctgaaatt 1200
tcagcggaat cgtcatttac cagtatcgaa gagttccttg agccacttga gctgtgctac 1260
aaatcactgt gtgactgcgg cgacaaggcc atcgcggacg ggagcctcct ggacctcctg 1320
cgccaggttt tcacgttcgg gctctccctg gtgaagctgg acatccggca ggagtcggag 1380 cggcac3ccg 3cgtgatcg3 cgccatcacc acgcscctcg gcatcgggtc gtaccgcgag1440 tggtccgagg acaagcggca ggagtggctg ctgtcggagc tgcgaggcaa gcgcccgctg 1500
ctgcccccgg accttcccca gaccgaggag atcgccgacg tcatcggcgc gttccacgtc 1560
ctcgcggagc tcccgcccga cagcttcggc ccctacatca tctccatggc gacggccccc 1620
tcggacgtgc tcgccgtgga gctcctgcag cgcgagtgcg gcgtgcgcca gccgctgccc 1680
gtggtgccgc tgttcgaaag gctggcctac ctgcagtcgg cgcccgcgtc cgtggagcgc 1740
ctcttctcgg tggactggta catggaccgg atcaagggca agcagcaggt catggtcggc 1800
tactccgact ccggcaagga cgccggccgc ctgtccgcgg cgtggcagct gtacagggcg 1860 caggaggaga tggcgcaggt ggccaagcgc tacggcgtca agctcacctt gttccacggc 1920 cgcggaggca ccgtgggcag gggtggcggg cccacgcacc ttgccatcct gtcccagccg 1980 ccggacacca tcaacgggtc catccgtgtg acggtgcagg gcgaggtcat cgagttctgc 2040 ttcggggagg agcacctgtg cttccagact ctgcagcgct tcacggccgc cacgctggag 2100 cacggcatgc acccgccggt ctctcccaag cccgagtggc gcaagctcat ggacgagatg 2160 gcggtcgtgg ccacggagga gtaccgctcc gtcgtcgtca aggaggcgcg cttcgtcgag 2220 tacttcagat cggctacacc ggagaccgag tacgggagga tgaacatcgg cagccggcca 2280 gccaagagga ggcccggcgg cggcatcacg accctgcgcg ccatcccctg gatcttctcg 2340
tggacccaga ccaggttcca cctccccgtg tggctgggag tcggcgccgc attcaagttc 2400
gccatcgaca aggacgtcag gaacttccag gtcctcaaag agatgtacaa cgagtggcca 2460
ttcttcaggg tcaccctgga cctgctggag atggttttcg ccaagggaga ccccggcatt 2520
gccggcttgt atgacgagct gcttgtggcg gaagaactca agccctttgg gaagcagctc 2580
agggacaaat acgtggagac acagcagctt ctcctccaga tcgctgggca caaggatatt 2640cttgaaggcg atccattcct gaagcagggg ctggtgctgc gcaaccccta catoaccacc 2700
ctgaacgtgt tccaggccta cacgctgaag cggataaggg accccaactt caaggtgacg 2760
ccccagccgc cgctgtccaa ggagttcgcc gacgagaaca agcccgccgg actggtcaag 2820
ctg犯cccgg cgagcgagte cccgcccggc ctggaagaca cgctcatcct caccatgaag 2880
ggcatcgccg ccggcatgca gaacactggc tag 2913
<210> 2 <211> 970 <212> PRT
<213> 禾本禾斗玉米属(Zeawfl^L.) <■> 2
Met Ala Ser Thr Lys Ala Pro Gly Pro Gly Glu Lys His His Ser 15 10 15
lie Asp Ala Gin Leu Arg Gin Leu Val Pro Gly Lys Val Ser Glu 20 25 30
Asp Asp Lys Leu lie Glu Tyr Asp Ala Leu Leu Val Asp Arg Phe
35 40 45
Leu Asn lie Leu Gin Asp Leu His Gly Pro Ser Leu Arg Glu Phe
50 55 60
Val Gin Glu Cys Tyr Glu Val Ser Ala Asp Tyr Glu Gly Lys Gly
65 70 75
Asp Thr Thr Lys Leu Gly Glu Leu Gly Ala Lys Leu Thr Gly Leu
80 85 90
Ala Pro Ala Asp Ala lie Leu Val Ala Ser Ser lie Leu His Met
95 100 105
Leu Asn Leu Ala Asn Leu Ala Glu Glu Val Gin lie Ala His Arg
110 115 120
Arg Arg Asn Ser Lys Leu Lys Lys Gly Gly Phe Ala Asp Glu Gly125 130 135
Ser Ala Thr Thr Glu Ser Asp lie Glu Glu Thr Leu Lys Arg Leu
140 145 150
Val Ser Glu Val Gly Lys Ser Pro Glu Glu Val Phe Glu Ala Leu
155 160 165
Lys Asn Gin Thr Val Asp Leu Val Phe Thr Ala His Pro Thr Gin 170 175 180
Ser Ala Arg Arg Ser Leu Leu Gin Lys Asn Ala Arg lie Arg Asn
185 190 195
Cys Leu Thr Gin Leu Asn Ala Lys Asp lie Thr Asp Asp Asp Lys 200 205 210
Gin Glu Leu Asp Glu Ala Leu Gin Arg Glu lie Gin Ala Ala Phe 215 220 225
Arg Thr Asp Glu lie Arg Arg Ala Gin Pro Thr Pro Gin Asp Glu
230 235 240
Met Arg Tyr Gly Met Ser Tyr lie His Glu Thr Val Trp Lys Gly 245 250 255
Val Pro Lys Phe Leu Arg Arg Val Asp Thr Ala Leu Lys Asn lie
260 265 270
Gly lie Asn Glu Arg Leu Pro Tyr Asn Val Ser Leu lie Arg Phe
275 280 285
Ser Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn Pro Arg Val Thr
290 295 300
Pro Glu Val Thr Arg Asp Val Cys Leu Leu Ala Arg Met Met Ala
305 310 315
Ala Asn Leu Tyr lie Asp Gin lie Glu Glu Leu Met Phe Glu Leu
320 325 330
Ser Met Trp Arg Cys Asn Asp Glu Leu Arg Val Arg Ala Glu Glu
335 340 345
18Leu His Ser Ser Ser Gly Ser Lys Val Thr Lys Tyr Tyr lie Glu 350 355 360
Leu Trp Lys Gin lie Pro Pro Asn Glu Pro Tyr Arg Val lie Leu 365 370 375
Gly His Val Arg Asp Lys Leu Tyr Asn Thr Arg Glu Arg Ala Arg 380 385 390
His Leu Leu Ala Ser Gly Val Ser Glu lie Ser Ala Glu Ser Ser 395 400 405
Phe Thr Ser lie Glu Glu Phe Leu Glu Pro Leu Glu Leu Cys Tyr 410 415 420
Lys Ser Leu Cys Asp Cys Gly Asp Lys Ala He Ala Asp Gly Ser 425 430 435
Leu Leu Asp Leu Leu Arg Gin Val Phe Thr Phe Gly Leu Ser Leu 440 445 450
Val Lys Leu Asp lie Arg Gin Glu Ser Glu Arg His Thr Asp Val 455 460 465
lie Asp Ala lie Thr Thr His Leu Gly Ik Gly Ser Tyr Arg Glu 470 475 480
Trp Ser Glu Asp Lys Arg Gin Glu Trp Leu Leu Ser Glu Leu Arg 485 490 495
Gly Lys Arg Pro Leu Leu Pro Pro Asp Leu Pro Gin Thr Glu Glu 500 505 510
He Ala Asp Val lie Gly Ala Phe His Val Leu Ala Glu Leu Pro 515 520 525
Pro Asp Ser Phe Gly Pro Tyr He lie Ser Met Ala Thr Ala Pro 530 535 540
Ser Asp Val Leu Ala Val Glu Leu Leu Gin Arg Glu Cys Gly Val 545 550 555
Arg Gin Pro Leu Pro Val Val Pro Leu Phe Glu Arg Leu Ala Tyr560 565 570
Leu Gin Ser Ala Pro Ala Ser Val Glu Arg Leu Phe Ser Val Asp
575 580 585
Trp Tyr Met Asp Arg lie Lys Gly Lys Gin Gin Val Met Val Gly
590 595 600
Tyr Ser Asp Ser Gly Lys Asp Ala Gly Arg Leu Ser Ala Ala Trp 605 610 615
Gin Leu Tyr Arg Ala Gin Glu Glu Met Ala Gin Val Ala Lys Arg
620 625 630
Tyr Gly Val Lys Leu Thr Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val
635 640 645
Gly Arg Gly Gly Gly Pro Thr His Leu Ala lie Leu Ser Gin Pro
650 655 660
Pro Asp Thr He Asn Gly Ser lie Arg Val Thr Val Gin Gly Glu
665 670 675
Val lie Glu Phe Cys Phe Gly Glu Glu His Leu Cys Phe Gin Thr 680 685 690
Leu Gin Arg Phe Thr Ala Ala Thr Leu Glu His Gly Met His Pro
695 700 705
Pro Val Ser Pro Lys Pro Glu Trp Arg Lys Leu Met Asp Glu Met 710 715 720
Ala Val Val Ala Thr Glu Glu Tyr Arg Ser Val Val Val Lys Glu
725 730 735
Ala Arg Phe Val Glu Tyr Phe Arg Ser Ala Thr Pro Glu Thr Glu
740 745 750
Tyr Gly Arg Met Asn lie Gly Ser Arg Pro Ala Lys Arg Arg Pro
755 760 765
Gly Gly Gly lie Thr Thr Leu Arg Ala He Pro Trp He Phe Ser
770 775 780
20说
Trp Thr Gin Thr Arg Phe His Leu Pro Val Trp Leu Gly Val Gly 785 790 795
Ala Ala Phe Lys Phe Ala lie Asp Lys Asp Val Arg Asn Phe Gin 800 805 810
Val Leu Lys Glu Met Tyr Asn Glu Trp Pro Phe Phe Arg Val Thr 815 820 825
Leu Asp Leu Leu Glu Met Val Phe Ala Lys Gly Asp Pro Gly lie 830 835 840
Ala Gly Leu Tyr Asp Glu Leu Leu Val Ala Glu Glu Leu Lys Pro 845 850 855
Phe Gly Lys Gin Leu Arg Asp Lys Tyr Val Glu Thr Gin Gin Leu 860 865 870
Leu Leu Gin lie Ala Gly His Lys Asp lie Leu Glu Gly Asp Pro 875 880 885
Phe Leu Lys Gin Gly Leu Val Leu Arg Asn Pro Tyr lie Thr Thr 890 895 900
Leu Asn Val Phe Gin Ala Tyr Thr Leu Lys Arg lie Arg Asp Pro 905 910 915
Asn Phe Lys Val Thr Pro Gin Pro Pro Leu Ser Lys Glu Phe Ala 920 925 930
Asp Glu Asn Lys Pro Ala Gly Leu Val Lys Leu Asn Pro Ala Ser 935 940 945
Glu Tyr Pro Pro Gly Leu Glu Asp Thr Leu lie Leu Thr Met Lys 950 955 960
Gly lie Ala Ala Gly Met Gin Asn Thr Gly 965 970
2权利要求
1、一种玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，其特征在于该基因是下列核苷酸序列之一(1)序列表中的SEQ ID No1所示的核苷酸序列；(2)编码SEQ ID No2所示的蛋白质序列的核苷酸序列。
2、 根据权利要求1所述的基因，其特征在于该基因为序列表中的SEQID No: l所示的核苷酸序列。
3、 根据权利要求1所述的玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，其特征在于所述基因的引物序列如下，PI: 5'-GCAGATCTGCTCCAACCATCTCGCTTCCGTG曙3'和 P2: 5'隱GGCACGTGGCCGCCTAGCCAGTGTTCTGCAT-3'。
4、 根据权利要求1所述的玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，其特征 在于所述基因的克隆载体为pMD19-pepc，真核表达载体为p3301-pepc，宿主 菌为E.coli感受态细胞DH5a。
5、 一种玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，其特征在于该羧化酶具有权 利要求1所述核苷酸序列编码的氨基酸序列。
6、 一种权利要求5所述的玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，其特征在于 该羧化酶具有SEQ ID No: 2所示的氨基酸序列。
7、 权利要求1所述的玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因在提高小麦高 光效基因工程育种及生产中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其在小麦生产中的应用。该基因为序列表中的SEQ ID No1所示，基因克隆载体为pMD19-pepc，真核表达载体为p3301-pepc，宿主菌为E.coli感受态细胞DH5α，该羧化酶具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列。本发明通过将玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶导入小麦，对转基因植株的功能分析表明，转基因植株的净光合速率较未转化对照实现了大幅度提高，增幅最大的提高了1.39倍，为目前提高C₃作物净光合速率幅度最大的一项研究。上述结果表明，本发明所涉及的玉米C₄型高光效pepc基因可实现小麦等C₃作物净光合速率的大幅度提高，将为小麦等C₃农作物高光效转基因育种提供重要的技术与材料支撑。
文档编号C12N15/60GK101492689SQ20091006432
公开日2009年7月29日 申请日期2009年3月4日 优先权日2009年3月4日
发明者磊 张, 艳 李, 琳 胡, 许为钢 申请人:河南省农业科学院